Partea 1: Proteinuric boala renală cronică este asociată cu alterarea duratei de viață a celulelor roșii din sânge, deformarea și metabolismul

Persoană de contact: emily.li@wecistanche.com

Rosi Bissinger, et al

¹Divizia de Endocrinologie, Diabetologie și Nefrologie, Departamentul de Medicină Internă, Spitalul Universitar Tübingen, Tübingen, Germania;²Departamentul de Biochimie și Genetică Moleculară, Campusul Medical Al Universității din Colorado Anschutz, Aurora, Colorado, SUA;³Divizia de Hematologie, Universitatea din Colorado Denver, Aurora, Colorado, SUA;⁴Institutul de Medicină Sportivă Moleculară și Celulară, Universitatea Germană de Sport din Köln, Köln, Germania;⁵Institutul de Cercetare a Diabetului și Boli Metabolice (IDM) al Centrului Helmholtz München din cadrul Universității Tübingen, Tübingen, Germania;⁶Centrul German de Cercetare a Diabetului (DZD) de la Universitatea Tübingen, Tübingen, Germania;⁷Centrul de Medicină Clinică Transfuzională, Spitalul Universitar din Tübingen, Tübingen, Germania;⁸Departamentul de Patologie, Universitatea Eberhard Karls din Tübingen, Tübingen, Germania;⁹Departamentul de Dermatologie, Universitatea Eberhard Karls din Tübingen, Tübingen, Germania;¹⁰Institutul de Biologie Orală, Facultatea de Stomatologie, Universitatea din Oslo, Oslo, Norvegia;¹¹Departamentul de Medicină, Centrul Medical Universitar Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germania; și¹²Facultatea de Științe ale Sănătății, Ontario Tech University, Oshawa, Ontario, Canada

Anemia este o complicație comună aboli cronice de rinichi, afectând calitatea vieții pacienților. Printre diverși factori, cum ar fi deficitul de fier și eritropoietină, reducerea duratei de viață a celulelor roșii din sânge (RBC) a fost implicată în patogeneza anemiei. Cu toate acestea, datele mecaniciste privind disfuncția RBC in vivo înboli de rinichilipsesc. Aici, descriem dezvoltarea anemiei cronice asociate bolilor renale la șoarecii cu boală de rinichi proteinurică care rezultă fie din administrarea de doxorubicină, fie dintr-o deficiență inductibilă de podocină. În ambele modele experimentale, anemia s-a manifestat în ziua 10 și a progresat în ziua 30, în ciuda creșterii nivelului de eritropoietină circulantă și a eritropoiezei în măduva osoasă și splină.

RBCs circulant în ambele modele de mouse-ul afișat morfologie modificată și deformabilitate diminuat osmotic-sensibile, împreună cu creșterea phosphatidylserine externalizare pe membrana plasmatică exterioară, un semn distinctiv al morții RBC. Etichetarea fluorescenței-CRB în ziua 20 a șoarecilor cu indusă de doxorubicinăboli de rinichia relevat clearance-ul prematur din circulație. Analizele metabolomice ale RBCs de la ambele modele de șoarece au demonstrat modificări temporale ale căilor de reciclare redox și ale ciclului Lands, un proces de remodelare a lipidelor cu membrană. Pacienți anemici cu proteinuricboli de rinichia avut o proporție crescută de RBCs fosfatidilserine-pozitive circulante.

Astfel, observațiile noastre sugerează că reducerea duratei de viață a RBC, mediată de metabolismul RBC modificat, deformabilitatea redusă a RBC și moartea celulară îmbunătățită contribuie la dezvoltarea anemiei în proteinuricăboli de rinichi.

Kidney International (2021) 100, 1227–1239; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2021.08.024

CUVINTE CHEIE:Cistanche, beneficiile Cistanche,boli de rinichi,insuficiență renală,boli cronice de rinichi, anemie, moarte celulară; deformare, ciclul terenurilor; metabolismul; proteinurie; celule roșii din sânge; reciclarea redox

Copyright ª 2021, International Society of Nephrology. Publicat de Elsevier Inc Acesta este un articol cu acces liber sub licența CC BY-NC-ND

Beneficiile Cistanche funcția renală.

