Glicozidele feniletanoide de Cistanche Tubulosa induc apoptoza în celulele de carcinom hepatocelular H22 atât prin căile de semnalizare extrinsecă, cât și intrinsecă

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Jinyu Li, Adila Aipire, Yi Yang, Lijie Xia, Xinhui Wang, Yijie Li și Jinyao Li

Abstract

Fundal:Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight este un medicament tradițional chinezesc care parazitează rădăcinile plantei Tamarix și a fost folosit pentru a trata impotența masculină, sterilitatea, slăbiciunea corpului și ca tonic. Cu toate acestea, efectul său antitumoral asupra carcinomului hepatocelular este încă evaziv. Aici, am investigat efectul antitumoral alC. tubulosa glicozide feniletanoide(CTPG) asupra celulelor de carcinom hepatocelular H22 atât in vitro, cât și in vivo și mecanismele acestuia. Metode: Morfologia, viabilitatea, apoptoza, ciclul celular și potențialul membranei mitocondriale (Δψm) ale celulelor H22 au fost analizate prin microscopie inversată, test MTT și, respectiv, citometrie în flux. Expresia și activarea proteinelor în calea apoptozei au fost detectate prin Western blot. Efectul antitumoral in vivo a fost evaluat într-un model de șoarece tumoral stabilit folosind șoareci masculi Kunming. Rezultate: Tratamentul CTPG a suprimat în mod semnificativ creșterea celulelor H22 într-o manieră dependentă de doză și timp, ceea ce a fost corelat cu creșterea apoptozei și oprirea ciclului celular la fazele G0/G1 și G2/M. Mai mult, s-a observat condensare cromozomială în celulele H22 tratate cu CTPG. Tratamentul CTPG a crescut semnificativ raportul Bax/Bcl-2, a redus Δψm și a îmbunătățit eliberarea citocromului c. Nivelurile de caspază scindată-8 și caspază{-9 atât în ​​căile de semnalizare extrinsecă, cât și intrinsecă au crescut semnificativ, astfel încât caspaza-7 și -3 activată secvenţial pentru a scinda PARP. În cele din urmă, CTPG (Cistanchetubulosaglicozide feniletanoide) a inhibat creșterea celulelor H22 la șoareci și a îmbunătățit rata de supraviețuire a șoarecilor tumorali. Concluzii: Aceste rezultate au sugerat că CTPG a suprimat creșterea celulelor H22 prin căile de apoptoză extrinsecă și intrinsecă.

fundal

Cancerul hepatic s-a clasat pe locul șase pentru incidența cancerului și pe locul patru pentru decesele cauzate de cancer la nivel mondial. Mai mult, s-a clasat pe locul patru pentru incidența cancerului și pe primul loc pentru mortalitatea prin cancer în țările cu indice socio-demografic scăzut [1]. În China, cancerul de ficat este a treia cauză de deces cauzat de cancer în 2015 [2]. Peste 90% dintre cancerele hepatice primare sunt carcinom hepatocelular (HCC) din lume [3]. În prezent, rezecția hepatică este principala opțiune pentru terapia HCC. Cu toate acestea, mai puțin de 30 la sută dintre pacienții cu HCC au îndeplinit criteriile rezecției hepatice curative, iar rata generală de supraviețuire 5-an este încă la 35-50 procente din cauza ratei ridicate de recurență [4, 5] ]. Disponibilitatea opțiunilor de tratament pentru pacienții cu HCC intermediar până la avansat este foarte limitată. Sorafenib, un medicament țintit molecular, a fost aprobat de FDA ca tratament de primă linie pentru HCC avansat. Cu toate acestea, sorafenib prelungește doar aproximativ 3 luni de supraviețuire, iar rata de răspuns este mai mică de 4% [6, 7]. Este urgent să se dezvolte noi medicamente sau strategii împotriva HCC. Medicina tradițională chineză (MTC) singură sau combinată cu alte strategii a fost utilizată pentru a trata HCC și a demonstrat beneficiile clinice, inclusiv prelungirea timpului de supraviețuire, îmbunătățirea calității vieții, reducerea reacțiilor adverse și așa mai departe [8, 9].Cistanche, un fel de MTC, are diverse funcții biologice, cum ar fianti-oxidare, anti-inflamație, anti-îmbătrânire,și neuroprotecție [10, 11]. Glicozidele feniletanoide au fost considerate componentele active majore aleCistanche, care au diverse activități, inclusiv antioxidare, antiinflamație, hepatoprotecție și neuroprotecție [12-15]. Grupul nostru a raportat astaCistanche tubulosa glicozide feniletanoide(CTPG) ar putea induce apoptoza în celulele melanomului B16-F10 și a inhibat creșterea tumorilor la șoareci [16]. În acest studiu, am măsurat efectul antitumoral al CTPG asupra celulelor HCC H22 atât in vitro, cât și in vivo și am investigat mecanismele acestuia. Am descoperit că CTPG a indus apoptoza în celulele H22 prin căi de semnalizare atât extrinseci, cât și intrinseci și a suprimat creșterea tumorilor H22 la șoareci.

