PARTEA 1 Acteozidul suprimă osteoclastogeneza mediată de RANKL prin inhibarea inducției C-Fos și a căii NF-KB și atenuând producția de ROS
Mar 07, 2022
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook2, Jeong-Chae Lee2,3*
1 Institutul de Cercetare de Medicină Clinică al Universității Naționale Chonbuk, Institutul de Cercetare Biomedicală al Spitalului Universitar Național Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Coreea de Sud, 2 Departamentul de Ortodonție, Institutul de Bioștiințe Orale și Școala de Stomatologie, Universitatea Națională Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Sud Coreea, 3 Departamentul de Științe ale Materialelor Bioactive, Centrul de Cercetare al Materialelor Bioactive, Universitatea Națională Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Coreea de Sud
Abstract
Numeroase studii au raportat că citokinele inflamatorii sunt mediatori importanți pentru osteoclastogeneză, provocând astfel resorbție osoasă excesivă și osteoporoză.Acteozid, principalul compus activ alRehmannia glutinoza, care este folosit pe scară largă în medicina tradițională orientală, are potențiale antiinflamatorii și antioxidante. În acest studiu, am constatat căacteozida inhibat semnificativ diferențierea și formarea osteoclastelor din macrofagele măduvei osoase (BMM) și macrofagele RAW264.7 stimulate de activatorul receptor al ligandului factorului nuclear kappaB (NF-kB) (RANKL). Pretratamentul cu acteozid a prevenit, de asemenea, resorbția osoasă de către osteoclastele mature într-o manieră dependentă de doză.Acteozid(10 mM) a atenuat activarea stimulată de RANKL a kinazei p38, kinazelor reglate de semnal extracelular și kinazei N-terminale c-Jun și, de asemenea, a suprimat activarea NF-kB prin inhibarea fosforilării subunității p65 și a inhibitorului kBa. În plus, creșterile mediate de RANKL ale expresiei c-Fos și factorului nuclear al celulelor T activate, citoplasmatic 1 (NFATc1) și în producția de factor de necroză tumorală-a, interleukina (IL)-1b și IL-6 au fost aparent inhibate de pretratamentul cu actozid. Mai departe, oralacteozida redus pierderea osoasă indusă de ovariectomie și producția de citokine inflamatorii pentru a controla nivelurile. Datele noastre sugerează căacteozidinhibă diferențierea și maturarea osteoclastelor de la precursorii osteoclastici prin suprimarea activării induse de RANKL a protein kinazelor activate de mitogen și a factorilor de transcripție cum ar fi NF-kB, c-Fos și NFATc1. Colectiv, aceste rezultate sugerează căacteozidpoate acţiona ca un agent anti-resorbtiv pentru a reduce pierderea osoasă prin blocarea activării osteoclastelor.
Pentru mai multe informații, vă rugăm contactați:emily.li@wecistanche.com
Introducere
Osul este remodelat constant prin activitatea echilibrată a osteoclastelor și osteoblastelor [1]. Osteoclastele apar din celulele precursoare hematopoietice ale liniei monocite/macrofage, în timp ce osteoblastele sunt din linia mezenchimală [2]. Activarea anormalosteoclastelor sau osteoblastogeneza redusă pot perturba homeostazia osoasă, provocând în cele din urmă boli precum osteoporoza, artrita și cancerul osos [3,4]. Osteoporoza este o boală osoasă comună care duce la un risc crescut de fractură. Cea mai comună formă de osteoporoză este cauzată de deficitul de estrogen la femeile aflate la menopauză. Medicamentele precum corticosteroizii și antiepilepticele pot provoca, de asemenea, un dezechilibru între resorbția și formarea osoasă, ceea ce poate duce la osteoporoză [5]. Pentru tratarea osteoporozei au fost utilizați mulți inhibitori anti-resorbție, inclusiv bifosfonați, calcitonină, estrogen și modulatori selectivi ai receptorilor de estrogeni. Acești inhibitori mențin masa osoasă prin inhibarea funcției osteoclastelor [6]. Terapia de substituție cu estrogeni este cel mai popular tratament pentru prevenirea și tratarea osteoporozei în postmenopauză. Cu toate acestea, terapia de substituție cu estrogen pe termen lung poate crește riscul de cancer endometrial și de sân. Prin urmare, mulți investigatori și-au concentrat eforturile pe dezvoltarea unui nou agent anti-resorbție care nu are efecte secundare [7-10]. Deoarece osteoclastele funcționează în resorbția osoasă, inhibarea specifică a osteoclastelor a fost considerată ținta principală în numeroase studii. Osteoclastele sunt celule gigantice multinucleate formate din progenitori mononucleari ai familiei monocite/macrofage prin proliferarea, diferențierea și fuziunea secvenţială a celulelor precursoare hematopoietice [11]. Factorul de stimulare a coloniilor de macrofage (M-CSF) și activatorul receptor al ligandului factorului nuclear (NF)-kB (RANK) (RANKL) sunt factori esențiali pentru diferențierea osteoclastelor[12]. În plus, mai multe citokine inflamatorii, cum ar fi factorul de necroză tumorală (TNF) și interleukina (IL)-1b, contribuie la osteoclastogeneză prin modularea inducerii RANKL, osteoprotegerinei și M-CSF [7,13]. Legarea RANKL la receptorul RANK de la suprafața celulară are ca rezultat RANKL/RANK/TNFR
complexe de factori asociați (TRAF) care activează secvenţial NFkB și protein kinazele activate de mitogen (MAPK), inclusiv kinaza N-terminală cJun (JNK), kinaza p38 și kinaza legată de semnal extracelular (ERK) [14]. Această activare joacă un rol cheie în mediarea diferențierii, activării și supraviețuirii osteoclastelor. RANKL activează, de asemenea, expresia factorilor de transcripție, cum ar fi factorul nuclear al celulelor T activate, citoplasmaticul 1 (NFATc1) și-Fos, care sunt esențiale pentru dezvoltarea osteoclastelor. 7,9]. Prin urmare, semnalizarea RANKL este considerată ținta principală a agenților anti-resorbție care suprimă activarea osteoclastelor și sunt lipsite de os.Acteozideste principalul compus activ al Rehmannia glutinosa, care este utilizat pe scară largă în medicina tradițională orientală [15,16].Acteozideste un antioxidant puternic și are activități anti-hepatotoxice, antiinflamatorii și anti-nociceptive [17–20]. Am constatat anterior căacteozidscade activitatea tirozinazei și biosinteza melaninei prin reglarea semnalizării ERK [21], protejează împotriva leziunilor gingivale mediate de speciile reactive de oxigen (ROS) [22] și suprimă afectarea celulară mediată de micotoxine [23]. Aceste efecte sunt strâns legate deacteozidcapacitatea lui de a elimina ROS și de a regla semnalizarea mediată de MAPK. În special, ROS sunt sugerate pentru a media căile de semnalizare induse de RANKL și evenimentele celulare în osteoclaste. Pretratamentul cu antioxidanți a inhibat activarea indusă de RANKL a NF-kB, ERK și IkBa, suprimând astfel osteoclastogeneza [24]. Aceste descoperiri au sugerat cu tărie că, pe lângă activitatea antiinflamatoare, și activitatea antioxidantă este crucială pentru un agent anti-resorbție, astfelacteozidpoate suprima osteoclastogeneza indusă de RANKL. În studiul de față, am explorat dacăacteozidare un efect terapeutic asupra pierderii osoase. Am examinat efecteleacteozidasupra diferențierii osteoclastelor și resorbției osoase și a mecanismelor celulare aferente utilizând sisteme experimentale in vitro și in vivo.
Materiale și metode
Declarație de etică
Practicile de îngrijire și utilizare a animalelor au fost aprobate de Comitetul pentru etică a Universității Naționale din Chonbuk în îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (permis nr. CBU 2010-0007). Toate experimentele din acest studiu au fost efectuate conform ghidurilor Comitetului de îngrijire și utilizare a animalelor din cadrul Universității.
