A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 2

I-Fang Wang,1,2 Yihan Wang,2 Yi-Hua Yang,1,3,4 Guo-Jen Huang,5,6 Kuen-Jer Tsai,3,4,* și Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1 Institutul Absolvent de Medicină Regenerativă Neurale, Colegiul de Știință și Tehnologie Medicală, Universitatea Medicală Taipei, Taipei 11031, Taiwan

2Institutul de Biologie Moleculară, Academia Sinica, Taipei 11529, Taiwan

3Institutul de Medicină Clinică, Colegiul de Medicină, Universitatea Națională Cheng Kung, Tainan 70403, Taiwan

4Centrul de cercetare de medicină clinică, Spitalul Universitar Național Cheng Kung, Colegiul de Medicină, Universitatea Națională Cheng Kung, Tainan 70403, Taiwan

5 Departamentul și Institutul Absolvent de Științe Biomedicale, Colegiul de Medicină, Universitatea Chang Gung, Taoyuan 33302, Taiwan

6Centrul de cercetare în neuroștiință, Spitalul Memorial Chang Gung, Linkou 33302, Taiwan

7Contact principal

* Corespondență: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Cistanche poate îmbunătăți memoria

REZUMAT

Variația fenotipică este o condiție fundamentală pentru evoluția celulelor și a organismului prin selecție naturală. În timp ce rolul expresiei genelor stocastice în diversitatea fenotipică a celulelor identice genetic este bine studiat, nu se cunosc multe despre relația dintre expresia genelor stocastice și variația comportamentală individuală la animale. Demonstrăm că un anumit miARN (miR-466f{-3p) este suprareglat în hipocampul unei porțiuni de șoareci individuali în consangvinizare la o sarcină de labirint de apă Morris. În mod semnificativ, miR- 466f{-3p reglează pozitiv morfologia neuronilor, funcția și învățarea spațială șimemoriecapacitatea șoarecilor. Din punct de vedere mecanic, miR-466f{-3p reprimă translația MEF2A, un regulator negativ al învățării/memorie. În cele din urmă, arătăm că reglarea variată a miR-466f{-3p din hipocamp rezultă din fosforilarea randomizată a legării elementului de răspuns a AMP ciclic (cAMP) hipocampal (CREB) la indivizi. Această constatare a modulării învățării spațiale șimemorieprin intermediul unei axe de semnalizare ale hipocampului randomizat la stimularea neuronală reprezintă o demonstrație a modului în care variația expresiei genei tisulare duce la un comportament variat al animalului.

INTRODUCERE

Variația fenotipică între indivizi conferă un avantaj evolutiv, deoarece oferă diversitatea populației asupra căreia acționează selecția naturală (Pavlicev et al., 2011). Contextul genetic și factorii de mediu contribuie la generarea unei astfel de variații naturale (Bendesky și Bargmann, 2011). Experimental, șoarecii consangviniți au fost adesea folosiți pentru a studia bazele moleculare și celulare ale fenotipurilor și comportamentelor medii, astfel încât să minimizeze efectele diferențelor genetice între indivizii testați (Casellas, 2011). Cu toate acestea, s-a demonstrat o variație a abundenței transcriptelor tisulare între șoarecii izogeni individuali. Genele care prezintă niveluri de expresie foarte variabile sunt adesea asociate cu funcția imună, răspunsurile la stres și reglarea hormonală, adică procesele sensibile la indicii de mediu (Vedell și colab., 2011). Unele dintre aceste studii au arătat, de asemenea, că diferențele în expresia genelor sau semnalizarea celulară, cu sau fără influența factorilor de mediu, cum ar fi linsul mamei, furnizarea de nutrienți în uter sau reziliența indusă de stres versus susceptibilitate (Bale, 2015; Danchin și colab. ., 2011; Lorsch

et al., 2019; Pedersen et al., 2011), poate duce la diferențe de fenotipuri și comportamente (Casellas, 2011; Locke și colab., 2015; Loos și colab., 2015; Oey și colab., 2015).