Declarație de traducere

Acest studiu demonstrează că proteinuricboli de rinichiîn modelele murine duce la clearance-ul prematur al celulelor roșii din sânge (RBC), provocând în cele din urmă dezvoltarea anemiei. Creșterea decesei RBC apare, de asemenea, la pacienții cuboli cronice de rinichiși anemie. Disfuncția RBC în mediul uremic este un mecanism important pentru pierderea RBC și dezvoltarea anemiei asociate bolilor renale, indiferent de secreția endogenă de eritropoietină.

Dezvoltarea anemiei este o complicație tipică a avansăriiboli cronice de rinichi(CKD) și este asociată cu afectarea calității vieții1 și cu un risc crescut de evenimente cardiovasculare²și spitalizarea,³precum și declinul cognitiv.4 Severitatea anemiei a fost privită ca un predictor independent al mortalității atât la pacienții cu CKD dependenți de dializă, cât și la cei care nu depind de dializă.⁵Fiziopatologia anemiei asociate bolilor renale este complexă și implică deficit de fier și eritropoietină (EPO) în stabilirea inflamației de grad scăzut, care, la rândul său, compromite eritropoieza normală la pacienții cu CKD.6 În CKD avansat, răspunsul EPO este inadecvat de scăzut în raport cu gradul de anemie.^7,8Prevalența ridicată a deficitului concomitent de fier în CKD este o consecință a homeostaziei perturbate a fierului.⁹Un mecanism neglijat de pierdere a fierului în CKD este proteinuria, care poate duce la pierderi urinare de fier legat de transferină (până la 0,3 mg/d) atunci când proteinuria atinge intervalul nefrotic.¹⁰

Un alt factor care este gandit pentru a contribui la anemie la pacienții cu CKD este scurtarea duratei de viață a celulelor roșii din sânge (RBCs), descris pentru prima dată >60 de ani în urmă.^6,11,12Un studiu recent care a folosit un test de respirație cu monoxid de carbon a demonstrat că durata de viață a RBC a scăzut progresiv de la 120 de zile la pacienții cu stadiul 1 CKD la 60 de zile la pacienții cu stadiul 5 CKD.¹³În special, transfuzia de RBCs alogene de la donatori sănătoși la pacienții cu CKD a fost urmată de o clearance-ul rapid al RBCs transfuzat fără dovezi de hemoliză.¹²Un mecanism plauzibil pentru această observație poate fi stimularea unei morți celulare asemănătoare apoptozei în RBCs anucleate, denotând un model de prejudiciu în care integritatea membranei celulare nu este compromisă și conținutul citoplasmatic rămâne intact.¹⁴RBCs în curs de moarte celulară prezintă diverse modificări morfologice care rezultă din deteriorarea cito-scheletice, cum ar fi formarea bleb de suprafață, pierderea elasticității membranei, și / sau deshidratare celulară.¹⁵La nivel molecular, moartea RBC este asociată cu acumularea intracelulară de Ca2þ, starea de energie celulară modificată și defalcarea asimetriei fosfolipidelor, ducând în cele din urmă la externalizarea fosfatidilserinei (PS) pe membrana plasmatică exterioară.^15,16În consecință, macrofagele și celulele dendritice specializate recunosc rapid RBCs externalizate ps, ceea ce duce la eriofagotoză și catabolismul lor în splină și ficat.¹⁷

Din cauza fiziopatologie confuz de boli de rinichi asociate anemie la om, studiile pe animale sunt justificate pentru a indica mecanismele care contribuie. Nefropatie indusă de doxorubicină (DIN) la șoarecii 129S1/SvImJ18 și șoarecii cu deficit de podocin inductibilă (Nphs2Dipod)¹⁹sunt 2 modele care se caracterizează prin inducerea proteinuriei din gama nefrotică în câteva zile, progresia spreinsuficiență renalădupă 3 săptămâni și moartea în 6 până la 7 săptămâni.^19–21Ambele modele de șoarece recapitulează în mod eficient toate etapele CKD umane. În studiul de față, am testat dacă progresivăinsuficiență renalăla acești șoareci cu proteinuricboli de rinichiafectează durata de viață a RBC și contribuie la anemie. În paralel, am examinat fenotipul RBC în sânge prelevat de la pacienții cu CKD cu proteinurie din gama nefrotică.