Șoareci, produse chimice și produse de laborator
Femele de șoareci ICR în vârstă de patru săptămâni au fost achiziționate de la OrientBio Inc. (Seul, Coreea) și găzduite la 2261uC și 5565 la sută umiditate pe un ciclu de 12 ore lumină/întuneric, cu acces liber la hrană și apă. Acteozidul (3,4-dihidroxi-b-fenetil-Oa-ramnopiranoză sil-(1R3){-4-O-cafeoil-bD-glucopiranozid; C29H36O15) (Fig. S1) a fost izolat din frunzele de Rehmannia glutinoza. Acteozidul a fost dizolvat în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) înainte de utilizare. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL{-6 și M-CSF au fost achiziționate de la sistemele de cercetare și dezvoltare (Minneapolis, MN, SUA). Anticorpii specifici pentru c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa și b-actina au fost obținuți de la Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, SUA) ). Anticorpii pentru p-p38 și p38 au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SUA). Seturile EIA CalciumAssay și Osteocalcin (OC) au fost achiziționate de la BioAssay Systems (Hayward, CA, SUA) și, respectiv, Biomedical Technologies (Stoughton, MA, SUA), pentru a determina parametrii biochimici ai serului. Kitul de testare pentru fosfatază acidă rezistentă la tartrat de șoarece (TRAP) (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, SUA) a fost de asemenea utilizat pentru a măsura nivelul seric de TRAP5b. Dacă nu se specifică altfel, substanțe chimice suplimentare au fost obținute de la Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, SUA), iar articolele de laborator au fost de la SPL Life Sciences (Pochun, Coreea de Sud).
Culturi celulare
Celulele de măduvă osoasă au fost obținute din tibie și femure ale șoarecilor femele ICR în vârstă de 6 săptămâni conform metodelor descrise anterior [25]. Suspensia de măduvă osoasă a fost incubată într-un vas de cultură de a100-mm în prezența a 50 ng/ml M-CSF. După 3 zile, celulele aderente au fost folosite ca macrofage de măduvă osoasă (BMM) pentru a induce diferențierea osteoclastică. Unele celule de măduvă osoasă au fost, de asemenea, incubate timp de 48 de ore fără M-CSF, iar celulele aderente au fost cultivate într-un mediu de diferențiere a osteoblastelor, așa cum este descris în altă parte [25]. Celulele macrofage RAW264.7 au fost cultivate în mediu Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS), 2 mM L glutamina și antibiotice. Aceste celule au fost folosite ca o linie celulară omoloage pentru BMM-uri pentru a explora efectul actozidei asupra osteoclastogenezei.
Diferențierea osteoclastică și colorarea TRAP
BMM-urile au fost pretratate cu diferite concentrații (0-50 mM) de actozidă timp de 2 ore înainte de stimularea cu 100 ng/ml RANKL. Mediul de cultură a fost înlocuit cu mediu proaspăt în zilele 2 și 5. După 7 zile de incubare, culturile au fost fixate în paraformaldehidă tamponată cu PBS 4% și colorate cu TRAP folosind un kit sigma Aldrich conform instrucțiunilor producătorului. Celulele pozitive pentru TRAP au fost numărate folosind microscopie optică, iar celulele care conțin 3 sau mai mulți nuclei au fost considerate a fi osteoclaste. Celulele RAW 264,7 au fost, de asemenea, expuse la 100 ng/ml RANKL după pretratament cu acteozid timp de 2 ore și după 7 zile de incubare, celulele au fost prelucrate pentru colorarea TRAP.
Măsurarea viabilității celulare
Viabilitatea celulară a fost determinată folosind un reactiv de sare de tetrazoliu solubilă în apă (WST)-8. Pe scurt, celulele BMM sau RAW264.7 cultivate într-un mediu de creștere care conține 10% FBS și antibiotice au fost tratate cu 10 mM actozid sau compuși fenolici cum ar fi quercetină, luteolină, apigenină sau epigalocatechin-3-galat (EGCG). Reactivul WST-8 a fost adăugat în culturi după 48 de ore de incubare. După incubare pentru încă 4 ore, absorbanța specifică WST{10}a fost măsurată la 450 nm folosind un cititor de microplăci (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, SUA).
Test de resorbție osoasă
BMM-urile (16105 celule/ml) au fost suspendate în a-MEM care conține 50 ng/ml M-CSF și 100 ng/ml RANKL, apoi s-au împărțit pe o placă cu godeu acoperită cu nanocristale de fosfat de calciu (OAAS{{6} }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Coreea de Sud) la o densitate de 26104 celule/cm2 cu și fără acteozidă. După incubare timp de 7 zile, celulele au fost îndepărtate din plăci cu hipoclorit de sodiu 5% și formarea gropilor a fost observată la microscop optic. Aria resorbită a fost, de asemenea, măsurată cu un analizor de imagine și exprimată ca procent din valoarea de control.
