pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 2

Yasaman Alaghbanda,b,c, Janine L. Kwapisa,b,d, Alberto J. Lópeza,b,c, André O. Whitea,b,c,3, Osasumwen V. Aimiuwua,b,c,1, Amni Al- Kachaka,b,c,2, Kasuni K. Bodinayakea,b,c,

Nicole C. Oparaugoa,b,c, Richard Danga,b,d, Mariam Astarabadia,b,c,4, Dina P. Matheosa,b, and Marcelo A. Wooda,b,c,d

a301 Laboratorul de cercetare Qureshey, Departamentul de Neurobiologie și Comportament, Centrul pentru

Neurobiologia învăţării şiMemorie, Universitatea din California, Irvine, Irvine, California, 92697 centre pentru neurobiologia învățării șiMemorie(CNLM), Irvine, California, 92697 c

Irvine Center for Addiction Neuroscience (ICAN), Universitatea din California, Irvine, California, 92697d Institutul pentruMemorieDeficiențe și tulburări neurologice, Universitatea din California, Irvine,

Apasa peCistanche tubulosa beneficii și efecte secundare pentru îmbunătățirea memoriei

Abstract

Histone deacetilazele (HDAC) sunt enzime care modifică cromatina care au fost implicate ca regulatori negativi puternici aimemorieproceselor. S-a demonstrat că HDAC3 joacă un rol esențial în memoria pe termen lung pentru localizarea obiectelor, precum și dispariția cocainei asociate.memorie, dar nu este clar dacă această funcție depinde de domeniul deacetilazei HDAC3. Aici, am testat dacă domeniul deacetilazei HDAC3 are un rol în localizarea obiectuluimemorieformarea precum şi formarea şi stingerea amintirilor asociate cocainei. Folosind un mutant punct mort de deacetilază al HDAC3, am descoperit că blocarea selectivă a activității deacetilazei HDAC3 în hipocampul dorsal a îmbunătățit memoria pe termen lung pentru localizarea obiectului, dar nu a avut niciun efect asupra formării memoriei asociate cocainei. Când același virus mutant punctual al HDAC3 a fost infuzat în cortexul prelimbic, nu a reușit să afecteze cocaina asociată.memorieformare. În ceea ce privește extincția, afectarea domeniului deacetilazei HDAC3 în cortexul infralimbic nu a avut niciun efect asupra extincției, dar a fost observat un efect de extincție facilitat atunci când virusul mutant punctual a fost livrat în hipocampul dorsal. Aceste rezultate sugerează că domeniul deacetilazei HDAC3 joacă un rol selectiv în anumite regiuni ale creierului care stau la baza pe termen lung.memorieformarea locației obiectului precum și a cocainei asociatememorieformare si disparitie.

Cuvinte cheie

memorie pe termen lung; epigenetica; cromatina; locația obiectului; preferință de loc condiționat; hipocampul dorsal

Introducere

Acetilarea histonelor este un mecanism bine studiat de modificare a cromatinei implicat în reglarea expresiei genelor necesare pentrumemorie. Numeroase studii au arătat că acetilarea histonelor este implicată pe termen lungmemorieformarea (egrevizată în Levenson și Sweatt, 2006; McQuown și Wood, 2011; Gräffand Tsai, 2013; Peixoto și Abel, 2013; Penney și Tsai 2014). Acetilarea histonelor este efectuată de histon acetiltransferaze și histon deacetilaze (HDAC), care în general facilitează și, respectiv, reprimă expresia genelor (Jenuwein și Allis 2001; Kouzarides, 2007). Histone deacetilaza 3 (HDAC3) este HDAC de clasă I cel mai puternic exprimat în creier, iar acest HDAC specific este un regulator negativ puternic al proceselor de învățare și memorie (Kwapis et al., 2017; Malvaez et al., 2013; McQuown et al. ., 2011; Rogge et al., 2013). Laboratorul nostru a arătat că HDAC3 joacă un rol critic în localizarea obiectelor și formarea memoriei legate de frică (McQuown și colab., 2011; Kwapis și colab., 2017) folosind manipulări HDAC3 specifice hipocampului și amigdalei. Am arătat, de asemenea, că inhibarea HDAC3 facilitează stingerea comportamentului de căutare a drogurilor într-o manieră care blochează restabilirea (Malvaez et al., 2013). Experimentele de extincție din Malvaez și colab. (2013) au folosit un inhibitor selectiv de HDAC3 administrat sistemic, astfel încât nu am putut identifica care regiuni ale creierului sunt cele mai importante pentru modularea HDAC3-dependentă a extincției.

