Partea 2 Detectarea produselor medicinale Herba (Rou Cong Rong) de Cistanches folosind semnături de nucleotide specifice speciei

Căutând semnăturile nucleotidelor dezvoltate în acest studiu, am descoperit că 15 din cele 31 de medicamente brevetate chinezești etichetate ca conținândCistanches Herbaîn schimb, conținea adulteranți, inclusiv opt ingrediente contrafăcute și șapte adulteranți (Tabelul 2). De exemplu, șase loturi au fost înlocuite cu Cy. songaricum, inclusiv trei loturi de pastile Shihu Yeguang, un lot de pastile Kangguzhi Zengsheng, un lot de capsule Sanbao și un lot de particule Wenweishu.

În plus, loturi diferite de la același producător au produs rezultate oarecum diferite. De exemplu, dintre trei loturi de la un producător (ZCY16, ZCY69 și ZCY71), un lot a cuprins un amestec de Ci.deserticolași Cy. songaricum, un lot cuprindea un amestec deCi. deserticolașiCi. tubulosași un singur lot conținutCi. tubulosa. Două loturi de la un alt producător (ZCY44 și ZCY70) au fost, de asemenea, diferite: un lot conținea Cy. songaricum, în timp ce celălalt lot conțineaCi. deserticolașiCi. tubulosa.

Cistanches Herbaa fost detectat în 23 din cele 31 de medicamente brevetate chinezești testate (Tabelul 2) și doar 16 eșantioane au fost autentice, de exemplu, fără adulteranți sau ingrediente contrafăcute.Ci. tubulosaa fost detectat în 16 loturi de medicamente brevetate chinezești, iar Ci. deserticola a fost detectată în 10 loturi. O. coerulescens nu a fost detectat în niciunul dintre produse (Tabelul 2).

Cistanche deserticola are multe efecte, click aici pentru a afla mai multe

DISCUŢIE

Necesitatea dezvoltării unei noi metode de monitorizare a medicamentelor disponibile comercial care conțincistanciHerba

Cistanches Herbaeste un tonic care este utilizat pe scară largă în medicamentele brevetate chinezești de restaurare și alte produse medicinale. Cu toate acestea, controlul calității medicamentelor brevetate chinezești prezintă o mare provocare datorită diversității și complexității ingredientelor. Din cauza lipsei de supraveghere de reglementare, există oportunități considerabile de falsificare sau contrafacere a produselor. În plus, toate produsele trebuie prelucrate în conformitate cu Farmacopeea sau alte standarde; falsificarea sau contrafacerea nu este permisă în timpul procesării. Astfel, au fost stabilite varietăți de metode de control al calității, cum ar fi cromatografia lichidă bidimensională cu tăiere multiplă a inimii (Yao și colab., 2015), spectroscopia de reflexie în infraroșu apropiat (Zhang și Su, 2014; Zhang și colab., 2015). ), și cromatografie lichidă-spectrometrie de masă (Wang și colab., 2016b). Cu toate acestea, metodele de chimie analitică aflate în prezent în Comisia de Farmacopeea Chineză (2015) nu pot fi utilizate pentru a autentifica toate ingredientele din medicamentele brevetate chinezești sau pentru a detecta prezența ingredientelor adulterante. Mai mult, studiile au arătat că metaboliții vizați din plante sunt modificați în timpul procesării produsului, ceea ce duce la o variabilitate considerabilă a rezultatelor testelor sau la eșecul complet al metodelor de testare (Ananingsih et al., 2013). Astfel, instrumentele moleculare, cum ar fi semnăturile de nucleotide specifice speciei, sunt pregătite pentru a consolida sistemele de control al calității împotriva riscului de înlocuire frauduloasă a produselor și de falsificare și includere a ingredientelor neetichetate.

