Partea 1: Identificarea neuronilor dopaminergici care pot stabili memoria asociativă și pot termina în mod acut expresia comportamentală a acesteia

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Michael Schleyer,1* Alice Weiglein,1 Juliane Thoener,1 Martin Strauch,2 Volker Hartenstein,3

Melisa Kantar Weigelt,1 Sarah Schuller,1 Timo Saumweber,1 Katharina Eichler,4,5,6 Astrid Rohwedder,4,7 Dorit Merhof,2 Marta Zlatic,5,7 Andreas S. Thum,4,8 și Bertram Gerber1,9 ,10*

1Institutul Leibniz pentru Neurobiologie, Departamentul Genetica Învățării șiMemorie, 39118 Magdeburg, Germania, 2Institute of Imaging & Computer Vision, RWTH Aachen University, 52056 Aachen, Germania, 3Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, California 90095-1606, 4University of Konstanz, Institute pentru biologie, 78464 Konstanz, Germania, 5HHMI Janelia Research Campus, Ashburn, Virginia 20147, 6Institutul de Neurobiologie, University of Puerto Rico Medical Science Campus, Old San Juan, Puerto Rico 00901, 7Department of Zoology, University of Cambridge, Cambridge, CB{ {12}}EJ, Regatul Unit, 8University Leipzig, Institute for Biology, 04103 Leipzig, Germania, 9Centre for Behavioral Brain Sciences, 39108 Magdeburg, Germania și 10Institute for Biology, Otto von Guericke University Magdeburg, 39106 Magdeburg, Germania

O tranziție adaptativă de la explorarea mediului în căutarea resurselor vitale la exploatarea acestor resurse odată ce căutarea a avut succes este importantă pentru toate animalele. Aici studiem circuitele neuronale care permit larvelor Drosophila melanogaster de ambele sexe să negocieze această tranziție de explorare-exploatare. Facem acest lucru combinând condiționarea pavloviană cu urmărirea comportamentală de înaltă rezoluție, manipularea optogenetică a neuronilor identificați individual și analizele EM bazate pe date ale organizării sinaptice. Găsim că activarea optogenetică a neuronului dopaminergic DAN-i1 se poate stabili atâtmemorieîn timpul antrenamentului și încetează acut comportamentul de căutare învățat într-un test de reamintire ulterior. Activarea sa lasă comportamentul înnăscut neafectat, totuși. Mai exact, activarea DAN-i1 poate stabili amintiri asociative de valență opusă după antrenamentul asociat și neîmperecheat cu miros, iar activarea sa în timpul testului de rechemare poate opri comportamentul de căutare rezultat din oricare dintre aceste amintiri. Rezultatele noastre sugerează în continuare că, în semnificația sa comportamentală, activarea DAN-i1 seamănă, dar nu este egală cu recompensa de zahăr. Analizele dendrograme ale tuturor conexiunilor sinaptice dintre DAN-i1 și cele două ținte principale ale sale, celulele Kenyon și neuronul de ieșire al corpului ciupercii MBON-i1, sugerează în continuare că semnalele DAN-i1 în timpul antrenamentului și în timpul testului de reamintire ar putea fi livrate către celulele Kenyon și, respectiv, la MBON-i1, în structurile de ramificare limitate local nerecunoscute anterior. Acest lucru ar oferi un motiv elegant de circuit pentru a încheia căutarea la finalizarea cu succes.

Cuvinte cheie: dopamină; explorare-exploatare; corp de ciupercă; optogenetica; armare; căutare

Cistanchepoate îmbunătăți memoria

Declarație de semnificație

În lupta pentru supraviețuire, animalele trebuie să-și exploreze mediul în căutarea hranei. Odată ce hrana este găsită, totuși, este adaptabil să prioritizezi exploatarea acesteia față de continuarea unei căutări care ar fi acum la fel de inutilă ca căutarea ochelarilor pe care îi porți. Acest compromis explorare-exploatare este important pentru animale și oameni, precum și pentru dispozitivele tehnice de căutare. Investigăm care dintre cei doar 10 neuroni000 ai unei larve de muște a fructelor poate înclina balanța în acest compromis și identificăm un singur neuron dopaminergic numit DAN-i1 care poate face acest lucru. Având în vedere asemănările în funcția neuronului dopaminergic în regele animal-

dom, acest lucru poate reflecta un principiu general al modului în care căutarea este încheiată odată ce are succes.

Introducere

Un animal care își explorează mediul înconjurător poate folosi experiența trecută pentru a-și ghida căutarea de hrană. Când se găsește hrană, totuși, este adaptabil să se încheie căutarea și, în schimb, să se exploateze sursa de hrană. Aici studiem circuitele care permit larvelor Drosophila melanogaster să negocieze această tranziție de explorare-exploatare. Simplitatea numerică a creierului larvelor, combinată cu expresia transgenelor specifice celulei și cunoașterea conectivității sale sinaptice (Pfeiffer și colab., 2010; Li et al., 2014; Eichler și colab., 2017; Saumweber și colab., 2018; Eschbach et al., 2020), permite ca acest lucru să fie investigat la nivelul neuronilor identificați individual.

Larvele de D. melanogaster asociază cu ușurință mirosurile cu o recompensă alimentară (Scherer și colab., 2003; Gerber și colab., 2006; Schipanski și colab., 2008; Rohwedder și colab., 2012; Apostolopoulou și colab., 2014; Kudow și colab. , 2017, 2019). În mod critic, comportamentul învățat bazat pe aceste asociații miros-aliment încetează dacă în timpul unui test de rechemare recompensa este prezentă (Fig. 1A). Prin urmare, comportamentul învățat poate fi privit ca o căutare, care este terminată adaptiv de rezultatul căutat (adică de recompensă) (Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a). Comportamentul olfactiv înnăscut nu este de asemenea afectat (Fig. 1B), ceea ce sugerează că un astfel de comportament înnăscut este organizat într-o manieră asemănătoare reflexelor (Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a,b). Astfel, recompensele naturale pot induce două efecte: în timpul antrenamentului, ele oferă un semnal de recompensă care poate fi asociat cu indicii care ghidează ulterior căutarea recompensei; iar în timpul testului de rechemare, ei pot înceta în mod acut această căutare învățată, împiedicând animalele să se îndepărteze de o resursă odată ce aceasta este găsită. Această tranziție reflectă astfel o schimbare în strategia de obținere a unei recompense, nu o schimbare a motivației (adică, nu o pierdere a interesului pentru recompensă).

Nevertebrate și nevertebrate deopotrivă, neuronii dopaminergici (DAN) oferă semnale de întărire pentru învățarea asociativă (Waddell, 2013; Schultz, 2015; Kaun și Rothenfluh, 2017). În D. melanogaster, seturi distincte de DAN-uri transmit întărire apetitivă și respectiv aversivă (larve: Schroll și colab., 2006; Rohwedder și colab., 2016; Saumweber și colab., 2018; Eschbach și colab., 2020; muște adulte: Schwaerzel et al., 2003; Claridge-Chang et al., 2009; Liu et al., 2012) (un scenariu similar poate fi, de asemenea, nevertebrate emergente: Lammel et al., 2012; Groessl et al., 2018; Menegas et al., 2018; al., 2018). Stabilind o structură compartimentală, aceste DAN intersectează fibrele paralele ale celulelor Kenyon (KC), neuronii intrinseci ai centrului olfactiv de ordinul cel mai înalt al insectelor, numit corpul ciupercii. Respectând aceeași structură compartimentală, neuronii de ieșire ai corpului ciupercii (MBON) colectează informații prin KC și o trimit către circuitele eferente (vezi Fig. 2A-D) (larve: Selcho și colab., 2009; Pauls și colab., 2010). ; Eichler și colab., 2017; Saumweber și colab., 2018; Eschbach și colab., 2020; adulți: Sejourne și colab., 2011; Places și colab., 2013; Aso și colab., 2014a,b; Oswald și Waddell , 2015; Takemura și colab., 2017). În special, o reconstrucție recentă cu microscopul electronic a dezvăluit că DAN au două ținte principale: KC și MBON (vezi Fig. 2B) (larve: Eichler et al., 2017; adulți: Takemura și colab., 2017).

