Partea a doua Cum echinacozid trata ADN-ul oxidativ daune și inhiba apoptoza celulelor?

CLICK AICI PENTRU A PARTEA ÎNTÂI

Pentru mai multe informații, vă rugăm să contactați:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola are multe efecte, click aici pentru a afla mai multe

3.Experimentale Secțiune

3.1.Celule și Produse chimice

O linie celulară adenocarcinom colorectal uman SW480 a fost achiziționată de la ATCC. Celulele au fost cultivate în Dulbecco modificat Eagle's mediu (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, SUA) care conțin 10% fetale bovine ser (FBS) (Gibco) și 1% (v/v) penicilină-streptomicină (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) la 37 °C într-o atmosferă umidificată care conține 5% CO2.Echinacosidea fost achiziționat de la Yuanye Biotechnology, Shanghai, China (HPLC > 98%). Soluțiile stoc au fost preparate în DMSO (Sigma-Aldrich), iar soluțiile de lucru au fost pregătite într-un mediu de cultură celulară.

3.2.Testul de viabilitate MTT

Celulele au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la 1 × 104 celule pe godeu timp de 12 ore și apoi incubate în prezențaEchinacosidesau 0,01% DMSO pentru 24 sau 48 h. În cele din urmă, 20 μL de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bromură de tetrazoliu difenil) soluție (5 mg/ml în PBS, pH 7.2) (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) a fost adăugat la fiecare godeu, iar plăcile au fost incubate timp de 4 ore. După îndepărtarea mediului care conține MTT, s-au adăugat 150 μL de DMSO în fiecare godeu. Plăcile au fost incubate pe un agitator de plăci timp de 10 minute, iar absorbanța la 570 nm a fost măsurată de un cititor de microplăci BioRad 680 (Hercules, CA, SUA). Fiecare experiment a fost realizat de două ori în trei exemplare. Datele au fost analizate folosind software-ul GraphPad Prism (San Diego, CA, SUA).

3.3.Colony Formarea test

Celulele au fost însămânțate în plăci cu 6 godeuri la o densitate de 1 × 104 pe godeu timp de 12 ore și apoi incubate în prezențaEchinacosidesau 0,01% DMSO timp de 10 zile. Plăcile au fost spălate cu PBS, iar celulele au fost fixate cu metanol rece ca gheața și colorate cu soluție violet de cristal (Sigma-Aldrich) (0,5% în metanol 25%). Imaginile au fost fotografiate după ce farfuriile au fost uscate peste noapte. Cristalele cristaline au fost dizolvate în etanol 70%, iar absorbanța la 595 nm a fost măsurată de un cititor de microplate BioRad. Datele au fost analizate cu ajutorul software-ului GraphPad Prism.

3.4.Analiza fragmentării ADN-ului cu fluorescență DAPI Colorare

După tratamentul medicamentos, celulele din plăcile cu 24 de godeuri au fost spălate o dată în PBS, fixate în paraformaldehidă (PFA) rece ca gheața (PFA) (Sigma-Aldrich) în PBS timp de 20 de minute și apoi colorate cu 4,6-diamidino-2- fenilindol (DAPI) (Sigma-Aldrich) (0,2 μg/ml) timp de 10 minute la temperatura camerei. După spălarea cu PBS, celulele au fost sigilate în mediu de montare VECTASHIELD (Vector Laboratories, Burlingame, CA, SUA). Morfologia nucleară a fost fotografiată cu un microscop fluorescent Olympus.

Echinacozida din cistanche poate stimula sistemul imunitar

3.5.Analiza ciclului celular

Celulele au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la 1 × 104 celule pe godeu timp de 12 ore și apoi incubate în prezențaEchinacosidesau 0,01% DMSO pentru 24 h. În cele din urmă, celulele au fost recoltate cu tripsină (Invitrogen), spălate în PBS de două ori și apoi fixate cu etanol rece ca gheața (70%) timp de 2 ore la −20 °C. Celulele fixe au fost spălate de două ori în PBS rece și resuspendate în 300 μL de PBS proaspăt preparat cu 0,1% Triton X-100, 0,2 mg/ml RNase A (Sigma), 10 μg/mL Iodură de propidiu (PI) (Roche, Indianapolis, IN, SUA). După incubare la 37 °C în întuneric timp de 20 de minute, celulele au fost filtrate printr-o plasă de nailon (Falcon, BD Bioscience, San Jose, CA, SUA), încărcate la citometrul de flux FACSCalibur (BD Biosciences). Datele au fost analizate cu ajutorul software-ului ModFit (Topsham, ME, SUA).

