Partea 2: Calpastatina previne angiotensina il-mediate podocite prejudiciu prin menținerea autofagie

Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls click aici la partea 1

Pls click aici la partea 3

Angel + HSD activează activitatea calpain în podocite care contribuie la blocarea autofagiei

Ca activitatea calpain a fost găsit (i) pentru a fi activat de Angel în mai multe tipuri de celule și (ii) pentru a lipi mai multe proteine legate de autofagie, ne-am întrebat dacă AngII + HSD-mediate autofagie blocada ar putea fi atribuite la creșterea activității induse de Angl calpain. Curtea a constatat mai întâi că podocite primare exprimau cele 3 forme omniprezente de calpaine (Figura 3a). Am arătat apoi că AngII a stimulat activitatea calpainei în podocite primare. Această creștere a activității calpainei a fost blocată de un inhibitor selectiv al calpainei (Figura 3b). Am folosit un mouse knock-in cu expresie transgenă calpastatină suplimentară (ceea ce duce la scăderea activității calpain)pentru a evalua rolul calpainelor în AngII + HSD-mediaterinichiPrejudiciuși blocarea autofagiei. Podocite primare de la Șoareci CST'g au arătat scăderea activității calpain ca răspuns la AngII în comparație cu podocite de la șoareci de control (Figura 3c). Astfel, supraexpresia calpastatinei în podocite a scăzut activarea calpainei mediată de AngII.

Cistanchetubulosaare multeEfecte, click aici pentru a afla mai multe

Am evaluat în continuare nivelurile de autofagie la podocite de la șoareciI CSTTg. Am generat șoareci CST cu transgene GFP-LC3. Reporterul LC3-GFP a permis numărarea autofagozomilor ca puncte GFP+/P62+. P62 se va acumula în agregate în celule atunci când fluxul autofag este blocat. La starea bazală, am numărat mai puține puncte GFP+ P62+ (Figura 4a, b și e) și mai puțină acumulare de P62 (Figura4c, d și f)în podocite de șoareci CST1g GFP-LC3 decât în podocite de normal

Figura 4| Evaluarea fluxului autofag în podocite de șoareci calpastatină transgenică (CST9). (a,b) Imagini reprezentative de imunofluorescență a expresiei proteinei fluorescente verzi (GFP)(verde) și P62 (roșu) în glomeruli de la șoareciI GFP-LC3 și CST'GFP-LC3 de 12 săptămâni. Vârfurile de săgeată indică autofazomii GFP+ P62+. (c,d) Imagini reprezentative de imunofluorescență a expresiei P62 (verde) și Podocalyxin (PODXL; roșu) în glomeruli de la șoareci GFP-LC3 și CST'9 GFP-LC3 de 12 săptămâni. Capitolele figurii cu prim indică o mărire mai mare. Nucleele au fost colorate cu Hoechst (albastru). Bare = 50 μm. (e) Cuantificarea numărului de puncte CL3+ P62+ per podocite. Test Mann-Whitney:**P=0,0065. (f) