PARTEA 1 Echinacozidul inhibă eliberarea de glutamat prin suprimarea Ca2 dependent de tensiune plus intrarea și protein kinaza C în terminalele nervoase cerebrale de șobolan
Mar 07, 2022
Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 și Su Jane Wang 3*
1 Departamentul de Anestezie, Spitalul Memorial Far-Eastern, Districtul Pan-Chiao, New Taipei City 22060, Taiwan; drluchengwei@gmail.com (CWL); drlin1971@gmail.com (TYL);nskh9450n@yahoo.com.tw (SKH)
2 Departamentul de Inginerie Mecanică, Universitatea Yuan Ze, Taoyuan 32003, Taiwan
3 Școala de Medicină, Universitatea Catolică Fu Jen, Nr. 510, Zhongzheng Rd., Xinzhuang Dist., New Taipei 24205, Taiwan.
Abstract:Sistemul glutamatergic poate fi implicat în efectele terapiilor neuroprotectoare. Echinacozid, un glicozid feniletanoid extras din planta medicinală chinezăHerba Cistanche,are efecte neuroprotectoare. Acest studiu a investigat efectele echinacozidei asupra eliberării de glutamat 4-evocată de aminopiridină la terminalele nervoase cerebrocorticale de șobolan (sinaptozomi). Echinacozidul a inhibat Ca2 plus-dependent, dar nu Ca2 plus-eliberare independentă de glutamat 4-evocată de aminopiridină într-o manieră dependentă de concentrație. Echinacozidul a redus, de asemenea, creșterea 4-evocată de aminopiridină a Ca liber citoplasmatic2 plusconcentrația dar nu a modificat potențialul membranei sinaptozomale. Efectul inhibitor al echinacozidei asupra eliberării de glutamat evocat de 4-aminopiridină a fost prevenit de cu-conotoxina MVIIC, un blocant cu spectru larg al canalelor Cav2.2 (tip N) și Cav2.1 (tip P/Q). , dar a fost insensibil la Ca intracelular2 plusinhibitori de eliberare dantrolen și 7-cloro-5-(2-clorofenil){-1,5-dihidro-4,1-benzodiazepină{{ 8}}(3H)-una (CGP37157). Mai mult, echinacozidul a scăzut fosforilarea 4-indusă de aminopiridină a proteinei kinazei C, iar inhibitorii proteinei kinazei C au abolit efectul echinacozidei asupra eliberării glutamatului. Conform acestor rezultate, sugerăm că efectul inhibitor al echinacozidei asupra eliberării de glutamat evocat este asociat cu o reducere a Ca dependentă de tensiune.2 plusintrarea și suprimarea ulterioară a activității protein kinazei C.
Cuvinte cheie:echinacozid; eliberare de glutamat; terminale ale nervilor cerebrocortical; Ca dependent de tensiune2plus canale; protein kinaza C din boala Parkinson, boala Alzheimer și ocluzia arterei cerebrale medii[9-12]. Cu toate acestea, mecanismul prin care echinacozidul induce neuroprotecția nu este pe deplin înțeles.
Pentru mai multe informații, vă rugăm contactați:Joanna.jia@wecistanche.com
Echinacozidulin cistanche au multe functii
1. Introducere
Echinacoziduleste un glicozid feniletanoid major prezent înHerba Cistanche, un renumit medicament tradițional chinezesc folosit pentru a trata uitarea, impotența și constipația cronică [1].Echinacozidulposedă diverse bioactivități precum antioxidarea, antiinflamația, anticancer, hepatoprotecția și modularea imunității [2-4]. În special,echinacozidare efecte neuroprotectoare; de exemplu, poate proteja împotriva neurotoxicității induse de stres oxidativ sau neurotoxine în neuronii corticali primari de șobolan, celulele SH-SY5Y de neuroblastom uman și celulele feocromocitom (PC12) [5-8]. În plus,echinacozidatenuează afectarea creierului și îmbunătățește funcția cognitivă în modelele animale de boala Parkinson, boala Alzheimer și ocluzia arterei cerebrale medii [9-12]. Cu toate acestea, mecanismul prin careechinacozidinduce neuroprotecția nu este pe deplin înțeleasă.