HDAC3 în sine are o activitate puternică de deacetilază (Guenther și colab., 2002; Lahm și colab., 2007; Zhang și colab., 2002) și se asociază cu HDAC4/HDAC5 prin interacțiuni cu corepresorul receptorului nuclear corepresor (NCoR) la formează un complex represor funcțional, multiproteic (Guenther și colab., 2001; Fischle și colab., 2002; Alenghat și colab., 2008). O idee este că aceste complexe multi-proteice pot fi necesare pentru deacetilare, deoarece HDAC4 are activitate catalitică mică sau deloc pe substraturile canonice de acetil-lizină (Lahm et al., 2007). S-a demonstrat că HDAC4 moduleazămemorieindependent de domeniul său de deacetilază (Sando et al., 2012). În afara domeniului învăţării şimemorie, exprimarea genei mediată de HDAC3-în alte țesuturi nu necesită neapărat funcție enzimatică HDAC3 (Sun și colab., 2013), sugerând că poate că activitatea deacetilazei HDAC3 nu este necesară pentru formarea memoriei. Până de curând, activitatea deacetilazei HDAC3 în formarea memoriei nu a fost testată direct. Kwapis și colegii (2017) au demonstrat că, într-adevăr, activitatea enzimatică a HDAC3 este necesară pentru formele dependente de amigdală.memorieformare.

Studiile anterioare au demonstrat că administrarea sistemică a unui inhibitor HDAC3 ar putea facilita atât formarea locației obiectului.memorie(OLM), precum și stingerea cocainei asociate cu contextulmemorie(Malvaez et al., 2013). Cu toate acestea, dacă activitatea deacetilazei HDAC3 este necesară pentru localizarea obiectuluimemorieOLM în hipocamp și dispariția memoriei asociate cu contextul cocainei în cortexul infralimbic rămân neclare. În studiul actual, am vizat în mod specific activitatea deacetilazei HDAC3 în formarea memoriei dependente de hipocamp, precum și în hipocampul dorsal (DH), cortexul prelimbic (PrL) și cortexul infralimbic (IL) în ceea ce privește achiziția și extincția preferință de loc condiționat de cocaină sau asociată cu contextul de cocainămemorieproceselor.

Materiale și metode

Subiecte

Toate procedurile au fost aprobate de Universitatea din California, Comitetul Instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din Irvine și au fost în conformitate cu liniile directoare ale National Institutes of Health. Șoarecii aveau 8-12 săptămâni și aveau acces la hrană și apă ad libitum în cuștile lor de acasă, cu luminile menținute pe un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Testarea comportamentală a fost efectuată în timpul porțiunii ușoare a ciclului. Subiecții au fost șoareci masculi adulți C57BL/6J pentru experimentele AAV-HDAC3(Y298H)-v5. Pentru experimentul de ștergere HDAC3 flox, șoarecii Hdac3flox/flox și Hdac3 plus/plus de tip sălbatic littermate au fost menținuți pe un fundal C57BL/6J (Mullican și colab., 2011). Pe scurt, acești șoareci au fost generați în laboratorul Dr. Mitch Lazar de la Universitatea din Pennsylvania (Philadelphia, PA) cu situsuri loxP flancând exonul 4 prin exonul 7 al genei Hdac3, o regiune necesară pentru activitatea catalitică a enzimei (Mullican et al. al., 2011).

Droguri

Cocaina-HCl a fost achiziționată de la Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, SUA) și dizolvată în soluție salină (0,9 la sută NaCl). Cocaina-HCl este exprimată ca greutatea sării. Pentru antrenamentul cocaină-CPP în experimentele de achiziție, cocaină-HCl a fost dizolvată la o concentrație finală de 0,5 mg/ml și administrată într-un volum de 10 ml/kg greutate corporală, rezultând o doză finală de 5 mg/kg. Pentru antrenamentul cocaină-CPP în experimentul de extincție, cocaina-HCl a fost dizolvată la o concentrație finală de 2 mg/ml și administrată într-un volum de 10 ml/kg greutate corporală, rezultând o doză finală de 20 mg/kg. Cocaină-HCl și soluție salină au fost administrate intraperitoneal (ip).

Interventie chirurgicala

Șoarecii au fost induși cu 4 procente de izofluran în oxigen și menținuți la 1,5–2,0 procente pe durata intervenției chirurgicale. Animalele au fost injectate fie cu AAV-HDAC3(Y298H)-v5, fie cu AAV-EV (Empty Vector) (Kwapis și colab., 2017). Pentru experimentele DH, 1 ulofvirus a fost perfuzat bilateral. Pentru experimentele prelimbice și infralimbice, 0,3 µl de virus au fost perfuzați bilateral. Imunofluorescența a fost utilizată pentru a confirma expresia HDAC3 (Y298H). Acele de injectare au fost coborâte la coordonatele dorite cu o rată de 0.2mm/15s. {{20}}min după atingerea adâncimii țintă, virusul a fost injectat cu o viteză de 6 µl/h. După perfuzie, acele de injectare au fost lăsate pe loc timp de 2-min pentru a permite virusului să se difuzeze. Injectoarele au fost apoi ridicate cu 0,1 mm și lăsate să stea încă un minut înainte de a fi îndepărtate încet (0,1 mm/ 15s). Incizia a fost suturată și au fost lăsate 2 săptămâni pentru expresia virală completă înainte de comportament. Virușii au fost perfuzați cu infuzoare duble de calibrul 28 (DH: 3 mm de la centru la centru; PrL/IL: 0,8 mm de la centru la centru) atașate la tubulatura PE50 și conectate la seringi Hamilton montat pe pompe de perfuzie. Coordonatele pentru DH au fost: AP, −2,0 mm; ML, ±1,5 mm; DV, -1,5 mm față de Bregma. Coordonatele pentru PrL au fost: AP, plus 1,9 mm; ML, ±0,4mm; DV, -2,2 mm față de Bregma. Coordonatele pentru IL au fost: AP, plus 1,5; ML, ±0,4mm; DV, -3,2 mm față de Bregma.

Producție AAV

HDAC3 de tip sălbatic a fost amplificat din ADNc hipocampal de șoarece și donat într-un pAAV-IRES-hrGFP modificat (Agilent), sub controlul promotorului CMV și al intronului -globinei. Pentru a crea mutația punctuală, a fost creată o singură substituție de nucleotidă în exonul 11 ​​pentru producerea directă a unui reziduu de histidină în locul tirozinei la aminoacidul 298 (plasmida MW92). Pentru controlul Vector gol, secvența de codificare HDAC3 nu a fost prezentă, dar toate celelalte elemente rămân (plasmida MW87). Virusul adeno-asociat (AAV) a fost produs de Penn Vector Core (Universitatea din Pennsylvania) din plasmidele descrise mai sus și a fost serotipat cu AAV 2.1. Titrul final al AAV-HDAC3(Y298H) a fost de 6,48 × 1012 GC/mL, iar titrul final al AAV-EV a fost 1,35 × 1013 GC/mL.

Imunofluorescență

În experimentele comportamentale prezentate în figurile 2-7, fiecare animal inclus în analizele comportamentale a avut infuzie virală confirmată prin imunohistochimie. Șoarecii au fost eutanasiați prin luxație cervicală, iar creierul lor a fost îndepărtat și congelat rapid în izopentan rece ca gheață. Felii de 20µm au fost colectate în IL/PrL sau DH, montate dezghețat pe lame și stocate la -80 grade până la utilizare. Pentru analiza imunofluorescenței, lamele au fost fixate cu 4% paraformaldehidă timp de 10 minute și permeabilizate în 0,01% Triton X-100 în 0,1M PBS timp de 15 minute. Lamele au fost apoi blocate timp de 1 oră la temperatura camerei în ser normal de capră 8% (Jackson) și incubate peste noapte la 4 grade în anticorp primar (anticorp HDAC3 clona Y415: 1:250; Abcam). În ziua următoare, lamele au fost incubate timp de 1 oră la temperatura camerei cu Alexa 488 anti-iepure de capră (diluție 1:1000, Invitrogen) la întuneric, urmată fie de o incubare DAPI de 15-minut (1: 10.000, Invitrogen; DH). Pentru experimentele în care s-a folosit colorant roșu fluorescent de nissl NeuroTrace (1:50 NeuroTrace 530/615; Life Technologies), lamele au fost incubate timp de 50 de minute la temperatura camerei, urmate de două spălări în 0,01% Triton-X-100 pentru 5 minute și apoi două spălări în PBS timp de 5 minute. Lamelele au fost acoperite folosind mediu de montare VectaShield Antifade (Vector Laboratories).

Toate imaginile au fost achiziționate cu un scaner Olympus VS110 cu un obiectiv apocromatic de 20× (apertura numerică 0,75) cu software-ul de scanare VS110. Toate grupurile de tratament au fost reprezentate pe fiecare diapozitiv și toate imaginile de pe un diapozitiv au fost capturate cu același timp de expunere. Intensitatea imunomarcarii a fost cuantificată cu ImageJ prin eșantionarea densității optice în stratul celular de CA1 normalizat la fundal.

RT-PCR cantitativ

RT-PCR cantitativ în timp real a fost efectuat pentru a verifica expresia V5 și reglarea în sus a expresiei Hdac3mRNA de tip sălbatic după perfuzia AAV-HDAC3(Y298H) (experimentul 1), așa cum a fost descris anterior (López și colab., 2016; White și colab., 2016). Pentru experimentul 1, perforații de 1 mm în DH au fost colectate din felii de 500 µm în zona de expresie virală (sau o regiune echivalentă la șoarecii EV), așa cum a fost confirmat prin imunofluorescență. Tot țesutul a fost depozitat la -80 de grade până la procesare.

ARN-ul a fost izolat folosind un RNeasy Minikit (Qiagen) și cADN-ul a fost creat folosind kitul de sinteză a ADNc Transcriptor First Strand (Roche Applied Science). Au fost utilizați următorii primeri, derivați din Roche Universal ProbeLibrary: primer Hdac3right, 5'- ttcaacgtgggtgatgactg-3'; Hdac3left primer, 5'- ttagctgtgttgctccttgc-3'; sonda, ctgctccc; Primer Hdac3-v5right, 5'-tggagattctcgagggtaagc-3'; Primer Hdac3-v5left, 5'- atgccacccgtagatctgg-3'; sonda, ctctcctc. Fiecare dintre sondele pentru aceste gene țintă a fost conjugată cu colorantul FAM. A fost utilizată gliceraldehida-3-fosfat dehidrogenaza (Gapd) ca genă de referință pentru toate testele RT-qPCR. Pentru Gapd, am folosit următorii primeri: primer stâng, 5'atggtgaaggtcggtgtga-3'; primer drept, 5-aatctccactttgccactgc-3'; sondă, tggcggtattgg. Gapdprobe a fost conjugat cu LightCycler Yellow 555. Coloranții care nu se suprapun și stingerea de pe gena de referință permit multiplexarea în mașinile Roche LightCycle 480 II (Roche Applied Sciences). Toate valorile au fost normalizate la nivelurile de expresie Gapd. Analizele și statisticile au fost efectuate folosind algoritmii proprietari Roche și software-ul REST 2009 bazat pe metoda Pfaffl (Pfaffl 2001; Pfaffl et al., 2002).

Sarcini OLM și ORM

Pentru OLM și recunoașterea obiectelor noimemorie(ORM), datele de obișnuire (distanța parcursă în timpul sesiunilor individuale de obișnuire), videoclipurile de antrenament și testare au fost colectate folosind software-ul de analiză comportamentală ANY-maze. Instruirea și testarea pentru OLM și ORM au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (López și colab., 2016; McQuown și colab., 2011; Vogel-Ciernia și colab., 2013; Vogel-Ciernia și Wood, 2014). Înainte de antrenament, șoarecii au fost manipulați 1-2 minute timp de 4 zile și au fost obișnuiți cu aparatul experimental 5 minute până la camera OLM timp de 6 zile consecutive în absența obiectelor. În timpul procesului de antrenament, șoarecii au fost plasați în aparatul experimental cu două obiecte identice (OLM: pahare de 100 ml, 2,5 cm diametru, 4 cm înălțime; ORM: cutii de condimente și suporturi de lumânare din sticlă) și au fost lăsați să exploreze aceste obiecte timp de 3 minute. , care nu rezultă pe termen scurt sau lungmemorie. Am arătat anterior că o perioadă de antrenament de 3 minute este insuficientă pentru a genera LTM testat la 24 de ore (Haettig et al., 2011, 2013; López et al., 2016; McQuown et al., 2011; Stefanko et al., 2009) . Douăzeci și patru de ore mai târziu, retenția animalelor a fost testată timp de 5 minute. Pentru OLM, o copie a obiectului familiar a fost plasată în aceeași locație ca și în timpul procesului de antrenament, iar o copie a obiectului familiar a fost plasată în mijlocul cutiei. Pentru ORM, o copie a obiectului familiar și un obiect nou au fost plasate în aceeași locație ca în timpul procesului de antrenament. Toate testele de antrenament și testare au fost înregistrate video și marcate manual de către indivizi nevăzători la tratamentele pe animale. Videoclipurile au fost analizate pentru explorarea totală a obiectelor în plus față de indicele de discriminare (DI) [(timp petrecut explorând obiectivul nou petrecut explorând obiectul familiar)/(timp total explorând ambele obiecte) × 100 la sută]. Toate combinațiile și locațiile obiectelor au fost utilizate într-un mod echilibrat pentru a reduce potențialele părtiniri atribuite unei preferințe pentru anumite locații sau obiecte.