Deși ITS/ITS2 este considerat un instrument de înaltă eficiență pentru identificarea medicamentelor pe bază de plante, aceste secvențe nu pot fi amplificate din probe foarte procesate (Newmaster și colab., 2013; de Boer și colab., 2015). Wang şi colab. a raportat că ITS2 nu a putut fi amplificat din extractul de Angelicae Sinensis Radix sau din decocturi fierte mai mult de 120 de minute (Wang et al., 2016a). În conformitate cu tehnologiile tradiționale și Comisia pentru Farmacopeea Chineză (2015), Cistanches Herba este întotdeauna foarte procesată pentru a-și crește eficacitatea medicinală; aceste procese includ uscarea în cuptor, sărarea și aburirea cu vin (Zou et al., 2017), care duc la degradarea ADN-ului. În plus, în timpul procesării sunt adăugați diverși excipienți, cum ar fi mierea, amidonul și dextrina. Dacă acești excipienți nu sunt îndepărtați complet, puritatea ADN-ului va fi afectată. De exemplu, următorul proces de fabricație este utilizat pentru a genera capsule Sanbao care conțin Cistanches Herba: „Se fierbe feliile medicinale timp de 1,5 ore de două ori, se combină decocturile și se filtrează amestecul. Se concentrează filtratul la o densitate relativă de 1,20~1,25 (la 80°C). ◦C).Adăugați alte pulberi măcinate și combinați-le pentru a obține un amestec omogen.Uscați apoi amestecul la 60◦C, apoi pisați-l într-un amestec fin.

pulbere." Cu toate acestea, după procesul de producție descris mai sus, ar putea exista dificultăți în timpul extragerii ADN-ului medicamentelor brevetate chinezești și fragmentele lungi ar putea să nu fie amplificate din ADN-ul degradat, ceea ce ar împiedica identificarea adulteranților. Astfel, pentru a asigura calitatea și puritatea ADN-ului, am adăugat pași suplimentari înainte de extracția ADN-ului genomic, inclusiv spălarea cu tampon de prespălare și eluarea a zece tuburi paralele într-un tub pentru fiecare lot.

Deși toate medicamentele brevetate chinezești utilizate în prezentul studiu au conținut 6-25 de ingrediente, perechile de primeri dezvoltate ar putea amplifica în mod specific secvențele adulteranților din aceste medicamente brevetate chinezești. Secvențierea directă a produselor PCR a arătat fișiere de urme curate. Astfel, această metodă de semnătură a nucleotidelor este capabilă să identifice atât ingredientele autentice ale speciilor, cât și adulteranții și ar trebui să extindă aplicarea instrumentelor de diagnostic molecular bazate pe ADN pentru supravegherea pieței.

leziunile și bolile renale pot fi tratate prin cistanche

Semnături de nucleotide pentru identificarea eficientă a produselor Cistanches Herba

Instrumentele moleculare care utilizează tehnologia PCR sunt foarte promițătoare pentru autentificarea medicamentelor în cadrul sistemelor de control al calității. Aplicarea cu succes a primerilor pentru identificarea adulteranților degradați cu ADN de la Cistanches Herba sugerează că o metodă de detectare bazată pe PCR ar putea fi utilizată pe scară largă. Pe piața chineză a medicamentelor pe bază de plante, prețul ingredientelor autentice din speciile Cistanches Herba este de peste cinci ori mai mare decât prețurile adulteranților săi. Rezultatele noastre au arătat că Cy. songaricum este cel mai comun adulterant de Cistanches Herba de pe piață, urmat de Ci. Sinensis. Cy. songaricum a fost adăugat deoarece aceste medicamente au caracteristici morfologice similare. În plus, compoziția chimică a Ci. sinensis este asemănător cu cel al lui Cistanches Herba. Ca markeri de control al calitatii pentruCistanches Herbaextractele, echinacozidul și acteozidul pot fi extrase ieftin din Ci. sinensis. Astfel, unele fabrici farmaceutice folosesc Ci. sinensis ca substitut în producerea extractelor de Cistanches Herba. Luate împreună, rezultatele acestui studiu indică faptul că există o fraudă considerabilă pe piața medicamentelor.