Cistanche trateaza dieaza renala cronica si protejeaza rinichii

METODE

Informații detaliate despre materiale și metode sunt furnizate în materialele și metodele suplimentare.

Studii de șoarece

Experimentele au fost efectuate pe șoareci de 8 săptămâni de tip sălbatic 129S1/SvImJ de ambele sexe (Charles River). DIN a fost indusă printr-o singură injecție de doxorubicină (14,5 mg/g greutate corporală), așa cum s-a descris anterior.^18,22Pentru a controla efectul mielotoxic al doxorubicinei care nu are legătură cu dezvoltarea nefropatiei, șoarecii C57BL/6 rezistenți la doxorubicină au fost, de asemenea, supuși aceluiași protocol de tratament.23 În plus, experimente similare au fost efectuate pe șoareci de 8 săptămâni cu ștergere inductibilă a podocinei (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G]8Jhm*Tg[tetO-cre]1Jaw) sau șoareci Nphs2Dipod, care au fost tratați cu doxiciclină timp de 14 zile.¹⁹Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu Ghidul Institutelor Naționale de Sănătate pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator și legea germană pentru bunăstarea animalelor, cu aprobarea autorităților locale (Regierungspräsidium Tübingen, numerele de aprobare M12/17 și M17/19G).

Proiectarea experimentală a studiilor pe șoarece este prezentată în figura suplimentară S1.

Pacienţii

Studiul pacientului a fost realizat în conformitate cu Declarația de la Helsinki și a fost aprobat de comitetul local de etică al Spitalului Universitar Tübingen (556/2018BO2). Probele de sânge și urină litiu-heparină au fost obținute de la pacienții cu proteinurie cu rază nefrotică și rata de filtrare glomerulară conservată (RFG; stadiile 1-2; n 10) și de la pacienții cu GFR redus (stadiul CKD 3-5; n 15) la Spitalul Universitar Tübingen. Ca grup de control, sângele de la voluntari sănătoși potriviți vârstei și sexului (n 25) a fost furnizat de banca de sânge a Spitalului Universitar Tübingen. Toate probele umane au fost prelevate după consimțământul informat. Caracteristicile clinice ale pacienților sunt menționate în tabelul 1.

Analize de citometrie a fluxului

Diferiți parametri ai morții celulelor RBC au fost determinați de citometria fluxului.¹⁴Pentru a determina durata de viață a RBC in vivo, 25 ml de colorant de 5,6-car- boxyfluorescein diacetat succinimidyl [5(6)-CFDA, SE] colorant a fost injectat la o concentrație de 9,96 mM (solubilizat în dimetilsulfoxid) în plexul retro-orbital de tip sălbatic 129S1/SvImJ și șoareci cu injecție de doxorubicină, așa cum este descris anterior.²⁴La punctele de timp indicate, sângele a fost extras din plexul retro-orbital al șoarecilor, iar procentul de 5(6)-CFDA, celulele SEþ a fost detectat prin analiza citometriei de flux. În cele din urmă, datele au fost analizate folosind software-ul FlowJo (FlowJo LLC).