Metode

Linie celulara

Celulele de carcinom hepatocelular H22 de șoarece au fost obținute de la Xinjiang Cheie Laboratorul de Resurse Biologice și Inginerie Genetică, Universitatea Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, China) și cultivate în mediu RPMI 1640 (Gibco) suplimentat cu 100 U/ml penicilină și 100 ug/ml streptomicina și 10% ser fetal bovin inactivat termic (Gibco) la 37 de grade într-o atmosferă umidificată de 5% CO2.

Testul MTT

CTPG a fost achiziționat de la Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. (Hetian, Xinjiang, China) iar compușii majori ai CTPG au fost calificați și cuantificați prin cromatografie lichidă de înaltă performanță [16]. Viabilitatea celulară a fost evaluată de 3- (4, 5-dimetiltiazol{-2-il)-2, 5-bromură de difeniltetrazoliu (MTT) (Sigma, St. Louis, MO , SUA) test. Celulele H22 au fost inoculate în 96-plăci de godeuri la o densitate de 2 × 104 celule în 1{00 ul mediu per godeu și cultivate la 37 de grade. După 24 de ore, celulele au fost tratate cu diferite concentrații de CTPG (0, 100, 200, 300 și 400 ug/ml) sau 0,3% DMSO (egal cu cel din 400 ug/ml CTPG) timp de 24, 48 și, respectiv, 72 de ore. . După centrifugare la 1000 rpm timp de 7 min, supernatantul a fost aruncat și 100 ul de soluție MTT (5 mg/ml în PBS) au fost adăugate în fiecare godeu. Plăcile au fost incubate la 37 de grade timp de 4 ore și s-au adăugat 100 ul DMSO pentru a dizolva cristalele de formazan formate. Valorile OD490 au fost detectate de un cititor de microplăci cu 96- godeuri (Bio-Rad Laboratories, CA, SUA). Viabilitatea celulară a fost calculată conform formulei: Viabilitate celulară (procent)=(ODtratat/ODnetratat) × 100 la sută.

Detectarea apoptozei

Celulele H22 au fost tratate cu diferite concentrații de CTPG (0, 100, 200, 300 și 400 ug/ml) sau 0,3% DMSO timp de 24 de ore și apoi colorate cu anexină V FITC/ Kit de detectare a apoptozei cu iodură de propidiu (PI) (YEASEN, China) conform instrucțiunilor producătorului. Probele au fost analizate prin citometrie în flux (BD FACSCalibur, SUA).

Detectarea potențialului membranei mitocondriale

Celulele H22 au fost tratate cu diferite concentrații de CTPG (0, 200 și 400 ug/ml) timp de 24 de ore și apoi colorate cu colorant JC-1 permeabil la membrană (Beyotime, China) timp de 20 de ore. min la 37 de grade. După spălare de două ori cu tampon JC-1, probele au fost resuspendate cu 300 ul de tampon JC-1 și analizate prin citometrie în flux (BD FACSCalibur, SUA).