Învățare spațială șimemorieformarea controlată de creier poate fi împărțită în două sisteme: (1) navigație egocentrică care folosește auto-mișcarea și indicii interne și (2) navigarea alocentrică care implică în primul rând hipocampul și structurile cerebrale din apropiere, care este stimulată de indicii distale din afara organismelor (Ekstrom). et al., 2014). Capacitatea de învățare spațială șimemoriepermite celor mai multe specii de animale să își ajusteze progresiv comportamentele pentru a se adapta în medii variabile spațial și temporal, ceea ce este esențial pentru supraviețuirea lor. Acest lucru poate fi evaluat la animalele de laborator prin aplicarea paradigmelor comportamentale, cum ar fi labirintul de apă Morris (MWM) (Vorhees și Williams, 2014). În special, s-a demonstrat că rozătoarele consangvinizate identice genetic prezintă variații fenotipice în învățarea spațială șimemorie(Tsai et al., 2002), dar mecanismele care stau la baza acestei variații comportamentale au rămas necunoscute.

Formarea de noi amintiri este un proces complex care necesită transcripție genetică dependentă de activitate, sinteză de noi proteine ​​și

Figura 1. Corelaţia dintre variaţia învăţării spaţiale şimemoriecapacitatea și inducția miR-466f{-3p

(A) Sarcina MWM a șoarecilor C57BL/6J consangviniți de tip sălbatic. Panoul din stânga: performanțe MWM ale șoarecilor GLN (puncte) și șoarecilor PLN (pătrate). Dintr-un total de 289 de șoareci testați, 180 au fost clasificați ca GLN și 109 ca PLN. Panoul din dreapta: testul sarcinii MWM (n=47și 30 pentru fiecare grup). Duratele petrecute în fiecare dintre cele patru cadrane și regiunea platformei sunt comparate în histogramă. P, locul platformei lipsă; T, zonă țintă fără P; R, zona dreapta; O, zona opusă; L, zona stângă. (B) Analiza RT-qPCR a expresiei miARN. Nivelurile relative de expresie a șase miARN situate în clusterul miR-466-669 și miR-132-3p, ca control pozitiv îmbogățit cu creierul, au fost analizate și normalizate cu controlul intern U6 snRNA din hipocampul șoarecelui GLN și PLN. (n=9–18 per grup). eu, miR-466f- 3p; II, miR-466g; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3p.

rețele neuronale specifice reglate fin camemorieengrame pentru a face noi conexiuni neuronale și plasticitate susținută (Asok et al., 2019). Engramele hipocampice, care sunt populații rare de neuroni din girul dentat (DG), reprezintă ansambluri de neuroni care prezintă activitate crescută dupămemorieformare. În timp ce neuronii engramei DG prezintă un model foarte distinct de expresie a genelor (Rao-Ruiz et al., 2019), mecanismele moleculare specifice engramei care stau la bazamemorieconsolidarea rămân în mare parte necunoscute. Se știe că diferiți factori și căi de semnalizare reglează în mod pozitiv sau negativ învățarea șimemorieprocesele au fost identificate (Abraham et al., 2019; Humeau and Choquet, 2019). Printre acestea, forma activată a proteinei de legare a elementelor de răspuns (CREB) AMP ciclic (cAMP) stimulează transcripția genelor ca răspuns la creșterile dependente de activitate ale Ca2 plus intracelular în neuroni (Kandel, 2012). Pe de altă parte, calea tabără/PKA aprimă activitatea transcripțională a factorului de amplificare a miocitelor 2 (MEF2) prin prevenirea exportului nuclear al co-represorului său, HDAC5, și a importului nuclear al coactivatorului NFAT (Belfield et al., 2006). În plus, spre deosebire de CREB, activitatea MEF2A constrângememorieformarea (Cole et al., 2012). În afară de factorii proteici, microARN-urile (miARN-urile) sunt, de asemenea, implicate în reglarea funcțiilor neuronale, inclusiv învățarea și memoria (McNeill și Van Vactor, 2012). miARN-urile sunt mici (22 nt) ARN necodificatori care acţionează în primul rând regulatori post-transcripţionali ai expresiei genelor prin împerecherea bazelor specifice secvenţei cu situsurile lor de recunoaştere în cele 30 de regiuni netraduse (30 UTR) ale ARNm-urilor specifice (Daugaard şi Hansen, 2017). miARN-urile participă la o serie de căi de semnalizare în neuronii post-mitotici și mediază procesele celulare dependente de activitate, inclusiv creșterea și ramificarea dendritice, formarea sinapselor și maturarea. Reglând expresia genelor, ei joacă, de asemenea, roluri importante în formele de lungă durată de plasticitate sinaptică care stau la bazamemorieformarea, recuperarea și consolidarea (Chen și Shen, 2013; Wang și colab., 2012b).