Deformabilitatea RBC și deformabilitatea RBC deektacitometrie cu gradient osmotic au fost măsurate cu ajutorul analizorului optic de celule rotative asistate cu laser (LORCA MaxSis; RR Mecatronica), care a fost descrisă în detaliu în altă parte.²⁵Analizele deektacitometrie cu gradient osmotic (osmoscan) au fost, de asemenea, efectuate cu ajutorul LORCA MaxSis și au măsurat deformabilitatea în diferite condiții osmotice.²⁶

Examenul histologic

Pentru colorarea hematoxilinei și a eozinei, splinele și femurul au fost colorate cu hematoxilină și eozină. Toate lamele au fost colorate cu anticorpul primar Ter 119 (BD Pharmingen; diluție 1:500). Pentru colorarea periodică a acidului-Schiff, feliile de rinichi cu grosimea de 2,5 mm au fost colorate cu reactiv periodic acid-Schiff (Carl Roth) și hematoxilină (abcam). Colorarea mai-Grünwald-Giemsa (metoda Pappenheim) a fost efectuată pentru a determina modificările de formă RBC, așa cum este descris înainte de vicios.²⁷Izolarea glomerulilor s-a făcut prin utilizarea unei abordări de biotinilare și sortare celulară.¹⁹Pentru detectarea proteinelor podocinului, a fost aplicat un anticorp de la Sigma (P0372).¹⁹Roti-Mount Fluor Care 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Carl Roth) a fost folosit pentru a pata nucleele.

Metabolomica cromatografiei lichide ultra-performante-spectrometrie de masă de la RBCs mouse-ul

Analizele au fost efectuate așa cum au fost publicate anterior.²⁸Pe scurt, platforma analitică utilizează un sistem de cromatografie lichidă ultra-performantă Vanquish (Thermo Fisher Scientific) cuplat online la un spectrometru de masă Q Exactive (Thermo Fisher Scientific).

Analize statistice

Datele sunt furnizate ca mijloace aritmetice SEM sau ca mediană cu intervalul interquartile (percentila 25-75) cu n reprezentând numărul de animale utilizate sau, respectiv, de pacienți incluși. Datele au fost testate pentru normalitate cu testul Kolmogorov-Smirnov, testul D' Ag-ostino și testul Shapiro-Wilk. Varianțele au fost analizate de testul Bartlett pentru variații egale. Tukey sau Dunn multiple-comparație posttest, nepereche Student t test, sau Mann-Whitney U test a fost efectuat de GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). P< 0.05="" with="" 2-tailed="" testing="" was="" considered="" statistically="" significant.="" additional="" graphs="" were="" plotted="" through="" graphpad="" prism="">

REZULTATELE

Boala renală proteinurică experimentală induce anemie la șoareci

După inducție, șoarecii 129S1/SvImJ cu șoareci DIN și Nphs2Dipod au dezvoltat proteinurie cu interval nefrotic (Figura 1a și figura suplimentară S2C) și progresivăinsuficiență renalăcaracterizată prin niveluri ridicate de uree plasmatică începând cu ziua 20 (figura 1b și figura suplimentară S2D). În primele 10 zile, șoarecii au experimentat creșterea greutății corporale cu ascită (Figura 1c și figura suplimentară S2E), reflectând retenția de sodiu cauzată de excreția proteazelor serine sau a proteasuriei.¹⁸După inversarea spontană a retenției de sodiu, acești șoareci au pierdut în mod constant în greutate. La șoarecii cu DIN și la șoarecii Nphs2Dipod, imaginile de microscopie ușoară, capturate după 10 zile, au evidențiat modificări histomorfologice tipice în concordanță cu scleroza glomerulară segmentară focală (Figura 1d și figura suplimentară S2B). Acestea au fost absente la șoarecii C57BL/6 injectați cu doxorubicină (Figura 1d). Tratamentul cu doxorubicină a indus o scădere puternică a hemoglobinei, a numărului de RBC și a hematocritului (Figura 1e-g) din ziua 10 la șoarecii 129S1/SvImJ și C57BL/6, care în acestea din urmă au fost normalizate în zilele 20 și 30. În schimb, în zilele 20 și 30, șoarecii cu deficit de doxorubicină 129S1/SvImJ și cu deficit de podocin au dezvoltat anemie progresivă, caracterizată prin reducerea volumului corpuscular mediu (Figura 1h) și reducerea hemoglobinei (Figura suplimentară S2F), sugerând că anemia este asociată cu progresivăinsuficiență renalăși nu cu tratament cu doxorubicină în sine.