Neuroprotecția este un proces complex de păstrare a structurii și funcției neuronale în cazul insultelor toxice. Reducerea excitotoxicității glutamatului este considerată un mecanism potențial implicat în neuroprotecția creierului. Glutamatul, un neurotransmițător de aminoacizi excitatori, are un rol crucial în mai multe funcții ale creierului [13]. Cu toate acestea, supraactivarea receptorilor de glutamat la concentrații mari de glutamat provoacă Ca2 intracelular plus supraîncărcare, disfuncție mitocondrială, producție de radicali liberi și moarte neuronală [14,15]. Acest proces patologic este implicat în numeroase tulburări ale creierului, inclusiv ischemie cerebrală, leziuni cerebrale traumatice, epilepsie și boli neurodegenerative [16,17]. Prin urmare, inhibitorii care blochează transmiterea glutamatergică fiziopatologică sunt considerați potențiale medicamente neuroprotectoare. Exemple notabile ale acestora sunt antagoniştii receptorilor de glutamat [18,19]; cu toate acestea, studiile clinice pentru aceste medicamente au eșuat din cauza eficienței mai puține și a efectelor secundare nedorite sau chiar citotoxice [20,21]. În plus față de blocarea directă a receptorilor de glutamat, inhibarea eliberării glutamatului poate fi o strategie eficientă pentru neuroprotecție. Câteva neuroprotectori (de exemplu, memantina și riluzolul) pot reduce eliberarea de glutamat în țesuturile creierului de șobolan [22-24].
Având în vedere rolul glutamatului în excitotoxicitate și profilul neuroprotector alechinacozid, prezentul studiu a folosit terminale nervoase izolate (sinaptozomi) purificate din cortexul cerebral de șobolan pentru a investiga efectulechinacozidprivind eliberarea de glutamat și a explorat în continuare mecanismele potențiale. Preparatul izolat de terminale nervoase este un model bine stabilit pentru studiul reglării presinaptice a eliberării neurotransmițătorilor de către medicamente în absența oricăror efecte postsinaptice [25]. Utilizând acest model, am evaluat efectulechinacozidprivind eliberarea de glutamat, potențialul de membrană, afluxul presinaptic de Ca2 plus și activitatea protein kinazei C. Conform analizei noastre a literaturii, acesta este primul raport care documentează mecanismul prin careechinacozidinhibă eliberarea endogenă de glutamat la nivel presinaptic.
Echinacozidul poate antioxidare
2. Rezultate
2.1. EchinacozidulInhibă 4-eliberarea de glutamat evocată de aminopiridină de la terminalele nervoase cerebrale corticale de șobolan prin reducerea exocitozei veziculare
Figura 1 ilustrează efectul dependent de concentrație alechinacozidprivind eliberarea de glutamat evocată de {{0}}aminopiridină din sinaptozomii cerebrocorticali purificați de șobolan. În sinaptozomii incubați cu 1 mM CaCl2, 1 mM 4-aminopiridină a evocat o eliberare de glutamat de 7,4 ˘ 0,1 nmol/mg/5 min, care a fost redusă cu 1, 5, 10, 30 și 50 µMechinacozidla 6,5 ˘ 0,2, 5,8 ˘ 0,3, 4,8 ˘ {{10}},2, 4,1 ˘ 0,1 sau 2,3 ˘ 0,4 nmol/mg/5 min, respectiv (F(5,24)=67.1, p=0.000). Valoarea IC50 pentruechinacozidinhibarea mediată a eliberării de glutamat 4-evocată de aminopiridină, derivată dintr-o curbă doză-răspuns, a fost de 24 pM. Mai mult, eliberarea de glutamat evocată de 4-aminopiridină 1 mM într-o soluție extracelulară fără Ca2 plus, care conține 300 µM etilen glicol bis(-aminoetil eter)-N,N,N1,N{{ 13}}acidul tetraacetic (EGTA) a fost 2,1 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min (F(2,12)=310,65, p=0.