Analiza Western Blot
Lizatele întregi de proteine au fost preparate într-un tampon de liză așa cum este descris în altă parte [26]. Proteinele citosolice și nucleare au fost preparate așa cum s-a descris anterior [25]. Cantități egale de extract de proteină au fost separate cu 12-15% SDS-PAGE și șterse pe membrane de difluorură de polivinil. Petele au fost testate cu anticorpi primari peste noapte la 4 uC înainte de incubare cu anticorp secundar în tampon de blocare timp de 1 oră. Petele au fost dezvoltate cu chemiluminiscență îmbunătățită (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, Marea Britanie) și expuse la film cu raze X (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, SUA).
Testul de activitate MAPK
Celulele au fost pretratate cu acteozidă timp de 2 ore și apoi stimulate cu RANKL pentru încă -30 min. Activitățile MAPK au fost determinate utilizând truse de testare imunometrică, cum ar fi kitul de testare p-p38kinase (Assay Designs, Inc., MI, SUA), kitul de testare enzimatică p-ERK (Assay Designs) și kitul ELISA sandwich p-SAPK/JNK ( Tehnologia de semnalizare celulară, MA, SUA). Toate procedurile au urmat instrucțiunile producătorului, iar absorbanța a fost măsurată cu un cititor de microplăci.
Analiza de schimbare a mobilității electroforetice (EMSA)
Reacțiile de legare ADN-proteină au fost efectuate timp de 30 min la temperatura camerei, cu 10–15 mg proteină în 20 ml tampon care conține 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poli (dI-dC), 5% glicerol ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCI, 30,000 CPM de oligonucleotide marcate cu [a{-32P] dCTP și fragmentul Klenow a ADN polimerazei. Probele au fost separate pe geluri de poliacrilamidă de 6 procente, care au fost uscate și expuse la film cu raze X (Eastman Kodak Co.) timp de 12-24 ore la 270uC. Secvențele de primer de oligonucleotide specifice pentru NF-au fost 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 și 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30} }}.
Testul Luciferazei NF-kB
Macrofagele RAW264.7 din plăcile de 24-godeuri au fost transfectate cu0.8 mg vector reporter kB-luciferază folosind 2 ml de Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. La 24 de ore după transfecție, celulele au fost stimulate cu RANKL în prezența și absențaacteozidtimp de 24 h. Celulele au fost resuspendate în 100 ml tampon de liză reporter (Promega, Madison, WI, SUA). Au fost plasate cantități egale de probe de proteine în microplăci 96-godeuri și amestecate cu substrat de luciferază. Luminescența a fost măsurată utilizând un luminometru cu microplăci (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germania). În acest experiment, o peptidă inhibitoare NF-B permeabilă (BIOMOL, Butler Pike, PA, SUA) a fost utilizată ca inhibitor kB pozitiv.
Măsurarea citokinelor
BMM-urile sau celulele RAW264.7 au fost stimulate cu RANKL în prezența actozidei în plăci de cultură 24-godeuri. După 48 de ore de incubare, supernatanții de cultură au fost colectați și evaluați prin ELISA utilizând kituri OptEIATM specifice TNF-a-, IL-1b- și IL-6-, conform instrucțiunilor producătorului.
Reacția în lanț a polimerazei de transcripție inversă în timp real (RT-PCR)
Expresia ARNm a markerilor osteoclastici, cum ar fi c-Fos, NFATc1 și TNF-a, a fost determinată prin RT-PCR în timp real. Pe scurt, ARN-ul total a fost extras din macrofage cu reactiv Trizol conform instrucțiunilor producătorului (Invitrogen). ADNc a fost sintetizat cu 1 mg de ARN total folosind SuperScriptReverse Transcriptase II și primeri (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) a fost utilizat pentru a detecta acumularea de produs PCR în timpul ciclării cu sistemul de detectare a secvenței ABI 7500 (AppliedBiosystems). După denaturare la 95 uC timp de 10 minute, PCR a fost
Măsurarea ROS intracelular
O soluție stoc de 29,79-diclorodihidrofluorescein-diacetat (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Germania) a fost preparată în DMSO și depozitată la 220 uC în întuneric. Pe scurt, BMM-urile (106 celule/ml în plăci de 6-godeuri) au fost cultivate cu 50 ng/MLM-CSF timp de 24 de ore și apoi tratate cu diferite concentrații (0-10 mM) de acteozidă cu 2 ore înainte de stimularea cu 100 ng/mlRANKL. După 1 oră de co-incubare, aceste celule au fost ulterior incubate cu 25 mM DCFH-DA timp de 30 de minute. Fluorescența verde a 29,79-diclorofluoresceinei (DCF) a fost înregistrată la 515 nm (FL 1) folosind un sistem FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, SUA) și 10,000 evenimente au fost numărate pe probă.