Analiza ciclului celular

Celulele H22 au fost inoculate în vase de cultură de 60 mm și tratate cu diferite concentrații de CTPG (0, 1{00, 200, 300 și 400 ug/ml) sau 0,3% DMSO pentru 24 h. Toate celulele au fost colectate și spălate de două ori cu PBS. Celulele au fost fixate în 70% etanol rece la gheață la -20 de grade timp de 2 ore și spălate de două ori cu PBS, apoi resuspendate în tampon de colorare cu iodură de propidiu/RNază de 300 ul (BD Biosciences). După 10 minute la temperatura camerei, probele au fost colectate prin citometrie în flux (BD FACSCalibur, SUA) și distribuția ciclului celular a fost analizată cu software-ul ModFit LT 3.0.

Colorare Hoechst 33.258

Modificările morfologice ale nucleelor ​​celulelor H22 au fost analizate prin colorarea Hoechst 33.258 cu colorant de legare a ADN-ului permeabil la membrană. Celulele H22 au fost însămânțate într-o placă de 6-godeuri la concentrația de 1 × 105 celule/godeu într-un mediu de 2 ml. După confluență de 60% ~ 70%, celulele au fost tratate cu CTPG (0, 100, 200, 300 și 400 ug/ml) timp de 24 de ore. Celulele au fost colectate și fixate cu 4% paraformaldehidă rece ca gheață la 4 grade timp de 10 minute. După spălare cu PBS, celulele au fost colorate cu Hoechst 33258 (Beyotime, China) la 4 grade timp de 10 minute. Probele au fost observate cu un microscop cu fluorescență inversată (Nikon Eclipse Ti-E, Japonia).

Western blot

Anticaspaza-3, caspaza anti-clivată-3, Anti-Bcl-2 și anti-Bax au fost achiziționate de la Beyotime Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China). Anticaspază-7, anti-caspază-7, anti-caspază-8, anti-caspază-8, anti-caspază-9, anti -caspaza-clivată-9, anti-PARP, PARP anti-clivată, IgG-HRP anti-șoarece și IgG-HRP anti-iepure au fost achiziționate de la Cell Signaling Technology. Anti- -actina a fost achiziționată de la Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Beijing, China).

Celulele H22 au fost tratate cu diferite concentrații de CTPG (0, 100, 200, 300 și 400 ug/ml) sau 0,3% DMSO timp de 24 de ore. Celulele au fost colectate și lizate cu soluția de liză celulară RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) timp de 30 de minute pe gheață. Probele au fost centrifugate (12,000 g timp de 15 minute la 4 grade) pentru a colecta supernatanții, iar concentrațiile de proteine ​​au fost măsurate prin trusa BCA (Thermo Fisher Scientific, SUA). O cantitate egală de proteină din fiecare probă a fost izolată cu 12% SDS-PAGE și transferată pe membrane PVDF (Biosharp, China). După blocarea cu tampon TBST care conținea 5% lapte degresat, membranele au fost incubate cu anticorpi primari corespunzători și respectiv anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean (HRP). După spălarea cu TBST, proteinele țintă au fost detectate prin trusa de analiză ECL (Beyotime, China).

Animale și declarație de etică

Șoarecii Kunming masculi de 6-8 săptămâni au fost achiziționați de la Centrul de laborator pentru animale, Universitatea Medicală Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, China). Șoarecii au fost ținuți într-o unitate de animale standard, controlată cu temperatură, cu cicluri de lumină a Universității Xinjiang. Toate studiile pe animale au fost efectuate conform ghidurilor Comitetului de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Xinjiang. Protocolul a fost aprobat de Comitetul pentru Etica Experimentelor pe Animale al Laboratorului Cheie de Resurse Biologice și Inginerie Genetică din Xinjiang (BRGE-AE001), Universitatea Xinjiang.