Falsificarea în medicina brevetat chineză este similară cu cea întâlnită în alte țări. Niveluri similare de falsificare au fost înregistrate în America de Nord (Newmaster și colab., 2013), Europa (Raclariu și colab., 2017) și Asia (Cheng și colab., 2014; Shanmughanandhan și colab., 2016; Gao și colab., 2016. , 2017). În acest studiu, rata de falsificare a medicamentelor brevetate chinezești a fost de aproximativ 48,4 la sută, doar 16 din cele 31 de mostre fiind Cistanches Herba autentice. În plus, am speculat că rezultatele diferite produse în produse de la același producător ar putea fi atribuite diferențelor de calități ale diferitelor loturi de materiale de medicină chineză. Prin urmare, pentru a controla calitatea medicamentelor brevetate chinezești, materiile prime ar trebui să fie autentificate înainte de a fi procesate în produse.

FalsificareaCistanches Herbaa fost asociat în mod tradițional cu problemele cererii și ofertei de materii prime.Ci. deserticolașiCi. tubulosasunt cele două plante originale folosite în prezent pentru a formulaCistanches Herba. Cu toate acestea, Ci. deserticola este singura specie originală din Cistanches Herba tradițională autentică listată în Comisia de Farmacopeea Chineză (2000), în care Ci. tubulosa este identificat ca un adulterant. Din cauza lipsei de Ci. resurse deserticola,Ci. tubulosaa fost listat ca supliment în Farmacopeea Chineză din 2005 (Jiang și Tu, 2009). Până de curând, prețurile acestor plante au diferit semnificativ; Ci. tubulosa a fost mult mai puțin costisitoare decât Ci. deserticola deoarece există o aprovizionare mult mai mare din prima. Aici, rezultatele noastre au arătat că Ci. tubulosa este utilizat pe scară largă în produsele Cistanches Herba disponibile comercial.

În concluzie, semnăturile nucleotidelor și bazate pe PCR

metodele dezvoltate în acest studiu pot servi drept instrumente utile pentru industria medicamentelor pentru autentificarea ingredientelor și detectarea adulteranților încistanciProduse cu plante medicinale. În conformitate cu rezultatul sensibilității, chiar dacă proporția de adulterant a fost de unu la zece mii, acesta poate fi detectat prin qRT-PCR. Înseamnă că odată ce o semnătură de nucleotide este detectată încistanciProduse funcționale care conțin plante medicinale ar putea fi identificate ca un ingredient adulterant sau contrafăcut. A fost furnizată o soluție nouă pentru detectarea ingredientelor contrafăcute sau Cistanches Herba alterate, care nu era disponibilă anterior prin metode de detectare chimică în Farmacopeea Chineză. În plus, această metodă ar putea fi utilizată pentru a valida tipuri tot mai mari de medicamente și pentru a extinde aplicațiile instrumentelor de diagnostic molecular bazate pe ADN pentru supravegherea pieței.

Pentru a ușuracronicrinichiboalacucistanche

CONTRIBUȚIILE AUTORILOR

JH a conceput studiul și a participat la proiectarea acestuia. XW, RX și JC au contribuit cu mostre și au efectuat experimentele. XW a analizat datele. XW, JH, ZZ, S-GN, JS și SC au redactat manuscrisul. Toți autorii au citit și au aprobat manuscrisul final.

FINANȚAREA

Această lucrare a fost susținută de Fundația Națională de Științe Naturale din China [numărul de grant 81673552], CAMS Innovation

Fondul pentru Științe Medicale [numărul grantului 2016-I2 M- 3-016] și Proiectul cheie al Fondului Unit al Fundației Naționale pentru Științe Naturale din China [numărul grantului U1403224].