Anemia în boala renală proteinurică experimentală nu este cauzată de eritropoieza compromisă

Ambele modele de șoarece anemice au prezentat o creștere semnificativă a procentului de reticulocite circulante (figura 2a și figura suplimentară S3C). Concentrațiile plasmatice de EPO au crescut dramatic în ziua 10 în 129S1/SvImJ cu DIN și șoareci sănătoși C57BL/6, dar au fost normalizați din nou în zilele 20 și 30 (Figura 2b). La șoarecii cu deficit de podocin, concentrațiile plasmatice de EPO au crescut în ziua 10 și au rămas crescute în zilele 20 și 30 (Figura suplimentară S2H). În analizele histologice din măduva osoasă și splină, numărul de celule precursoare ale eritroizilor în comparație cu precursorii mieloidi a crescut în ziua 30 (Figura 2d-g), indicând stimularea eritropoiezei la șoarecii anemici 129S1/SvImJ cu DIN.

Durata de viață redusă a RBC este cauza principală a anemiei în boala renală proteinurică experimentală

Externalizarea PS pe prospectul exterior al membranei plasmatice RBC este un indicator al morții celulare și un promotor al eriofagocitozei.14 Moartea celulelor RBC a fost cuantificată cu ajutorul analizelor de sortare a celulelor activate cu fluorescență ale suprafeței fluorescente anexain V-legat PS.¹⁴În sângele proaspăt extras, procentul de celule care expun PS a fost de >4 ori mai mare în ziua 20 la șoarecii cu DIN (4,16% T 0,86%) în comparație cu șoarecii sănătoși (1,00% 0,11%) (Figura 3a). În mod similar, șoarecii Nphs2Dipod au arătat o creștere de aproximativ 2 ori a expunerii la PS (1,27% T 0,20%) în comparație cu șoarecii sănătoși (0,58% 0,05%) în ziua 30 (Figura suplimentară S3A). Se știe că RBCs sunt eliminate din circulație de macrofagele care locuiesc în splină.¹⁷Prin urmare, această observație poate explica raportul mai mare splină/greutate corporală al șoarecilor Nphs2Dipod (Figura suplimentară S2G), în care de două ori mai multe RDC-uri sunt degradate în comparație cu șoarecii sănătoși C57BL/6.

Deoarece proteinuria din gama nefrotică duce la disproteinemie,²⁹am investigat în continuare dacă moartea îmbunătățită a celulelor RBC poate fi stimulată de o componentă din plasma șoarecilor cu DIN. După cum se descrie în figura 3b, expunerea la PS în zilele 10 și 20 a fost de două ori mai mare după incubarea (30 de minute la 37 ○C) a RBCs sănătoase în plasmă de șoareci 129S1/ SvImJ injectați cu doxorubicină, comparativ cu incubarea în plasmă a șoarecilor sănătoși. Afluxul de ca2þ în RBCs, mediat de canale de cationi neselective independente de tensiune și tensiune,30,31 este unul dintre regulatorii cheie ai morții celulelor RBC. În RBCs colectate în zilele 20 și 30 de la șoareci 129S1/SvImJ cu DIN, concentrațiile intracelulare de Ca2þ au fost crescute (Figura 3c); acest

fenomenul a fost recapitulat la șoarecii Nphs2Dipod în ziua 20 (Figura suplimentară S3B).

La ambele modele de șoarece, a existat o corelație negativă semnificativă a procentului de RBCs PS-pozitiv, cu severitatea anemiei reflectată de nivelurile hemoglobinei (Figura 3d și Figura suplimentară S3D). În plus, a existat o corelație sig- nificantă cu leziunile renale reflectate de concentrația plasmatică de uree (figura 3e și figura suplimentară S3E) și într-o măsură mai mică cu proteinuria (figura 3f și figura suplimentară S3F). Pentru a compensa pierderea RBC în anemie, formarea de noi RBCs a fost stimulată la ambii șoareci, după cum indică procentul crescut de reticulocite circulante, și a fost semnificativ corelată cu magnitudinea ps- expunerea RBCs (Figura 3g și figura suplimentară S3G).

^{ClicAICIpentru partea 2.}