3.6.Analiza apoptozei

Celulele au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la 1 × 104 celule pe godeu timp de 12 ore și apoi incubate în prezențaEchinacosidesau 0,01% DMSO pentru 24 h. În cele din urmă, celulele au fost examinate folosind un kit de detectare a apoptozei Anexain V-FITC (Best, Shanghai, China), în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Celulele au fost spălate de două ori cu PBS și apoi resuspendate în tampon de legare. 5 μL fiecare dintre anexele V-FITC și iodura de propidiu (PI) (Roche) au fost adăugate secvențial, iar celulele au fost incubate timp de 15 minute în întuneric la temperatura camerei. Celulele au fost încărcate pe citometrul de flux FACSCalibur (BD Biosciences). Datele au fost analizate cu ajutorul software-ului Cell Quest (BD Biosciences).

3.7.Colorarea imunofluorescentă a 53BP1

Celulele SW480 au fost însămânțate pe capace rotunde în plăci de 24 de puțuri. După tratamentul cuEchinacosidesau 0,01% DMSO pentru 24 h, celulele au fost fixate cu 4% PFA timp de 20 min și blocate cu 15% FBS (0,1% Triton X-100) timp de 1 h la temperatura camerei. Celulele fixe au fost incubate timp de 2 ore la temperatura camerei cu anticorp anti-53BP1 de iepure (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, SUA) diluat 1:1000 în soluția de blocare, urmată de colorarea cu anticorpi secundari anti-iepure de capră conjugați Cy3 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, SUA) diluat 1:500 în tampon de blocare timp de 1 h la temperatura camerei. După spălarea în PBS timp de 3 × 5 minute, capacele au fost sigilate pe tobogane de sticlă în mediu de montare VECTASHIELD cu DAPI. Imaginile au fost realizate de un microscop confocal Zeiss LCM 510 (Carl Zeiss, Jena, Germania).

3.8.Testul de încorporare 8-oxoG

8-oxoG intracelular a fost măsurat prin colorare cu Alexa 488-conjugat avidin (Invitrogen) [25]. Celulele au fost însămânțate pe capace rotunde în plăci de 12 puțuri. După tratamentul cuEchinacosidesau 0,01% DMSO timp de 24 de ore, celulele au fost fixate cu metanol rece ca gheața timp de 20 de minute, urmată de incubarea în soluție salină tamponată tris (TBS) (Fisher Scientific, Rockford, IL, SUA) cu 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) timp de 15 min. Probele au fost blocate în TBS cu 0,1% Triton X-100 și 15% FBS timp de 1 h la temperatura camerei și apoi colorate cu avidin conjugat Alexa 488 (0,5 μg/ml) în soluție de blocare timp de 1 h la 37 °C. După spălarea în PBS timp de 3 × 5 minute, capacele au fost sigilate pe lame de sticlă în mediu de montare VECTASHIELD cu DAPI (Vector Laboratories). Imaginile au fost preluate și analizate de un microscop confocal Zeiss LCM 510.

3.9.Western Blot Analiză

Celulele cultivate și tratate în plăci cu 6 puțuri au fost răzuite în tampon RIPA (150 mM NaCl, 1,0% IGEPAL CA-630, 0,5% deoxicolat de sodiu, 0,1% SDS și 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8,0) (Sigma). Concentrația totală de proteine a fost măsurată prin kitul BCA (Dingguo, Changchun, China) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Probele au fost denaturate la 95 °C timp de 10 minute, separate pe gel SDS-PAGE 4%-12% și apoi transferate în membrane PVDF (Millipore, Billerica, MA, SUA). Membranele au fost blocate în 5% lapte fără grăsimi în TBST timp de 2 ore și incubate cu anticorpi primari (Bcl-2, sc-492, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA; Bax, Santa Cruz, sc-493; la c, Santa Cruz, sc-7159; p21, ab109520, Abcam, Cambridge, MA, SUA; caspase 3, Abcam, ab32042; PARP, Bioss, bs-2318R; 53BP1, Laboratoarele betil, A300-272A) peste noapte la 4 °C. După spălarea cu PBS, membranele au fost incubate cu anticorpi secundari conjugați hrp (Jackson ImmunoResearch Laboratories) și vizualizate cu kitul de detectare a blotting-ului ECL Western (Transgen Biotech, Changchun, China). Fotografiile au fost surprinse și analizate de un Imager (Tanon, Shanghai, China).