Inducerea osteoporozei induse de ovariectomie
Pentru acest studiu au fost utilizați șoareci ICR femele (în vârstă de 6 săptămâni). Șoarecii au primit o operație simulată (Sham, n=10) sau ovariectomizate chirurgical (OVX, n=20) sub anestezie. La o săptămână după operație, șoarecii OVX au fost împărțiți aleatoriu în 2 grupuri de câte 10 șoareci fiecare: OVX bilateral și OVX bilateral suplimentat cu 200 ml PBS care conține 1 mM actozidă oral (grup AC). Oralacteozida fost administrat o dată la 3 zile timp de 8 săptămâni după operație și aceeași cantitate de PBS a fost administrată la grupurile Sham și OVX. După 1 zi de la ultima administrare, șoarecii au fost sacrificați și apoi au fost analizați parametrii biochimici din ser și structura osoasă 3-dimensională.
Determinarea parametrilor biochimici serici
Probele de sânge au fost colectate prin puncție cardiacă și serul a fost colectat prin centrifugare. Probele de ser au fost depozitate la 280uC pentru analiza parametrilor biochimici. Nivelurile serice de IL-1b și IL-6 au fost estimate utilizând kitul ELISA așa cum este descris mai sus, în timp ce activitatea fosfatazei alcaline (ALP) a fost determinată prin utilizarea unui test colorimetric biochimic care măsoară cantitatea de p -nitrofenol produs dintr-un substrat de p-nitrofenol fosfat, așa cum este descris în altă parte [27]. Pentru a estima biomarkerii formării și resorbției osoase, au fost determinate, de asemenea, nivelurile serice de OC, calciu și TRAP5b conform instrucțiunilor producătorilor.
Analize ale structurii osoase și ale parametrilor morfometrici
Femorale șoarecilor (grupurile Sham, OVX și AC) au fost disecate și umplute cu soluție salină fiziologică pentru testare mecanică. Rezistența mecanică a femurului a fost măsurată așa cum este descris în altă parte [28]. Sarcina de fractură a fost înregistrată ca forță de vârf în newtoni în punctul în care diafisa mediană a fracturii femurului drept. În plus, femurul ușor al fiecărui animal a fost analizat histomorfometric folosind un sistem de tomografie pe microcomputer (micro-CT) (SkyScan 1076 microfocus X-ray system, Kontich, Belgia). Pe scurt, oasele din depozitul de formaldehidă de 4% au fost uscate superficial pe un țesut de hârtie înainte de a fi înfășurate în „film de plastic” sau în parafilm, pentru a preveni uscarea în timpul scanării. Fiecare os învelit cu plastic a fost plasat în tuburi de spumă din plastic/polistiren care au fost montate vertical orizontal în camera de probă a scanerului 1076 pentru imagistica micro-CT. Scanarea a fost efectuată utilizând o sursă de tensiune de 100 kV și un curent de sursă de 140 mA cu o rezoluție de 35 mm. Modelele tridimensionale ale oaselor trabeculare ale femurului au fost reconstruite folosind SkyScan CT Analyzer versiunea 1.11. Parametrii structurali cum ar fi densitatea minerală a osului trabecular (DMO, g/cm3), volumul osului procentual (volumul osos (BV)/volumul țesutului (TV), procentul), grosimea (Tb.Th, mm), separarea (Tb.Sp). , mm) și numărul (Tb.N, 1/mm) au fost apoi măsurate.