{000), iar acest Ca2 componenta independentă de 4-aminopiridină evocată de glutamat nu a fost afectată de 20 µMechinacozid(1,8 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min; p=0,58; Figura 1). În sinaptozomii tratați cu 0,1 µM bafifilomicina A1, un inhibitor al transportorului vezicular [26], eliberarea de glutamat evocată de 4-aminopiridină a fost redusă semnificativ (2,2 ˘ 0,2 nmol/mg/ 5 min; F (2,12)=249,518, p=0.000). În prezența bafifilomicinei A1, echinacozidul 20 µM nu a reușit să inhibe în mod semnificativ eliberarea de glutamat (2,1 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min; p=0,94; Figura 1). Prin contrast, 10 µM DL-treo-beta-benzil-oxiaspartat (DL-TBOA, un inhibitor al recaptării glutamatului) [27], a crescut eliberarea de glutamat evocată de 4-aminopiridină la 11,8 ˘ 0,4 nmol/mg/5 min ( t(8)=´11.31, p=0.000). Chiar și în prezența DL-TBOA, 20 pMechinacozida inhibat semnificativ eliberarea de glutamat de {{{0}}evocată de aminopiridină (7,7 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min; F(2,12)=87,23, p=0.{{ 12}}; Figura 1)
2.2. EchinacozidulReduce Ca citosolic2la care se adaugaConcentrație, dar nu modifică sinaptozomalul
Potențial de membrană
Depolarizarea sinaptozomului cauzată de 1 mM 4-aminopiridină a crescut Ca2plus concentrare(p= 0.000; Tabelul 1). Aplicarea a 20 |vMechinacozidnu a afectat semnificativ Ca baral2plus concentrare (t(8) = 0.06, p= 0.95) dar a redus semnificativ creșterea 4-indusă de aminopiridină iia Ca2plus concentrare (t(10) = 6.16, p =0.000). În plus, 1 mM 4-aminopiridină a crescut în iodură de 3',3',3'-dipropiltiadicarbocianină [DiSC3(5)] fluorescență (p= 0.000). Adăugarea o(Echinacozidul de 20 fdM nu a modificat potențialul membranei de repaus (t(8)=0.976,p= 0.36) sau modificați semnificativ 4-creșterea mediată de aminopiridină a DiSC3(5) fluorescență (t(8) = —0.014, p= 0,99; Tabelul 1).
Cistancheechinacozidpoate trata bolile de rinichi
2.3. Redus- CO2 plusInfluxul prin canalele Cav2.2 (tip N) și Cav2.1 (tip P/Q) poate fi asociat cu inhibarea eliberării de glutamat 4-evocată de aminopiridină de cătreEchinacozidul
Figura 2 arată că 2 cu-conotoxină MVIIC, un N-și Ca de tip P/Q2plus blocant de canale,
a redus eliberarea de glutamat de {{{0}}aminopiridină evocată de la 7,4 土 0.2 la 2.{0 土 0,1 nmol/mg/5 min (t(9) = 25.35, p{{0}}.000). În prezența cu-conotoxinei MVIIC, efectul echinacozidei 20 pM asupra eliberării de glutamat evocat de 4-aminopiridină a fost nesemnificativ (1,8 x 0,2 nmol/mg/5 min;t(8) = 1.06, p= 0.32). Dantrolen (10 ^M), un inhibitor al Ca intracelular2plus eliberare Crom reticulul endoplasmatic [28], eliberare redusă de 4-aminopiridină evocată de glutamat (5,6 土 0,3 nmol/mg/5 min; F(2,14)=104. 95,p= 0.000). Cu toate acestea, în prezența dantrolenului, 20 pJMechinacozidar putea încă inhiba eliberarea de glutamat în mod semnificativ (3,3 土 0,2 nmol/mg/5 min;p= 0.000). Rezultate similare au fost observate utilizând 100 pM 7-clor-5-(2-clorfeni){-1,5-dihidro-4,1-benzotiazepină -2(3H)-one (CGP37157), un blocant membranar al Na mitocondrialla care se adauga/Ca2plus schimb. În cele cinci preparate sinaptozomale examinate, 20 pMechinacozidcombinat cu 100 pM CGP37157 a redus eliberarea de glutamat 4-evocată de aminopiridină cu 48,3% 土 5,2% (F(2,13) = 136.79,p= 7.000), similar cu inhibarea de către echinacozidă singur (46,2 la sută 土 2,3 la sută;p = 0.89;