În cele ce urmează, prezentăm dovezi pentru o legătură cauzală între expresia genei țesutului stocastic și variația comportamentală individuală la animale. În special, arătăm că activarea stocastică a unei axe hipocampale CREB-pCREB / miR- 466f{-3p-MEF2A modulează variația individuală a învățării spațiale șimemoriecapacitatea la șoarecii consangvini.

REZULTATE

Variaţia individuală a învăţării spaţiale şimemoriecapacitatea este corelată cu inducția miR{-466f{-3p dintr-un cluster specific de miARN

Pentru a identifica miRNA-urile implicate în reglarea învățării șimemorieformarea, am folosit sarcina MWM pentru a distinge șoarecii C57BL/6J de tip sălbatic consangvinizat cu capacitate bună sau slabă de învățare și memorie (Figura 1A). Am definit șoarecii care au finalizat sarcina în 30 de secunde în ultima (a șasea) sesiune drept „învățători buni” (GLN), în timp ce șoarecii care nu au putut găsi platforma în 30 de secunde în ultima sesiune au fost considerați „învățători săraci”. „(PLN). După cum se arată în Figura 1A (panoul din stânga), 62% dintre șoareci aparțineau grupului GLN (180 din 289 de șoareci), prezentând o reducere marcată a latenței de evadare de la 98,1 s (prima sesiune) la 21,8 s (a șasea sesiune). În schimb, latența de evadare a restului de 38% dintre șoareci, grupul PLN (109 din 289 de șoareci), a fost redusă doar moderat între prima și a șasea sesiune (de la 111,8 s în prima sesiune la 82,1 s în a șasea sesiune) . Testul sondei, care indică faptul că șoarecii au învățat într-adevăr sarcina în cele șase sesiuni, a arătat, de asemenea, că șoarecii GLN au stat mai mult în regiunea platformei decât șoarecii PLN (Figura 1A, perechea de bare din stânga în panoul din dreapta).

Apoi, am analizat ARN-urile din hipocampul șoarecilor GLN și PLN prin hibridizare cu microarray miARN (n=4 fiecare grup). În general, am observat diferențe relativ minore în profilurile de expresie ale miARN-urilor hipocampale de la șoarecii GLN și PLN. Cu toate acestea, am observat că primele 10 miARN-uri pentru care nivelurile de expresie au fost mai mari la șoarecii GLN decât la șoarecii PLN (datele nu sunt prezentate) au fost toate derivate din același cluster de miARN specific rozătoarelor, miR-466-669, situat în intronul 10 al gena mSfmbt2 (vezi mai jos). Pe baza analizei reacției în lanț a polimerazei cu transcripție inversă cantitativă (RT-qPCR) a nivelurilor de expresie ale miARN-urilor selectate din cluster, am ales miR-466f{-3p pentru investigații suplimentare (Figura 1B). Expresia medie a acestui miARN a fost de 1,5-ori mai mare în hipocampul șoarecilor GLN față de șoarecii PLN. În special, nivelurile medii de miR-466f{-3p din hipocamp au fost similare între grupul PLN, grupul de control cușcă acasă (HC) și grupul de control înot (Figura 1C), excluzând astfel efectele legate de exercițiu în timpul înot și susținând în continuare ideea că miR-466f{-3p a fost indus în timpul învățării spațiale șimemorieformare.