Analiza de diferențiere și mineralizare osteogenă
Celulele de măduvă osoasă cultivate în plăci de cultură {{{{10}}}}godeurilor au fost tratate cu DAG (dexametazonă 10 nM, acid ascorbic 50 mM și b-glicerofosfat 20 mM) în prezența aceozidei 10 mM. După 2 săptămâni de diferențiere, celulele au fost fixate cu etanol rece cu gheață 70% (vol/vol) timp de 1 oră și colorate cu apă distilată Sin roșu alizarina 0,2% timp de 30 de minute la temperatura camerei. După ce celulele au fost decolorate și uscate la aer, plăcile de cultură celulară au fost evaluate prin microscopie luminoasă folosind un microscop inversat (Nikon TS100, Japonia). Pentru a cuantifica cantitatea de colorant roșu, pata a fost eluată cu 10% clorură de acetil piridiniu prin agitare timp de 20 de minute și absorbanța a fost măsurată la 560 nm. Cantitatea de calciu depusă în straturile celulare a fost de asemenea măsurată utilizând un kit de calciu (Wako Chemical Inc. Osaka, Japonia) conform instrucțiunilor producătorului. În plus, expresia markerilor mARN specifici pentru os, cum ar fi factorul de transcripție legat de runt-2(Runx2), osterix, sialoproteina osoasă (BSP) și OC a fost determinată prin RT-PCR în timp real. Primerii oligonucleotidici ai acestor markeri au fost proiectați cu dimensiuni de produs mai mici de 200 bp folosind PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems) așa cum este descris în altă parte[27].
Analize statistice
Dacă nu se indică altfel, toate datele sunt exprimate ca deviație standard (SD) medie 6 a 3 sau mai multe experimente independente. O ANOVA unidirecțională a fost utilizată pentru mai multe comparații folosind software-ul SPSS versiunea 12.0. O valoare p ,0.05 a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic.
Rezultate
Acteozidul inhibă formarea de osteoclaste de către macrofagezină într-o manieră dependentă de doză
Pentru a verifica efectul actozidei asupra diferențierii BMM în osteoclaste, celulele au fost cultivate cu diferite concentrații (0-20 mM) de actozidă timp de 7 zile în prezența a 50 ng/ml M CSF și 100 ng/ml RANKL . Acteozidul a redus numărul de osteoclaste într-o manieră dependentă de doză. Când celulele au fost pretratate cu 10 mM actozidă timp de 2 ore, numărul de osteoclaste a scăzut cu 43% în comparație cu celulele suplimentate cu M-CSF și RANKL (Fig. 1A). Fig. 1B prezintă diferențierea osteoclastelor mediată de RANKL și inhibarea acesteia prin tratamentul combinat cu acteozid. În concordanță cu acest rezultat, pretratarea cu actozidă a scăzut diferențierea stimulată de RANKL a celulelor RAW264.7 și formarea de osteoclaste (Figurile 1C și D). Când potențialul anti-osteoclastic al actozidei pe BMM a fost comparat cu potențialul anti-osteoclast al mai multor compuși fenolici la aceeași concentrație (10 mM), luteolina a arătat cea mai mare activitate (Fig. 2A). Cu toate acestea, luteolina, quercetina sau apigenina în sine au scăzut viabilitatea celulelor (Fig. 2B). Toți compușii au inhibat diferențierea osteoclastică de către macrofagele RAW264.7 cu următoarele activități relative: luteolina. quercetină=apigenină .EGCG=actozidă (Fig. 2C). Luteolina, quercetina sau apigenina în sine au arătat, de asemenea, viabilitatea scăzută a celulelor (Fig. 2D). În schimb, tratamentul cu quercetină a provocat doar o reducere semnificativă a viabilității atât în celulele BMM, cât și în celulele RAW264.7, când aceste celule au fost expuse la 10 mM din fiecare compus timp de 2 zile cu 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, sau ambele (datele nu sunt afișate). Când concentrația acestor compuși este necesară pentru a inhiba 50 la sută din
Formarea osteoclastelor în BMM (IC50) a fost calculată folosind curbele concentrație-activitate, IC50 a actozidei, quercetinei, luteolinei, apigeninei și EGCG a fost de 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 și, respectiv, 6,6 mM (Fig. 2E). Acest rezultat a fost similar cu cazul în care au fost examinate macrofagele RAW264.7. Aceste date au sugerat că luteolina și quercetina au avut activități anti-clastogenice mai mari decât actozidul. În contrast, quercetina la IC50 a avut, de asemenea, un efect toxic ușor asupra celulelor (datele nu sunt prezentate).
ActeozidInhibă resorbția osoasă de către macrofage. Acteozidul a prevenit, de asemenea, resorbția osoasă mediată de RANKL într-o manieră dependentă de doză, măsurată printr-un sistem model in vitro (Fig. 3A). Resorbția osoasă a fost inhibată semnificativ atunci când BMM au fost incubate cu 1 mM actozidă (Fig. 3B). Un tratament cu acteozid de 10 mM a atenuat aproape complet formarea de gropi indusă de RANKL de către BMM. În mod similar, actozidul a scăzut resorbția osoasă în celulele RAW264.7 stimulate de RANKL (Figurile S2A și B). Capacitatea deacteozidpentru a inhiba resorbția osoasă a depins de momentul tratamentului în raport cu stimularea RANKL. Acteozidul (10 mM) adăugat la 4 zile după stimularea RANKL nu a redus formarea de gropi în BMM, în timp ce a suprimat numărul de osteoclaste formate (Fig. 3C). Acest rezultat diferit s-a datorat în parte zonei gropii deja formate după 4 zile de formare a stimulării RANKL (Fig. 3D).
ActeozidReglează în jos căile de semnalizare RANKL timpurii
RANKL induce activarea a 3 MAPK-uri și NF-kB binecunoscute în precursorii osteoclastelor, iar această activare este necesară pentru diferențierea precoce a osteoclastelor. Pentru a înțelege posibilele mecanisme prin care actozidul inhibă osteoclastogeneza, am investigat efectul actozidei asupra MAPK-urilor și activării NF-B la macrofage. BMM-urile și celulele RAW264.7 au fost pretratate cu acteozidă 10 mM timp de 2 ore și apoi stimulate cu RANKL 100 ng/ml timp de 30 de minute. Fosforilarea MAPK a fost examinată prin Western blot și analiză imunometrică. RANKL a indus fosforilarea p38, ERK și JNK în celulele BMM (Fig. 4A) și RAW264.7 (Fig. 4B). Acteozidul a prevenit aceste creșteri induse de RANKL ale p-p38, p-ERK și p-JNK. Acest rezultat a fost susținut de analiza imunometrică, care pretratamentul cu actozidă 10 mM a inhibat semnificativ nivelurile de MAPK fosforilate în aceste macrofage (Fig. 4C). Tratamentul RANKL a crescut legarea ADN-ului NF-kB, în timp ce actozidul a inhibat activarea indusă de RANKL a legării NF-kB-ADN (Fig. 5A). Această inhibare a fost mai proeminentă în BMM decât în celulele RAW264.7. Acteozidul a diminuat, de asemenea, fosforilarea p65 și IkBa stimulată de RANKL în celulele BMM și RAW264.7 (Figurile 5B și C). Adăugarea a 10 mMacteoside a inhibat aproape complet atât degradarea, cât și activarea IkBa în BMM (Fig. 5B). Pentru a confirma în continuare că activarea NF kB este implicată în acțiunea actozidei, constructele promotor-luciferazei kB au fost transfectate tranzitoriu în celule RAW264.7. Celulele incubate cu 100 ng/ml RANKL au avut activitate de promotor kB de 3- ori mai mare, care a fost atenuată semnificativ de actozidă de 10 mM (Fig. 5D).
Acteozidul suprimă producția de citokine inflamatorii și expresia TNF-a, c-Fos și NFATc1 în macrofagele stimulate de RANKL
TNF-a, IL-1b și IL-6 sunt importante în formarea și funcționarea osteoclastelor, care este mediată de semnalizarea NF-kB în macrofagele stimulate de RANKL. RANKL a stimulat producția acestor citokine, iar această producție a fost redusă semnificativ prin pretratarea cu actozidă de 10 mM în BMM (Fig. 6A). În mod similar, actozidul a atenuat producția de citokine indusă de RANKL, cu excepția IL-6, în macrofagele RAW264.7 (Fig. S3). Pentru a înțelege mecanismele moleculare ale acțiunii acteozidei în osteoclastogeneză, am examinat în continuare efectul actozidei asupra expresiei TNF-a, c-Fos și NFATc1. RANKL a reglat în sus expresia ARNm a acestor factori în celulele BMM și RAW264.7 (Figurile 6B și C). Pretratamentul cu 10 mM actozidă a inhibat semnificativ expresia indusă de RANKL a acestor factori în ambele
BMM-uri și celule RAW264.7. Pretratamentul cu acteozid a redus, de asemenea, puternic nivelurile de proteine ale c-Fos și NFATc1 în BMM-urile stimulate de RANKL (Fig. 6D). Aceste rezultate sugerează căacteozidreglează în jos mediatorii care induc RANKL ai formării osteoclastelor la nivel de genă și proteine.