La larva D. melanogaster, activarea DAN din clusterul pPAM poate exercita un efect de recompensă în timpul antrenamentului (Rohwedder et al., 2016). Din cele patru zile ale acestui cluster, două pot conferi individual un astfel de efect de recompensă (DAN-h1 și DAN-i1) (Saumweber et al., 2018). Aici, am ales să ne concentrăm

Figura 1. Zahărul poate conferi recompensă și semnale de terminare a căutării. O larve au fost antrenate astfel încât un miros să fie prezentat fie împerecheat, fie neîmperecheat cu zahăr. Într-un test de rechemare ulterior, au fost testate pentru preferința lor de miros fie în absența, fie în prezența zahărului (schiță spre partea de sus). Testarea în absența zahărului a relevat olfactiv asociativmemorie, cuantificat ca PI pozitiv. Expresia comportamentală a acesteiamemoriea fost terminat în prezența zahărului. Astfel, zahărul poate conferi două tipuri de semnale: în timpul antrenamentului, oferă un semnal de recompensă care poate fi asociat cu mirosul pentru a ghida animalele mai târziu în căutarea recompensei; iar în timpul testului de rechemare, zahărul ca recompensă căutată oferă un semnal pentru a termina această căutare învățată. Dimensiunile eșantionului: N=29, N =28. B, Larvele au fost testate pentru preferința mirosului înnăscut, fie în absența, fie în prezența zahărului (schiță spre partea de sus). Zahărul nu a afectat comportamentul olfactiv înnăscut, sugerând organizarea lui asemănătoare reflexelor. Dimensiuni de eșantion: N=20 fiecare. Litere diferite deasupra diagramelor cu casete indică semnificația perechilor (testul Mann–Whitney U, p, 0.05, corectat conform Bonferroni-Holm). *Semnificație de la zero (testul semnului unui eșantion, p, 0,05, corectat conform Bonferroni-Holm). ns, nu este semnificativ. Toate testele statistice și rezultatele acestora sunt raportate împreună cu datele sursă în Figura de date extinse 1-1. Pentru valorile preferințelor de miros care stau la baza scorurilor PI ale acestui experiment, vezi Figura 9A.

Figura 2. Circuitul matricei DAN-KC-MBON. Chiasma lobului medial. Informațiile despre miros sunt procesate pentru a induce o abordare înnăscută, precum și către regiunea caliciului KC a corpului ciupercii (violet; afișat complet este un exemplu KC în partea dreaptă). Informațiile despre recompensa gustativă sunt, de asemenea, procesate pentru a ghida comportamentul înnăscut, precum și prin intermediul neuronilor modulatori aminergici (afișați este DAN-i1, turcoaz/negru) către compartimentele individuale ale lobilor corpului ciupercii (în partea stângă sunt indicate compartimentele). Fiecare dintre cele patru compartimente ale lobului medial (hk) primește input de la un singur DAN care inervează, de asemenea, același compartiment în emisfera contralaterală. MBON-urile lobului medial extrag din compartimente unice, de obicei ale ambelor emisfere (afișat este MBON-i1, magenta/galben) și își livrează ieșirea, în configurații care diferă între compartimente, de-a lungul diviziunii emisferice. În mod colectiv, MBON-urile sunt responsabile pentrumemoriecomportamentul de căutare bazat pe Datele se bazează pe Eichler et al. (2017) și Saumweber și colab. (2018). B, Matricea DAN-KC-MBON din compartimentul i. DAN-i1 și majoritatea KC-urilor stabilesc sinapse chimice reciproce și atât DAN-i1, cât și KC-urile furnizează ieșire către MBON-i1. Pentru simplitate, sunt prezentate în detaliu doar sinapsele cu neuronii DAN-i1 și MBON-i1 din stânga. Aceeași conectivitate se găsește în majoritatea, dacă nu în toate, celelalte compartimente (Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018). C, DAN-i1 (turcoaz) primește input din exteriorul corpului ciupercii (gri închis) ipsilateral de corpul său celular (regiunea etichetată 1) și apoi inervează compartimentul i în ambele emisfere (etichetate 2 și 3). MBON-i1 (magenta) traversează de două ori linia mediană; primește intrare în compartimentul i al ambelor emisfere și furnizează ieșire în regiunile adiacente corpului ciupercii ambelor emisfere. D, La fel ca în C, dar într-o vedere ușor înclinată, care arată reconstrucții ale scheletului neuronilor DAN-i1 și MBON-i1 din stânga și un exemplu KC (negru). Datele se bazează pe Eichler et al. (2017). E, Dendrograma neuronului stâng DAN-i1. Punctele colorate reprezintă sinapsele de ieșire de la DAN-i1. Triunghiurile reprezintă sinapsele de intrare către DAN-i1. Culorile reprezintă neuronul partener al sinapsei respective. Toate celelalte sinapse din corpul ciupercii sunt etichetate „Altele”. Nu sunt afișate sinapsele pe care DAN-i1 le formează cu neuronii din afara corpului ciupercii, în special în regiunea 1 (Eschbach et al., 2020). Liniile punctate indică regiunile în care neuronul traversează linia mediană a creierului. F, La fel ca în E, dar pentru neuronul MBON-i1 stâng. Nu sunt afișate sinapsele pe care MBON-i1 le formează cu neuronii din afara corpului ciupercii. Pentru versiunile de înaltă rezoluție ale neuronilor DAN-i1 și MBON-i1 din ambele emisfere, precum și toate KC-urile mature, consultați figurile de date extinse 2-1, 2-2 și, respectiv, 2-3 .