3.10.Măsurarea celulară ROS

ROS intracelular a fost măsurat prin citometrie de flux folosind un kit de testare ROS pe bază de celule (Beyotime Biotechnology, Haimen, China; S0033). La sfârșitul anuluiEchinacosidetratament, celulele au fost spălate de două ori cu PBS și incubate cu diacetat de diclorfluoresceină 10 μM (DCFH-DA) timp de 30 de minute la 37 °C. Celulele au fost apoi tripsinizate și analizate de citometrul de flux FACSCaliber (BD Biosciences). Nivelurile de SRO intracelulare au fost exprimate ca intensitatea medie a fluorescenței DCF a celulelor.

3.11.Măsurarea membranei mitocondriale Potențial

Potențialul membranei mitocondriale a fost măsurat folosind colorantul JC-1 (Beyotime Biotechnology, C2006) urmând instrucțiunile producătorului. Controlul șiEchinacoside-celulele tratate au fost incubate cu JC-1 timp de 20 min si apoi examinate cu un microscop fluorescent Olympus.

3.12.Analiza statistică

Analiza statistică a fost efectuată cu ajutorul GraphPad Prism Software. Semnificația a fost calculată utilizând analiza unidirecțională a varianței (ANOVA) șip< 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" results="" were="" expressed="" as="" mean="" ±="">

Echinacosideîncistanche:NeuroprotecțieEfecte

4.Concluziile

În acest studiu, am testat efecteleEchinacosidepe o varietate de linii celulare canceroase umane. În mod surprinzător, am constatat că

Cistanchedeserticola are multe efecte, click aici pentru a afla mai multe

a inhibat proliferarea hepatomului uman SK-HEP-1, a cancerului de sân MCF-7 și a celulelor canceroase colorectale SW480. Analize suplimentare a constatat că Echinacoside arestat SW480 celule în faza G1, și induse de apoptoza dependentă de caspază prin activarea căii de apoptoza intrinsecă asociate mitocondriilor. Arestarea ciclului celular a fost legată de upregulation de blocant G1/S-CDK și inhibitor de sinteza ADN-ului CDKN1B (p21), și apoptoza a fost asociat cu downregulation de proteine anti-apoptotice Bcl-2 și upregulation de Pro-apoptotic Bax, precum și pierderea potențialului membranei mitocondriale. Creșterea semnificativă a formei oxidate intracelulare de guanină, 8-oxoG, sugerează că au existat oxidări crescute ale dNTPs și/sau molecule de ADN, care ar fi putut provoca oprirea ciclului celular și apoptoza în celulele canceroase SW480. În timp ce mecanismele care stau la bazaEchinacoside"Efectele asupra oxidativ daune și apoptoza rămân să fie caracterizate, aceste rezultate de sprijin Echinacoside ca o schele chimice noi pentru dezvoltarea de medicamente împotriva cancerului.

Aprecieri

Aceste studii au fost susținute de un grant din provincia Jilin (numărul grantului: 20130101120JC) și de un fond de cercetare de la Universitatea Jilin (Numărul proiectului: 450091099029).

Contribuțiile autorului

Liwei Dong a efectuat cea mai mare parte a lucrărilor experimentale, a analizat datele și a scris manuscrisul; Debin Yu și Nuoting Wu au făcut testul MTT și formarea coloniilor; Hongge Wang și Jiajing Niu au făcut experimentele de imunostaining și western blot; Ye Wang a ajutat cu ciclul celular și experimente apoptoza; iar Zhihua Zou a dezvoltat conceptul, a analizat datele și a supravegheat implementarea acestui studiu și scrierea manuscrisului. Toți autorii au aprobat manuscrisul trimis.

Conflicte de interese

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Echinacosideîncistancheputeaantiinflamator

Referinţe

1. Jiang, Y.; Tu, P.F. Analiza constituenților chimici din speciile Cistanche.J. Chromatogr.2009,

1216, 1970–1979.

2. Wang, T.; Zhang, X.; Xie, W.Cistanche deserticolaY.C. Ma, "desert ginseng": O revizuire.AmJ Chin. Med.2012,40, 1123–1141.

3. Freeman, C.; Spelman, K. O evaluare critică a interacțiunilor medicamentoase cuEchinacea Spp.

Mol. Nutr. Alimente Res.2008,52, 789–798.

4. Hudson, JB Aplicații de fitomedicinaEchinacea purpurea(Coneflower violet) în boli infecțioase.J. Biomed. Biotechnol.2012,2012, 769896.

5. Zhang, D.; Li, H.; Wang, J.B. Echinacoside inhibă fibrilizarea amiloidă a HEWL și protejează împotriva neurotoxicității induse de Aβ.Int. J. Biol. Macromol.2015,72, 243–253.