În Figura 1C, datele arată că nivelurile de expresie ale hipocampului miR-466f{-3p de peste 42% dintre șoarecii GLN au fost de cel puțin 1,5-ori mai mari decât nivelul mediu de expresie al Șoarecii de control HC, în timp ce nivelurile la 15% dintre șoarecii PLN au fost jumătate față de șoarecii HC. Aproximativ 25% dintre șoarecii GLN și 55% dintre șoarecii PLN au avut niveluri similare de miR-466f{{{{0}}p (0.8- la 1.2- pliu față de HC). Diagrama de dispersie a corelației Pearson care arată o corelație pozitivă între nivelurile miR{-466f{{-3p și durata procentuală pe platformă în timpul testului sondei este prezentată în Figura 1D. De asemenea, am efectuat hibridizarea in situ (ISH) miR-466f{{-3p și U6 a ARN nuclear mic (ARNsn) a feliilor de creier atât la șoarecii GLN, cât și la PLN (Figura 1E). Analiza statistică a semnalelor miR{- 466f{{-3p prin ISH a confirmat că inducerea miR{-466f{{- 3p a fost într-adevăr mai mare în DG la șoareci GLN în comparație cu cea a

Șoareci PLN, în timp ce nu a fost găsită nicio diferență atunci când au fost comparate semnalele snRNA U6 (histograma din dreapta, Figura 1E). Deși semnalele miR-466-3p nu au fost egale între celulele granulare individuale din DG, ele au crescut în mod semnificativ și omniprezent în hipocampul șoarecilor GLN în comparație cu șoarecii PLN. Prin urmare, inducția miR-466f{-3p nu a avut loc doar într-o mică parte a celulelor, de exemplu, neuronii engramei. Aceste date indică faptul că reglarea miR-466f{-3p în timpul sarcinii MWM este strâns asociată cu o mai bună învățare spațială șimemoriecapacitatea într-o proporție semnificativă de șoareci GLN.

De asemenea, am analizat nivelurile medii de expresie ale mai multor miARN-uri specifice creierului prin RT-qPCR. Printre acestea, miR-132-3p a fost reglat în creștere în hipocampul șoarecelui după sarcina MWM, dar nu am observat diferențe semnificative între grupurile GLN și PLN (perechea de bare VII, Figura 1B). Nivelurile de expresie ale miR-335-5p și miR{-22 au fost similare între grupurile GLN, PLN și HC (Figura S1A). Astfel, spre deosebire de miR-466f{-3p, expresia hipocampică a acestor miARN în timpul antrenamentului MWM nu este corelată cu învățarea spațială șimemoriecapacitatea șoarecilor.

Reglarea miR-466f{-3p favorizează creșterea neuritei și formarea coloanei dendritice