2.4. EchinacozidulInhibează 4-evocat de aminopiridină (eliberarea de glutamat prin semnalizare prin protein kinaza C
După cum este ilustrat în Figura 3, 10 grade jlM 2-[1-({3-dimetilaminopropil)indol-3-il]-3-(indol{-3-il) maleimidă (GF109203X), un inhibitor general al proteinei kinazei C [29], reduce eliberarea de glutamat evocată de aminopiridină 4-(F(2,13) = 19.46, p=0 .000). În sinaptozomii tratați cu GF109203X, echinacozidul 20 pM a redus eliberarea de glutamat evocată de aminopiridină cu doar 5,5% ± 1,8% (p=0,89), mai puțin decât echinacozidul singur (42,4% 土). procente ; p=f.000). Rezultate similare au fost obținute cu 5,6,7,13-tetrahidro-13-metil-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pirolo[3 ,4-c]carbazol-12-propanenitril (Go6976), un selectiv pentru izoformele proteine kinazei C dependente de Ca2 plus (a, |3I, |3II, y) [29]. În prezența a 3 pM Go6976, 20 pMechinacozida redus eliberarea de glutamat cu 11,9 la sută 土 2,9 la sută (p=0,59), ceea ce înseamnă o reducere semnificativă în comparație cu cea a echinacozidului singur (42,4 la sută 土 2,3 la sută; p=0.000; Figura 3). Prin contrast, rotlerina 3 pM, un inhibitor independent de protein kinaza C6 de Ca2 plus [30], nu a modificat semnificativ eliberarea de glutamat evocată de 4-aminopiridină (1 mM) (p=0.45). Cu toate acestea, în prezența rotlerinei, 20 pM de echinacozidă a determinat efectiv o inhibare medie de 37,1 la sută 土 5,6 la sută din eliberare (F(2,13) = 19.72, p=0.{{33 }}), similar cu cel al echinacozidului singur (p=0.41; Figura 3). În plus, inhibitorul de protein kinază activat de mitogen 2-({2-amino-3-metoxifenil)-4H{-1-benzopiran-4-one) (PD98059) ) (50 pM) și inhibitorul proteinei kinazei A N-[{2-(p-bromocinamilamino)etil]-5-izochinolinesulfonamida (H89) (100 pM) au redus eliberarea de glutamat de 4-aminopiridină evocată (p=0.000). Chiar și în prezența PD98059 sau H89, 20 pMechinacozida redus efectiv eliberarea (F(2,13) = 52.3, p=0.000; Figura 3).
Figura 4 arată că 4-aminopiridina de 11 mM a crescut fosforilarea proteinei kinazei C în sinaptozomi (t(4) = —6.871, p= 0.002). Când sinaptozomii au fost pretratați cu echinacozidă 20 pM timp de 10 minute înainte de adăugarea de 4-aminopiridină, fosforilarea indusă de 4-aminopiridină a proteinei kinazei C a scăzut considerabil (F(2)a6) = 29.202, p = 0.00 1).
Echinacozidulîncistanchepoate stimulasistem imunitar
2.5. Echinacozidul-Inhibarea mediată a eliberării de glutamat nu implică un acid gamma-aminobutiric de tip A (GAB3AA) Receptor
În Figura 5, efectul echinacozidei asupra eliberării de glutamat evocat de 4-aminopiridină în absența sau prezența SR95531 (un antagonist al GABAAreceptor) a fost comparat. În plus, 100 pM SR95531 nu a modificat semnificativ eliberarea de glutamat evocată de 4-aminopiridină (1 mM). În
Sinaptozomi tratați cu SR95531-, aplicarea a 20 pM de echinacozidă a dus la o inhibare de 43% a eliberării de glutamat evocat de 4-aminopiridină (F(2,12)=42.63,p= 0.000), care nu a fost semnificativ diferit de inhibarea produsă numai de echinacozidă (40 la sută;p= 0.000). Un rezultat similar a fost obținut cu un alt antagonist al receptorului GABAa, bicuculină (50 pM). Eliberarea măsurată în prezența bicuculinei și