Aparat de preferință pentru locuri condiționate

Condiționarea preferinței locului a fost efectuată așa cum s-a descris anterior în studiile noastre (Malvaez și colab., 2011; Rogge și colab., 2013; White și colab., 2016). Pe scurt, șoarecii au fost manipulați timp de 1 minut în fiecare zi timp de 3 zile înainte de începerea experimentului (zilele 1-3). Procedura CPP pentru toate experimentele a fost efectuată folosind un protocol imparțial, contrabalansat. Preferințele de bază pentru fiecare dintre experimente au fost evaluate prin plasarea animalelor în compartimentul central al aparatului de preferință a locului și permițând accesul liber la toate compartimentele timp de 15 minute (pretest; ziua 4). Etapa de antrenament a început la o zi după pretest. Condiționarea a fost efectuată în următoarele 4 zile cu ușile ghilotinei închise, limitând astfel animalele într-unul dintre cele două compartimente exterioare ale aparatului CPP timp de 30 de minute (zilele 5-8). A fost utilizat un design imparțial, astfel încât jumătate dintre animale să primească cocaină înainte de plasarea în compartimentul în carouri și jumătate să primească cocaină înainte de plasarea într-un compartiment alb în ziua 1 de antrenament (CS plus). A doua zi, tratamentul și compartimentul au fost inversate pentru fiecare animal (ziua de antrenament 2), șoarecii au fost injectați cu soluție salină înainte de plasarea în compartimentul alternativ (CS-). Injecțiile au fost modificate pentru sesiunile de condiționare ulterioare. Pentru experimentele de achiziție prezentate în Fig. 3–5, animalele au primit în total două perechi de 30-minute cu cocaină într-un compartiment și două perechi de 30-min cu soluție salină în celălalt. La patruzeci și opt de ore după ultima sesiune de condiționare, preferința (15 min; post-test 1; ziua 10) a fost evaluată la toate animalele, așa cum este descris mai sus, într-o stare fără medicamente. Pentru experimentele de extincție prezentate în Fig. 6–7, animalele au fost supuse condiționării urmate de post-test 1 48 ore după ultima sesiune de condiționare, așa cum este descris mai sus. La două săptămâni după perfuzia virală în DH sau IL, animalele au fost supuse zilnic testelor de preferință repetate fără medicamente (15 minute; post-testele 2-5; zilele 25-28). Scorul CPP a fost calculat ca timp (i) petrecut în compartimentele pereche cu cocaină (CS plus) minus pereche cu soluție salină (CS-). Timpul petrecut în fiecare dintre compartimentele mari exterioare a fost analizat prin software automatizat din videoclipuri MPEG folosind software-ul EthoVision 3.1 (Noldus Technology; vezi Malvaez et al., 2011).

Analize statistice

Pentru toate analizele statistice a fost folosit Graphpad Prism 7.02 (Software GraphPad).

Obișnuirea a fost analizată folosind un ANOVA bidirecțional pentru a compara distanța totală parcursă în sesiunile de obișnuire. Datele de instruire și testare au fost analizate folosind un test t Student pentru a compara fie explorarea, fie DI între animalele de control și cele de testare. Datele de testare au fost, de asemenea, analizate utilizând un test t cu o singură coadă comparând valorile DI cu zero pentru a determina dacă a fost observată sau nu o discriminare semnificativă. Experimentele CPP au fost analizate folosind analiza bidirecțională a varianței (ANOVA), urmată de teste posthoctest Bonferroni cu scoruri de preferință (PS) la teste ca variabile intra-subiecți și grup/genotip (Vector gol vs. mutant punctual Y298H; Hdac3 plus / plus vs. Hdac3flox/flox). Acest test statistic a fost folosit pentru a face comparații specifice atunci când au fost observate interacțiuni semnificative și/sau efecte ale grupului principal. Datele de testare au fost, de asemenea, analizate folosind un test t cu o singură coadă comparând valorile PS cu zero pentru a determina dacă s-a observat sau nu o preferință semnificativă. Pentru experimentele de extincție, testele t Student au fost efectuate mai întâi pentru a determina dacă animalele au format o preferință semnificativă la post-testul 1 înainte de perfuzia virală. Valorile RT-qPCR au fost obținute așa cum este descris mai sus. Diferențele în valorile RT-qPCR au fost evaluate cu testele t Student. Pentru toate analizele, a fost necesară o valoare de 0,05 pentru semnificație.