Studiu tumoral la șoarece

Pentru inducerea modelului de șoarece tumoral, șoarecii Kunming masculi au fost injectați subcutanat cu 1 × 106 celule H22 în 1{00 ul PBS în flancul drept. După 3 zile, șoarecii au fost împărțiți aleatoriu în 3 grupuri (7 șoareci/grup). Grupul de control a fost injectat cu 0,1 ml DMSO subcutanat în jurul tumorii. Grupurile CTPG-200 și CTPG- 400 au fost injectate subcutanat cu 200 sau 400 mg/kg CTPG în 0,1 ml DMSO în jurul tumorii. Șoarecii au fost tratați la fiecare 2 zile timp de până la 21 de zile. Dimensiunile tumorii au fost măsurate folosind șublere până la 25 de zile și volumul tumorii a fost calculat conform formulei: volumul tumorii (mm3)=(lungime x lățime2)/2. După 25 de zile, supraviețuirea șoarecilor tumorali a fost monitorizată în fiecare zi până la sfârșitul acestui studiu.

analize statistice

Semnificația statistică a fost calculată prin analiza unidirecțională a varianței între grupurile de tratament și de control. Toate datele au fost exprimate ca medie ± abaterea standard (SD). p < 0.05="" a="" fost="" considerat="" semnificativ="">

Rezultate

CTPG a redus viabilitatea celulelor H22 in vitro

Pentru a explora efectul antitumoral al CTPG asupra HCC, celulele H22 au fost tratate cu diferite concentrații de CTPG (0, 100, 200, 300 și 400 ug/ml) in vitro. După 24 de ore, morfologia celulelor H22 a fost observată folosind un microscop inversat. Am descoperit că morfologia celulelor H22 a fost schimbată dramatic prin tratamentul CTPG. Odată cu creșterea concentrației CTPG, celulele au devenit mici și rotunde, iar numărul de celule a fost, de asemenea, mult redus (Fig. 1a). Testul MTT a fost utilizat pentru a analiza viabilitatea celulelor H22 după tratamentul CTPG timp de 24, 48 și, respectiv, 72 de ore. CTPG a redus semnificativ viabilitatea celulelor H22 într-o manieră dependentă de doză și de timp (Fig. 1b). CTPG la 300 ug/ml a ajuns la cea mai bună rată inhibitorie (Fig. 1c). Valorile IC50 ale CTPG pentru celulele H22 sunt 236 ug/ml la 24 ore și 169,8 ug/ml la 48 ore.

CTPG a indus apoptoza în celulele H22

Pentru a investiga dacă scăderea viabilității celulelor H22 este mediată de inducerea apoptozei, celulele H22 au fost tratate cu diferite concentrații de CTPG (0, 100, 200, 300 și 400 ug/ml) timp de 24 de ore și colorate. cu PI și anexină V. Rezultatele citometriei în flux au arătat că CTPG a indus semnificativ apoptoza celulelor H22 (inclusiv apoptoza timpurie și târzie) într-o manieră dependentă de doză (Fig. 2a). Deși doza mare de CTPG a crescut semnificativ și necroza celulelor H22, necroza joacă un rol minor în inhibarea creșterii celulelor H22 datorită proporției sale mai mici (8,3 la sută) comparativ cu cea a apoptozei (52,6 la sută). În plus, proteinele totale ale celulelor H22 au fost izolate după tratamentul CTPG și expresiile limfomului 2 cu celule B anti-apoptotic (Bcl-2) și proteinei X asociate cu BCL-2-pro-apoptotic (Bax) au fost detectate de către Western blot. Datele de scanare în tonuri de gri au arătat că nivelurile de expresie ale Bax și Bcl-2 au fost crescute și, respectiv, scăzute. Raportul Bax/Bcl-2 a fost crescut semnificativ (Fig. 2b). Aceste rezultate sugerează că CTPG induce apoptoza în celulele H22.