6. Wu, Y.; Li, L.; Wen, T.; Li, Y.Q. Efectele protectoare ale echinacozidului asupra hepatotoxicității induse de tetraclorură de carbon la șobolani.Toxicologie2007,232, 50–56.

7. Li, X.; Gou, C.; Yang, H.; Qiu, J.; Gu, T.; Wen, T. Echinacoside ameliorează D-galactozamină plus lipopolizaharide induse de leziuni hepatice acute la șoareci prin inhibarea apoptozei și inflamației.Scanat. J. Gastroenterol.2014,49, 993–1000.

8. Xie, H.; Zhu, H.; Cheng, C.; Liang, Y.; Wang, Z. Echinacoside întârzie senescența celulară a celulelor fibroblastice umane MRC-5.Farmazie2009,64, 752–754.

9. Wang, S.; Zheng, G.; Tian, S.; Zhang, Y.; Shen, L.; Pak, Y.; Shen, Y.; Qian, J. Echinacoside îmbunătățește funcția hematopoietică la șoareci de mielosupresie induse de 5-FU.Viața Sci.2015,123, 86–92.

10. Jia, Y.; Guan, Q.; Guo, Y.; Du, C. Echinacozid stimulează proliferarea celulară și previne apoptoza celulară în celulele epiteliale intestinale MODE-K prin reglarea transformării expresiei factorului de creștere-β1.J. Pharmacol. Sci.2012,118, 99–108.

11. Morikawa, T.; Ninomiya, K.; Imamura, M.; Akaki, J.; Fujikura, S.; Tigaie, Y.; Yuan, D.; Yoshikawa, M.; Jia, X.; Li, Z.;et al.Glicozide feniletanoide acilate, echinacozide și acteoside dinCistanche tubulosa, îmbunătăți toleranța la glucoză la șoareci.J. Nat. Med.2014,68, 561–566.

12. Yang, X.; Li, F.; Yang, Y.; Shen, J.; Zou, R.; Zhu, P.; Zhang, C.; Yang, Z.; Li, P. Eficacitatea și siguranța echinacozidei într-un model de osteopenie de șobolan.Evid. Complement bazat. Altern. Med.2013,2013, 926928.

13. Kuang, R.; Soare, Y.; Zheng, X. Suprimarea de oxid nitric implicate în efectul protector al echinacoside pe induse de H2O2 PC12 leziuni celulare.Nat. Prod. Comuniune.2010,5, 571–574.

14. Xiong, Q.; Kadota, S.; Tani, T.; Namba, T. Efectele antioxidative ale feniletanoidelor din

Cistanche deserticola.Biol. Pharm. Taur.1996,19, 1580–1585.

15. Zhang, Y.; Du, Y.; Le, W.; Wang, K.; Kieffer, N.; Zhang, J. Redox controlul supraviețuirii celulelor sănătoase și bolnave.Antioxid. Redox semnal.2011,15, 2867–2908.

16. Russo, M.T.; Blasi, M.F.; Chiera, F.; Fortini, P.; Degan, P.; Macpherson, P.; Furuichi, M.; Nakabeppu, Y.; Karran, P.; Aquilina, G.;et al.Bazinul oxidat de deoxinucleozid trifosfat este un factor semnificativ care contribuie la instabilitatea genetică în celulele cu deficit de reparare nepotrivire.Mol. Celulă. Biol.2004,24, 465–474.

17. Ventura, I.; Russo, M.T.; de Luca, G.; Bignami, M. Nucleotide purine oxidate, instabilitate genom, și neurodegenerare.Mutație. Res.2010,703, 59–65.

18. Rajendran, P.; Nandakumar, N.; Rengarajan, T.; Palaniswami, R.; Gnanadhas, E.N.; Lakshminarasaiah, U.; Gopas, J.; Nishigaki, I. Antioxidanți și boli umane.Clin. Chim. Acta2014,436, 332–347.

19. Rai, P.; Onder, T.T.; Tânăr, J.J.; McFaline, J.L.; Pang, B.; Dedon, P.C.; Weinberg, R.A. Eliminarea continuă a nucleotidelor oxidate este necesară pentru a preveni apariția rapidă a senescenței celulare.Proc. Natl. Acad. Sci. SUA2009,106, 169–174.

20. DeNicola, G.M.; Karreth, F.A.; Humpton, TJ; Gopinathan, A.; Wei, C.; Frese, K.; Mangal, D.; Yu, KH; Yeo, CJ; Calhoun, E.S.;et al.Transcrierea Nrf2 indusă de oncogene promovează detoxifierea ROS și tumorigeneza.Natură2011,475, 106–109.