MULȚUMIRI

Dorim să le mulțumim colegilor noștri care ne-au ajutat cu colectarea probelor, identificarea, munca de laborator și pregătirea manuscrisului, inclusiv Chaokui Sun, Dianyun Hou și Piao Zhang.

MATERIAL SUPLIMENTAR

Materialul suplimentar pentru acest articol poate fi găsit online la: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018. 01643/full#material-suplimentar

Figura suplimentară S1|Rezultatul alinierii secvenței ITS2 de la șase specii.

Figura suplimentară S2|Electroforeza pe gel de agaroză a tuturor probelor.

Tabel suplimentar S1|Informații de prelevare a Cistanches Herba și a adulteranților săi.

Tabel suplimentar S2|Informații de secvență ale speciilor înrudite descărcate de la GenBank.

Tabel suplimentar S3|Compozițiile declarate ale diferitelor mostre de medicamente de brevet chinezești.

Fișă suplimentară S1|Toate secvențele obținute în acest studiu.

Cistanchedeserticola are multe efecte

REFERINȚE

Ananingsih, VK, Sharma, A. și Zhou, W. (2013). Catechinele de ceai verde în timpul procesării și depozitării alimentelor: o revizuire a stabilității și detectării. Alimentare Res. Int. 50, 469–479. DOI: 10.1016/j.foodres.2011.03.004

Chen, H., Jing, FC, Li, CL, Tu, PF, Zheng, QS și Wang, ZH (2007). Echinacozidul previne nivelurile extracelulare striate de monoamine

neurotransmițători din diminuare la șobolanii cu leziuni de 6-hidroxidopamină. J. Etnofarmacol. 114, 285–289. DOI: 10.1016/j.jep.2007.07.035

Chen, S., Yao, H., Han, J., Liu, C., Song, J., Shi, L. și colab. (2010). Validarea regiunii ITS2 ca un nou cod de bare ADN pentru identificarea speciilor de plante medicinale. PLoS ONE 5:e8613. DOI: 10.1371/journal.pone.0008613

Cheng, X., Su, X., Chen, X., Zhao, H., Bo, C., Xu, J., și colab. (2014). Analiza ingredientelor biologice a preparatului din medicina tradițională chineză bazată pe secvențierea de mare debit: povestea pentru Liuwei Dihuang Wan. Sci. Rep. 4:5147. DOI: 10.1038/srep05147

Comisia pentru Farmacopeea Chineză. (2000). Farmacopeea Republicii Populare Chineze. Partea I. Beijing: China Medical Science Press.

Comisia pentru Farmacopeea Chineză. (2015). Farmacopeea Republicii Populare Chineze. Partea I. Beijing: China Medical Science Press.

de Boer, HJ, Ichim, MC și Newmaster, SG (2015). Codul de bare ADN și farmacovigilența medicamentelor pe bază de plante. Drug Saf. 38, 611–620. DOI: 10.1007/s40264-015-0306-8

Dubey, B., Meganathan, PR și Haque, I. (2011). Minicodarea ADN-ului: o abordare pentru identificarea criminalistică a unor specii de șerpi indieni pe cale de dispariție. criminalistică. Sci. Int. Genet. 5, 181–184. DOI: 10.1016/j.fsigen.2010.03.001

Edgar, RC (2004). MUSCUL: aliniere secventa multipla cu precizie ridicata si randament ridicat. Acizi nucleici Res. 32, 1792–1797. DOI: 10.1093/var/gkh340

Fu, L. (1991). Cartea roșie a plantelor din China. Partea I. Beijing: Science Press, 502.