pe DAN-i1, deoarece a fost analizat anterior mai detaliat (Saumweber et al., 2018) și pentru că produce un efect de recompensă mai robust decât DAN-h1 (Saumweber și colab., 2018; date nepublicate). Mai întâi oferim o prezentare detaliată a aranjamentului spațial al tuturor sinapselor dintre DAN-i1 și ambii parteneri principali de ieșire, MBON-i1 și KC. Apoi, ne întrebăm dacă activarea optogenetică a DAN-i1 poate media nu numai un semnal de recompensă în timpul antrenamentului, ci și un semnal pentru a opri în mod acut învățat să caute recompensa în timpul testului de reamintire.

culturism cistanche

Materiale și metode

Modelul experimental și detaliile subiectului. Larvele din stadiul al treilea de hrănire de ambele sexe (D. melanogaster), în vârstă de 5 zile după depunerea ouălor, au fost utilizate pe tot parcursul. Muștele au fost menținute pe mediu standard, în cultură de masă la 25 de grade, 60% -70% umiditate relativă și un ciclu lumină/întuneric de 12/12 ore. Am luat o lingură de mediu alimentar dintr-un flacon alimentar, am selectat aleatoriu numărul dorit de larve, le-am clătit scurt cu apă de la robinet și am început experimentul.

Am folosit larve transgenice pentru a exprima canalul ionic ChR2-XXL în funcție de lumină în DAN. În acest scop, tulpina efector UAS-ChR2-XXL (Dawydow et al., 2014) (furnizată cu amabilitate de R. Kittel, Universitatea Leipzig), a fost încrucișată cu una dintre cele două tulpini driver: fie 58E{{6 }}Gal4 (Pfeiffer și colab., 2008; Liu și colab., 2012; Rohwedder și colab., 2016) (Bloomington Stock Center nr. 41347) sau tulpina de driver split-Gal4 SS00864 (Eichler și colab., 2017; Saumweber; et al., 2018) pentru a obține descendenți dublu heterozigoți. Un șofer controlează că tulpinile șoferului au fost încrucișate cu o copie locală a w1118 (Bloomington Stock Center #3605, #5905, #6326). Ca control efector, o tulpină care transportă locurile de aterizare utilizate pentru Gal4 (attP2) sau split-Gal4 (attP40/attP2), dar fără un domeniu Gal4 inserat ("gol") (Pfeiffer et al., 2010), a fost încrucișată la UAS- ChR2-XXL. Am confirmat modelul de expresie al 58E02 și SS00864 prin încrucișarea lor cu pJFRC-10xUAS-IVS-mCD8::GFP (Pfeiffer și colab., 2010) (Bloomington Stock Center #32185). Deoarece ChR2-XXL este suficient de sensibil pentru a fi activat de lumina zilei (nu este afișat), muștele au fost crescute în fiole întunecate în mod constant de ambalaj de carton negru. Pentru experimentul prezentat în Figura 8E, UAS-ChR2 (Schroll și colab., 2006) a fost încrucișat la 58E02-Gal4.

Setare experimentala. Pentru experimente comportamentale, larvele au fost antrenate în vase Petri cu diametrul interior de 9 cm și testate în vase Petri cu diametrul interior fie de 9, fie de 15 cm (ambele de la Sarstedt), așa cum se menționează în legendele figurilor, în toate cazurile umplute cu 1% agaroză (grad de electroforeză). ; Roth). Ca și mirosul, am folosit acetat de n-amil diluat 1:20 în ulei de parafină (AM; CAS: 628-63-7; Merck) și, în unele cazuri, suplimentar 1-octanol nediluat (OCT; CAS: {{ 9}}; Merck).