CTPG induce condensarea cromozomială și oprirea ciclului celular în celulele H22

S-a raportat că deteriorarea ADN-ului și oprirea ciclului celular induse de medicamente pot inhiba creșterea celulelor tumorale și pot provoca apoptoza în celulele tumorale [17, 18]. Pentru a detecta morfologia nucleelor ​​din celulele H22 după tratamentul CTPG timp de 24 de ore, celulele H22 au fost colorate cu Hoechst 33342 și observate folosind microscopie fluorescentă inversată. Celulele tratate cu CTPG au prezentat o creștere dependentă de doză a cromatinei puternic condensate a nucleelor, în timp ce celulele netratate au prezentat nuclee colorate omogen (Fig. 3a). Distribuția ciclului celular în celulele H22 a fost analizată în continuare prin colorare PI după tratamentul CTPG timp de 24 de ore. După cum se arată în Fig. 3b, tratamentul cu CTPG a crescut semnificativ proporția de celule în faza G{0/G{{1- și G2/M și a scăzut semnificativ proporția de celule în faza S, sugerând că CTPG a indus G. Oprirea fazei 0/G1 și G2/M în celulele H22. Doza mare de CTPG a crescut semnificativ, de asemenea, proporția de celule sub G1.

CTPG a scăzut potențialul membranei mitocondriale și a crescut eliberarea citocromului c

Calea dependentă de mitocondrii joacă un rol important în inducerea apoptozei [19, 20]. Modificările potențialului membranei mitocondriale (Δψm) pot fi monitorizate prin colorarea JC-1 datorită agregatului JC{-1 (fluorescență roșie) se poate dezintegra în monomer (fluorescență verde) cu reducerea Δψm [21]. După tratamentul CTPG timp de 24 de ore, celulele H22 au fost colorate cu colorant JC- 1. Datele de citometrie în flux au arătat că fluorescența roșie în canalul FL-2 și fluorescența verde în canalul FL{-1 au fost semnificativ scăzute și crescute la tratamentul CTPG. Proporția de celule PE-FITC plus a fost crescută semnificativ (Fig. 4a), sugerând că CTPG a redus Δψm în celulele H22. Acest lucru este în concordanță cu raportul crescut Bax/Bcl-2. În consecință, am observat că eliberarea citocromului c a fost semnificativ crescută la tratamentul cu CTPG (Fig. 4b). Aceste rezultate au indicat că CTPG ar putea induce parțial apoptoza în celulele H22 printr-o cale dependentă de mitocondrii (intrinsecă).

CTPG a activat calea caspazei și a prevenit repararea ADN-ului

În continuare, a fost analizată activarea caspazei indusă de CTPG atât prin căile de semnalizare extrinseci cât și intrinseci. După tratamentul CTPG timp de 24 de ore, proteinele totale au fost izolate din celulele H22 și nivelurile de pro- și clivate-caspaze au fost detectate prin Western blot. În comparație cu controlul netratat sau cu DMSO, tratamentul CTPG a crescut semnificativ nu numai nivelul de caspază scindată-8 (cale extrinsecă), ci și nivelul de caspază scindată -9 (calea intrinsecă) (Fig. 5). Secvenţial, caspaza activată-8 şi -9 au scindat pro-caspaza-3 şi -7 din aval care au fost observate în Fig. 5. Caspaza activată-3 a scindat ADN-ul enzimă de reparare a poli (ADP-riboză) polimerazei (PARP) pentru a preveni repararea ADN-ului și pentru a acumula deteriorarea ADN-ului, așa cum se observă în Fig. 3a.

Aceste rezultate au indicat că CTPG a indus apoptoza în celulele H22 atât prin căile de semnalizare extrinseci cât și intrinseci.