Acteozidul diminuează generarea intracelulară de ROS în BMM într-o manieră dependentă de doză
Deoarece se știe că producția intracelulară de ROS este corelată cu osteoclastogeneza stimulată de RANKL, am investigat dacă actozidul inhibă producția de ROS în timpul diferențierii osteoclastelor mediate de RANKL utilizând un colorant permeabil la celule, sensibil la oxidare, DCFH-DA. Analiza citometriei în flux a arătat că semnalul de fluorescență mediu specific DCF în BMM a fost aparent deplasat la dreapta după stimularea cu RANKL, în comparație cu celulele de control netratate (Fig. 7A). Această schimbare a fost similară cu cazul în care macrofagele RAW264.7 au fost observate după stimularea RANKL (datele nu sunt prezentate). Tratarea BMM-urilor cu actozidă a redus intensitatea semnalului DCF într-o manieră dependentă de doză. Pretratamentul cu 10 mM actozidă a redus aproape complet nivelurile de ROS intracelulare produse în timpul diferențierii osteoclastelor la nivelurile de control netratate (Fig. 7B).
Administrarea orală de acteozidă inhibă alterarea markerilor biochimici osteoporotici și pierderea osoasă la șoarecii ovariectomizați
Pentru a explora efectul actozidei asupra pierderii osoase, am pregătit un model animal osteoporotic prin ovariectomie. Nu a existat nicio diferență semnificativă în greutatea corporală între OVX și Shammice în timpul perioadei experimentale (datele nu sunt prezentate). Grupul a avut niveluri serice semnificativ mai mari de IL-1b și IL{-6 decât grupul Sham (Fig. 8). Creșterile induse de ovariectomie ale acestor citokine inflamatorii au fost atenuate prin administrarea orală de acteozide (grupul AC). Nivelurile serice ale markerilor de turnover osos, cum ar fi ALP, calciu, TRAP5b și OC au fost semnificativ crescute în grupul OVX. Dintre acești markeri osteoporotici, nivelurile crescute de calciu, TRAP5b și OC la șoarecii OVX au fost aparent inhibate de tratamentul cu actozid, în timp ce nivelul seric al ALP nu a fost modificat de tratament. Sarcina maximă medie de fractură la mijlocul diafizei femurale drepte a fost semnificativ mai mică în grupul OVX decât în grupul Sham (Fig. 9A). Tratamentul cu acteozid a ridicat rezerva maximă de fractură la cea a grupului Sham. Când osul cortical al femurului a fost disecat și observat prin microscopie optică, caracteristicile osteoporotice prezentate în grupul OVX au dispărut aproape complet la șoarecii AC (Fig. 9B). Pentru a verifica efectul actozidei asupra modelului de osteoporoză indusă de OVX, DMO și parametrii morfologici osoși în trabecularul femurului proximal ușor au fost analizați prin micro-CT. După cum se arată în Fig. 9C, o modificare a arhitecturii trabeculare femurale a fost găsită la șoarecii OVX, în timp ce această modificare a fost diminuată prin tratamentul cu acteozid. Rezultatele analizei micro-CT au arătat că BMD, o măsură a rezistenței osoase, a fost redusă dramatic la șoarecii OVX (Fig. 9D). În comparație cu grupul Sham, șoarecii OVX au prezentat și schimbări semnificative în BV/TV, Tb. Sp și Tb. N, dar nu Tb.Th. Tratamentul oral cu actozid al șoarecilor OVX a prevenit în mod semnificativ alterarea BMD, precum și a BV/TV și Tb.N.