Gao, Z., Liu, Y., Wang, X., Song, J., Chen, S., Ragupathy, S., și colab. (2017). Tehnologia derivată a codurilor de bare ADN (semnătură de nucleotide și metode de vârf dublu SNP) detectează adulteranții și substituția în medicamentele brevetate din China. Sci. Rep. 7:5858. DOI: 10.1038/s41598-017-05892-a

Gu, CM, Yang, XY și Huang, LF (2016). Cistanches Herba: o revizuire de neurofarmacologie. Față. Pharmacol. 7:289. DOI: 10.3389/fphar.2016.00289

Hajibabaei, M., Smith, MA, Janzen, DH, Rodriguez, JJ, Whitfield,

JB și Hebert, PDN (2006). Un cod de bare minimalist poate identifica un specimen al cărui ADN este degradat. Mol. Ecol. Notele 6, 959–964. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2006.01470.x

Convenția farmacopeală din Japonia. (2016). Farmacopeea japoneză, Edn a XVII-a. Tokyo: Ministerul Sănătății, Muncii și Bunăstării din Japonia, 1831–1832.

Jiang, Y. și Tu, PF (2009). Analiza constituenților chimici la speciile Cistanche. J. Chromatogr. 1216, 1970–1979. DOI: 10.1016/j.chroma.2008.07.031

Keller, A., Schleicher, T., Schultz, J., Müller, T., Dandekar, T. și Wolf, M. (2009). Interacțiunea 5.8S-28S ARNr și adnotarea ITS2 bazată pe HMM. Genea 430, 50–57. doi: 10.1016/j.gene.2008.10.012

Lei, L., Yang, F., Zhang, T., Tu, P., Wu, L. și Ito, Y. (2001). Izolarea preparativă și purificarea acteozidei și 2’-acetil acteozidei din Cistanches salsa (CA Mey.) G. Beck prin cromatografie în contracurent de mare viteză. J. Chromatogr. A 912, 181–185. DOI: 10.1016/S0021-9673(01)00583-0

Li, Z., Lin, H., Gu, L., Gao, J. și Tzeng, CM (2016). Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): unul dintre cele mai bune daruri farmaceutice ale medicinei tradiționale chineze. Față. Pharmacol. 7:41. DOI: 10.3389/fphar.2016.00041

Liu, XM, Li, J., Jiang, Y., Zhao, MB și Tu, PF (2013). Componente chimice din Cistanche Sinensis (Orobanchaceae). Biochim. Syst. Ecol. 47, 21–24. DOI: 10.1016/j.bse.2012.09.003

Liu, Y., Wang, X., Wang, L., Chen, X., Pang, X. și Han, J. (2016). O semnătură de nucleotide pentru identificarea ginsengului american și a produselor sale. Față. Plant Sci. 7:319. DOI: 10.3389/fpls.2016.00319

Lo, YT, Li, M. și Shaw, PC (2015). Identificarea ierburilor constitutive din decocturile de ginseng prin markeri ADN. Bărbie. Med. 10:1. DOI: 10,1186/s13020-015-0029-x

Meusnier, I., Singer, GA, Landry, JF, Hickey, DA, Hebert, PD și Hajibabaei, M. (2008). Un mini-cod de bare ADN universal pentru analiza biodiversității. BMC Genomics 9:214. DOI: 10.1186/1471-2164-9-214

Newmaster, SG, Grguric, M., Shanmughanandhan, D., Ramalingam, S. și Ragupathy, S. (2013). Codul de bare ADN detectează contaminarea și înlocuirea produselor din plante din America de Nord. BMC. Med. 11:222. DOI: 10.1186/1741-7015-11-222

Raclariu, AC, Mocan, A., Popa, MO, Vlase, L., Ichim, MC, Crisan, G., et al. (2017). Autentificarea produsului Veronica officinalis folosind metabarcoding ADN și HPLC-MS dezvăluie alterarea pe scară largă cu Veronica chamaedrys. Față. Pharmacol. 8:378. DOI: 10.3389/fphar.2017.00378

Shanmughanandhan, D., Ragupathy, S., Newmaster, SG, Mohanasundaram, S. și Sathishkumar, R. (2016). Estimarea autentificării și a falsificării produselor pe bază de plante în India folosind o bibliotecă de materiale de referință biologică bazată pe ADN. Drug Saf. 39, 1211–1227. DOI: 10.1007/s40264-016- 0459-0