CTPG suprimă creșterea HCC H22 in vivo și îmbunătățește rata de supraviețuire a șoarecilor tumorali

În cele din urmă, efectul antitumoral al CTPG asupra HCC a fost evaluat într-un model de șoarece tumoral, care a fost stabilit prin injectarea subcutanată a celulelor H22. După 3 zile de injectare cu celule H22, șoarecii tumorali au fost tratați cu CTPG de 8 ori. Greutatea corporală a șoarecilor și dimensiunile tumorii au fost monitorizate la momentele de timp indicate. După cum se arată în Fig. 6a, greutatea corporală a șoarecilor din fiecare grup nu are nicio diferență semnificativă, ceea ce sugerează că dozele selectate de CTPG nu au efecte secundare evidente. Interesant este că creșterea tumorii la șoarecii tratați atât cu 200 mg/kg, cât și cu 400 mg/kg de CTPG a fost inhibată semnificativ (Fig. 6b). Mai mult, cele două doze de tratament CTPG au îmbunătățit foarte mult supraviețuirea șoarecilor tumorali (3/7, 3/7) în comparație cu grupul de control (0/7) la sfârșitul experimentului (Fig. 6b). De asemenea, am constatat că CTPG a îmbunătățit semnificativ proliferarea splenocitelor izolate de la șoarecii Kunming masculi într-o manieră dependentă de doză (Fig. 6c), sugerând că CTPG are un efect imunostimulator.

Discuţie

TCM a fost folosită pentru a trata diferite boli, inclusiv cancere de o lungă istorie. S-a raportat că TCM poate induce apoptoza în diferite tipuri de celule tumorale prin căi de semnalizare atât extrinseci (mediate de receptorul morții) cât și intrinseci (dependente de mitocondrii) pentru a exercita efecte antitumorale [22-25]. Cele două căi pot activa caspaza-8 și respectiv -9 [24, 26]. Aici, am descoperit că CTPG a suprimat semnificativ creșterea celulelor H22 prin inducerea apoptozei și oprirea ciclului celular. Nivelurile de caspază scindată-8 și -9 au fost reglate semnificativ în creștere prin tratamentul CTPG, ceea ce sugerează că atât căile de semnalizare extrinseci, cât și cele intrinseci au fost implicate în inducerea apoptozei. Studiul nostru anterior a arătat că CTPG a indus apoptoza în celulele melanomului B16-F10 prin calea dependentă de mitocondrii care a crescut nivelul de caspază scindată-9, dar nu și caspaza-8 [16]. CTPG ar putea activa căi de semnalizare distincte în diferite tipuri de celule tumorale.

Integritatea membranei mitocondriale este strâns reglementată de membrii familiei de proteine ​​BCL-2, inclusiv Bax și Bcl-2 [27, 28]. Raportul dintre Bax și Bcl-2 joacă un rol critic în calea de apoptoză dependentă de mitocondrii [29]. În celulele H22 tratate prin CTPG, raportul Bax/Bcl-2 a fost reglat în mod semnificativ, ceea ce ar putea cauza reducerea Δψm și eliberarea citocromului c observate în acest studiu. În consecință, pro-caspaza-9 a fost scindată și activată. În cele din urmă, inițiatorii caspazei active-8 și -9 au activat călăul caspazei-3 pentru a scinda PARP pentru a preveni repararea ADN-ului. Luate împreună, aceste rezultate au sugerat că CTPG a indus apoptoza în celulele H22 atât prin căile de semnalizare extrinseci cât și intrinseci.

În modelul de șoarece tumoral, CTPG a suprimat în mod semnificativ creșterea HCC H22 și a îmbunătățit foarte mult supraviețuirea șoarecilor tumorali. Interesant, CTPG a promovat în funcție de doză proliferarea splenocitelor de la șoarecii Kunming, ceea ce este în concordanță cu studiul nostru anterior [16].

Aceste rezultate au sugerat că CTPG ar putea suprima creșterea H22 HCC la șoareci atât prin efectul antitumoral direct, cât și prin îmbunătățirea imunității indirecte.

Concluzii

CTPG a suprimat creșterea celulelor H22 atât in vitro, cât și in vivo și a indus apoptoza în celulele H22 atât prin căi de semnalizare extrinseci, cât și intrinseci. Aceste date au indicat că CTPG ar putea fi un potențial candidat pentru tratamentul HCC.