21. Santos, M.A.; Faryabi, R.B.; Ergen, A.V.; Ziua, A.M.; Malachowski, A.; Canela, A.; Onozawa, M.; Lee, J.E.; Callen, E.; Gutierrez-Martinez, P.;et al.Diferențierea indusă de deteriorarea ADN-ului a celulelor leucemice ca o barieră anti-cancer.Natură2014,514, 107–111.

22. zicând: V.I.; Ibrahim, M.X.; Larsson, E.; Nilsson, J.A.; Lindahl, P.; Bergo, M.O. Antioxidantii accelereaza progresia cancerului pulmonar la soareci.Sci. Transl. Med.2014,6, 221–215.

23. Harris, I.S.; Treloar, A.E.; Inoue, S.; Sasaki, M.; Guerrini, C.; Lee, K.C.; Yung, K.Y.; Brenner, D.; Knobbe-Thomsen, C.B.; Cox, M.A.;et al.Glutation și thioredoxin căi antioxidante sinergizează pentru a conduce inițierea cancerului și progresie.Celule canceroase2015,27, 211–222.

24. Wong, H.S.; Ko, K.M. Herba Cistanches stimulează glutationul celular redox ciclism de specii reactive de oxigen generate de respirația mitocondrială în cardiomiocite H9c2.Pharm. Biol.2013,51, 64–73.

25. Struthers, L.; Patel, R.; Clark, J.; Thomas, S. Detectarea directă a 8-oxo deoxyguanosine și 8-oxoguanine de avidin și analogii săi.Anal. Biochem.1998,255, 20–31.

26. Pod, G.; Rashid, S.; Martin, S.A. REPARAREA nepotrivirii ADN-ului și deteriorarea ADN-ului oxidativ: Implicații pentru biologia și tratamentul cancerului.Cancer2014,6, 1597–1614.

27. Caldecott, KW Single-strand break repair and genetic disease.Nat. Rev. Genet. 2008,9, 619–631.

28. Episcopie, I.M.; Minn, K.; van Deursen, J.; Chen, J. p53 Proteina de legare 53BP1 este necesară pentru răspunsurile la deteriorarea ADN-ului și suprimarea tumorii la șoareci.Mol. Celulă. Biol.2003,23, 2556–2563.

29. Nakabeppu, Y. Nivelurile celulare de 8-oxo guanină fie în ADN, fie în bazinul nucleotidic joacă roluri esențiale în carcinogeneza și supraviețuirea celulelor canceroase.Int. J. Mol. Sci.2014,15, 12543–12557.

30. Colussi, D.; Brandi, G.; Bazzoli, F.; Ricciardiello, L. Căi moleculare implicate în cancerul colorectal: Implicații pentru comportamentul bolii și prevenirea.Int.J.Mol. Sci.2013,14, 16365–16385.

31. Satelli, A.; Mitra, A.; Brownlee, Z.; Xia, X.; Bellister, S.; Overman, MJ; Kopetz, S.; Ellis, L.M.; Meng, Q.H.; Li, S. Epitelial-mezenchimale tranzitate celulele tumorale circulante captura pentru detectarea progresia tumorii.Clin. Cancer Res.2015,21, 899–906.

32. Liao, X.; Lochhead, P.; Nishihara, R.; Morikawa, T.; Kuchiba, A.; Yamauchi, M.; Imamura, Y.; Qian, Z.R.; Baba, Y.; Shima, K.;et al.Utilizarea aspirinei, mutația tumorală PIK3CA și supraviețuirea cancerului colorectal.N. Engl. J. Med.2012,367, 1596–1606.

33. Domingo, E.; Biserica, D.N.; Sieber, O.; Ramamoorthy, R.; Yanagisawa, Y.; Johnstone, E.; Davidson, B.; Kerr, NJ; Tomlinson, I.P.; Midgley, R. Evaluarea mutației PIK3CA ca un predictor al beneficiului terapiei medicamentoase antiinflamatoare nesteroidiene în cancerul colorectal.J. Clin. Oncol.2013,31, 4297–4305.

34. Ahmed, D.; Eide, PW; Eilertsen, I.A.; Danielsen, S.A.; Eknaes, M.; Hektoen, M.; Lind, G.E.; Lothe, R.A. Caracteristici epigenetice și genetice ale 24 de linii celulare de cancer de colon.Oncogeneza2013,2, doi:10.1038/oncsis.2013.35.