Sun, ZY, Song, JY, Yao, H. și Han, JP (2012). Identificarea moleculară a Cistanches Herba și a adulteranților săi pe baza secvenței nrITS2. J. Med. Plante Res. 6, 1041–1045. DOI: 10.5897/JMPR11.1115

Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M. și Kumar, S. (2011). MEGA5: analiză genetică evolutivă moleculară folosind metode de probabilitate maximă, distanță evolutivă și parcimonie maximă. Mol. Biol. Evol. 28, 2731–2739. DOI: 10.1093/molbev/msr121

Wang, Q., Song, W., Qiao, X., Ji, S., Kuang, Y., Zhang, ZX și colab. (2016b). Cuantificare simultană a 50 de compuși bioactivi ai formulei medicinei tradiționale chineze decoct Gegen-Qinlian folosind cromatografie lichidă de ultra-înaltă performanță cuplată cu spectrometrie de masă în tandem. J. Chromatogr. 1454, 15–25. DOI: 10.1016/j.chroma.2016. 05.056

Wang, T., Zhang, XY și Xie, WY (2012). Cistanche deserticola

YC Ma, „Desert ginseng”: o recenzie. A.m. J. Chin. Med. 40, 1123–1141. DOI: 10.1142/S0192415X12500838

Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J. și Chen, S. (2016a). O semnătură de nucleotide pentru identificarea Angelicae Sinensis Radix (Danggui) și a produselor sale. Sci. Rep. 6:34940. DOI: 10.1038/srep34940

Yao, CL, Yang, WZ, Wu, WY, Dai, J., Hou, JJ, Zhang, JX,

et al. (2015). Cuantificarea simultană a cinci saponine Panax notoginseng prin cromatografie lichidă bidimensională multidimensională: dezvoltarea metodei și aplicarea la controlul calității a opt medicamente brevetate chinezești care conțin Notoginseng. J. Chromatogr. 1402, 71–81. DOI: 10.1016/j.chroma.2015.05.015

Zhang, C. și Su, J. (2014). Aplicarea spectroscopiei în infraroșu apropiat la analiza și evaluarea rapidă a calității produselor medicinale tradiționale chinezești. Acta. Farmacia. Păcat. B 4, 182–192. DOI: 10.1016/j.apsb.2014.04.001

Zhang, W., Qu, Z., Wang, Y., Yao, C., Bai, X., Bian, S., și colab. (2015). Spectroscopie de reflexie în infraroșu apropiat (NIRS) pentru determinarea rapidă a ginsenozidei Rg1 și Re în pilula Naosaitong din medicina chineză. Spectrochim. Acta. A Mol. Biomol. Spectrosc. 139, 184–188. DOI: 10.1016/j.saa.2014.11.111

Zou, P., Song, Y., Lei, W., Li, J., Tu, P. și Jiang, Y. (2017). Aplicarea metabolomicei bazate pe RMN 1H pentru discriminarea diferitelor părți și dezvoltarea unui nou flux de lucru de procesare pentru Cistanche deserticola. Acta. Farmacia. Păcat. B 7, 647–656. DOI: 10.1016/j.apsb.2017.07.003

Declarație privind conflictul de interese: Autorii declară că cercetarea a fost efectuată în absența oricăror relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese.

Drepturi de autor © 2018 Wang, Xu, Chen, Song, Newmaster, Han, Zhang și Chen. Acesta este un articol cu ​​acces deschis distribuit în conformitate cu termenii licenței de atribuire Creative Commons (CC BY). Utilizarea, distribuirea sau reproducerea pe alte forumuri este permisă, cu condiția să fie creditați autorii originali și deținătorii drepturilor de autor și să fie citată publicația originală din această revistă, în conformitate cu practica academică acceptată. Nu este permisă nicio utilizare, distribuție sau reproducere care nu respectă acești termeni.