Pentru a confirma că miR-466f{-3p a fost într-adevăr exprimat în neuroni, am efectuat miARN ISH combinat cu colorarea prin imunofluorescență (IF) a NeuN și MAP2 în neuronii hipocampali primari. Rezultatele au arătat că, similar altor miARN (Cohen et al., 2011; Thomas et al., 2017), miR-466f{-3p a fost exprimat în principal în regiunea soma neuronală, cu unele semnale suplimentare. în dendrite (Figura S2A). Pentru a înțelege baza moleculară și celulară a asocierii miR-466f{-3p cu învățarea șimemorieformarea, am supraexprimat mai întâi miR-466f{-3p împreună cu o polipeptidă de fuziune dsRed sub controlul promotorului ubiquitinei din pFUGW-miR-466f-3p- Plasmida dsRed în neuronii hipocampali primari DIV10 (Figura S2B). Prin miRNA ISH, am confirmat că semnalul miR-466f{-3p este mai puternic în grupul de supraexpresie miR{{-466f{-3p comparativ cu controlul vectorial sau miR{{ mutant 12}}f-3p grup (săgeți, Figura S2B). În paralel, am stabilit, de asemenea, o platformă pentru a examina efectul pierderii funcției miR{{-466f{-3p prin inhibarea miR{-466f{-3p folosind miR-burete situat în 30 UTR de ARNm EGFP exprimat din plasmida pFUGW-miR-burete-EGFP (Figura S2C). Reporterul EGFP din plasmida burete a servit atât ca indicator al eficienței transfecției, cât și ca senzor al activității miARN celular (Kluiver și colab., 2012). Într-o porțiune semnificativă a celulelor HEK293T transfectate, semnalul EGFP a scăzut la coexprimarea cu miR-466f{-3p de tip sălbatic, dar nu și cu miR-466f{{32 mutant. }}p, datorită inhibării translației ARNm EGFP prin legarea miR-466f{{-3p la miR-burete în 30 UTR (comparați cele patru imagini din stânga și două program his-, Figura S2C) . În schimb, nu am observat scăderea semnalului EGFP la co-exprimarea buretelui de control care codifică opt copii ale unei secvențe amestecate din plasmida pFUGW-SCR-sponge-EGFP fie cu miR-466f{-3p fie mutantul său (comparați cele patru imagini corecte și două histograme).

După cum se arată în Figura 2A, expresia ectopică a miR-466f{-3p a dus la modificări morfologice ale neuronilor, în special creșterea neurită îmbunătățită în raport cu neuronii de control transfectați cu vectorul pFUGW-exprimând dsRed- dsRed sau plasmida mutantă miR{-466f-3p-exprimând pFUGW-mut-miR{- 466f-3p-dsRed. Datele de cuantificare au arătat că numărul mediu de ramuri dendritice per neuron nu a fost semnificativ diferit între grupul de supraexprimare a miR{-466f{{-3p (bara II) și controlul vector sau mutant (barele I și III) (dreapta) histograma superioară, Figura 2A). Cu toate acestea, lungimea medie totală a dendritelor și lungimea medie a dendritelor primare au crescut la supraexprimarea miR-466f{-3p (comparați bara II cu barele I și III, histograma dreapta jos din Figura 2A). În paralel, am inhibat miR-466f{-3p endogen folosind miR-burete. După cum sa văzut, nu a existat o diferență semnificativă în numărul de ramuri dendritice între grupurile de inhibare a miR-466f{{-3p și de control (comparați bara IV cu barele I și V, histograma dreapta sus, Figura 2A) , dar grupul de inhibare a miR-466f{-3p a afișat o reducere notabilă a lungimii totale medii a dendritelor, precum și a lungimilor medii ale dendritelor primare și secundare în raport cu alte grupuri (comparați bara IV cu barele I și V, histograma dreapta jos din figura 2A). În plus, colorarea IF a demonstrat că supraexprimarea miR{- 466f{{-3p, dar nu și inhibarea, a crescut, de asemenea, densitatea coloanelor dendritice (Figura 2B, panourile superioare și histograma stângă inferioară). De asemenea, am efectuat co-colorarea pentru proteina de densitate postsinaptică 95 (PSD-95) și am numărat densitatea spinilor dendritici colocalizați pentru a stabili numărul exact de sinapse excitatorii (Figura 2B, histograma dreapta jos), care a dezvăluit că miR{{40} Supraexpresia }}f-3p a crescut densitatea coloanelor PSD-95-pozitive în comparație cu alte grupuri de control. Cu toate acestea, inhibarea miR-466f{-3p nu a modificat semnificativ densitatea spinilor PSD-95-pozitive în raport cu cea a grupurilor de control (Figura 2B, histograma dreapta jos). Împreună, aceste date indică faptul că, în absența stimulării neuronale, inhibarea miR-466f{-3p singură nu afectează densitățile sinapselor excitatoare sau ale coloanelor dendritice totale.