Experimentele au fost efectuate în interiorul unei cutii înconjurătoare de 43 43 73cm echipată cu o masă luminoasă personalizată cu o matrice LED de 24 12 (470nm; Solarox) și o placă de difuzie de 6-mm grosime din plexiglas mată. deasupra pentru a asigura o lumină albastră uniformă pentru activarea ChR2-XXL (120 mW/cm2). Vasele Petri au fost plasate direct deasupra plăcii de difuzie. Vasele Petri au fost înconjurate de un inel de difuzie din polietilenă; în spatele inelului de difuzie, au fost montate 30 de LED-uri cu infraroșu (850 nm; Solarox) pentru a oferi o iluminare care era invizibilă pentru larve, dar a permis înregistrarea și urmărirea comportamentului acestora pentru analiza offline. În acest scop, deasupra plăcii Petri a fost plasată o cameră (Basler acA204090umNIR; Basler) echipată cu un filtru de trecere în infraroșu. Pentru detalii suplimentare cu privire la configurația experimentală, a se vedea Saumweber și colab. (2018).

culturism cistanche

Învățare asociativă miros-zahăr. Experimentele de învățare au urmat protocoalele stabilite (Michels și colab., 2017). Recipientele cu mirosuri au fost pregătite prin adăugarea a 10 ml de substanță mirositoare în recipiente de teflon personalizate (5 mm diametru interior cu un capac perforat cu 7 găuri de 0,5 mm diametru fiecare). Cutiile Petri au fost acoperite cu capace modificate perforate în centru cu 15 găuri de 1 mm diametru fiecare pentru a îmbunătăți aerarea.

Pentru antrenamentul cu miros-zahăr, 20 de larve au fost plasate în mijlocul unui vas Petri umplut cu agaroză care conținea 2mol/L D-fructoză (CAS: 57-48-7; Roth) ca recompensă (1) și echipate cu două mirosuri. containere pe părți opuse, ambele umplute cu AM (AM1). După 2,5 minute, larvele au fost deplasate pe un vas Petri proaspăt cu agaroză simplă, fără gust, echipat cu două recipiente goale (EM), unde au petrecut și 2,5 minute. Au fost efectuate trei astfel de cicluri de antrenament „pereche”, în fiecare caz folosind plăci Petri proaspete. În jumătate din cazuri, antrenamentul a început cu plăci Petri care conțineau recompensă, așa cum este indicat (AM1/EM), în timp ce în cealaltă jumătate a cazurilor secvența a fost inversată (EM/AM1). Pentru fiecare cohortă de larve antrenate AM1/EM (sau EM/AM1), o a doua cohortă a fost antrenată reciproc, adică prin prezentări „nepereche” de miros și recompensă (AM/EM1, sau respectiv EM1/AM).

După antrenament, larvele au fost transferate în mijlocul unei plăci Petri de testare și testate pentru preferința lor de miros. Important este că testul de rechemare a fost efectuat fie pe o placă Petri simplă pentru evaluarememoriecomportament de căutare bazat pe o placă Petri care conține recompensă pentru a determina dacă prezența recompensei a încheiatmemorie-căutare bazată. În ambele cazuri, o parte a plăcii Petri de testare a fost echipată cu un recipient AM și cealaltă parte cu un recipient EM. Numărul de larve de ambele părți a fost determinat din imaginea camerei la 3 minute după începerea testului. Din aceste cifre, o preferință de miros a fost calculată după cum urmează:

Astfel, valorile PI pot varia de la 1 la 1, valorile pozitive indicând că larvele au preferat mirosul mai mult după antrenamentul pereche decât neîmperecheat. Valorile pozitive ale PI indică în consecință un asociativ apetitivmemoriecare este cel mai bine interpretat camemoriecomportamentul de căutare bazat pe Valorile negative ale PI, dimpotrivă, indică asociativ aversivmemorie.

Învățare asociativă prin activare optogenetică DAN. Pentru experimentele optogenetice, instruirea și testarea au fost efectuate în mod analog. Cu toate acestea, toate vasele Petri au fost umplute cu agaroză simplă (adică, nu s-au folosit substanțe gustative recompensatoare). În schimb, pentru antrenamentul în pereche, AM a fost asociat cu stimularea continuă cu lumină albastră pentru a activa fie 58E02-DAN sau 864- DAN timp de 2,5 minute, urmat de 2,5 minute de întuneric fără miros (AM1/EM). Pentru antrenamentul nepereche, prezentarea mirosului și stimularea luminii au avut loc separat (AM/EM1). Pentru experimentul prezentat în Figura 8E, mirosul și lumina au fost prezentate timp de 5 minute fiecare; acel experiment a urmat altfel procedurile descrise de Rohwedder et al. (2016).

După trei astfel de cicluri de antrenament, a fost efectuat testul de reamintire, iar preferința de miros și PI au fost calculate așa cum este descris. În mod critic, testul de rechemare a fost efectuat fie fără activarea luminii albastre pentru a determina dacă DAN-urile mediază un semnal de recompensă în timpul antrenamentului, fie cu activarea luminii albastre pentru a determina dacă, în plus, DAN-urile pot media un semnal pentru a termina căutarea.

Variațiile acestui protocol sunt indicate în legendele figurilor.

Comportamentul olfactiv înnăscut. Recipientele cu mirosuri și plăcile Petri au fost preparate așa cum este descris mai sus. Cohorte de 20 de larve au fost colectate din flacon, spălate pentru scurt timp în apă de la robinet și plasate pe un vas Petri cu un recipient AM pe o parte și un recipient gol pe cealaltă parte. După 3 minute, preferința de miros înnăscut a fost determinată conform ecuației 1. Acest test de preferință a fost efectuat fie în absența, fie în prezența zahărului, fie în absența sau în prezența activării luminii albastre, pentru a determina dacă aceste condiții de testare se modifică. comportament olfactiv înnăscut.

Analiza modulațiilor comportamentale după antrenament cu activarea 864-DAN. Comportamentul larvelor a fost urmărit video și analizat așa cum este descris în detaliu de Paisios și colab. (2017). Pe scurt, au fost analizate două aspecte ale chemotaxiei larvare. În primul rând, modulația castrarii capului (HC pe secundă) (HC/s) a fost calculată după cum urmează:

În această măsură, unghiul de direcție (HA) descrie orientarea capului animalului în raport cu mirosul, cu unghiuri de direcție absolute (abs (HA)) de 0 grade sau 180 de grade, de exemplu, indicând că mirosul este în fața sau, respectiv, în spatele larvelor. Această măsură oferă astfel scoruri pozitive pentru atracție (adică, atunci când HC direcționează larvele spre mai degrabă decât departe de ținta mirosului), în timp ce dă scoruri negative pentru aversiune.

Imunohistochimie. Creierele larvelor au fost disecate în soluție salină fără Ca{{{0}}și fixate în soluție Bouin diluată 1:2 cu soluție salină fără Ca{21-pentru 7 minute. Trei etape de spălare (fiecare 10 minute) în PBST (0,3 procente Triton-X 100 în PBS) au fost urmate de incubarea cu anticorpii primari peste noapte la 4 grade. După trei spălări (fiecare 10 minute) în PBS, țesutul a fost incubat cu anticorpii secundari timp de 1 oră la temperatura camerei. După trei etape finale de spălare în PBS (fiecare 10 min), probele au fost montate în Vectashield (Vector Laboratories). Preparatele au fost examinate la un microscop confocal DM 6000 CS (Leica Microsystems).

culturism cistanche

Ca anticorpi, am folosit fie anticorp monoclonal anti-FASII de șoarece (DSHB, diluat 1:50 în soluție de blocare care conține 4% ser normal de capră) și anticorp de iepure anti-GFP (A11122, Invitrogen, diluat 1:1{). {28}}00 în soluție de blocare care conține 4% ser normal de capră) ca anticorpi primari și anticorp Cy3 anti-șoarece (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories) și Alexa-488 anti-iepure anticorp (A11034, Invitrogen), ambele diluate 1:200 în PBS, ca anticorpi secundari; sau am folosit anticorp monoclonal anti-ChR2 de șoarece (ProGen Biotechnik) diluat 1:100 în 0,3% PBST ca anticorp primar, anticorp Cy3 anti-șoarece (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories), diluat 1:300 în 0,3% PBST , ca anticorp secundar și Alexa-488 anti-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories), diluate 1:300 în 0,3% PBST, pentru contracolorare.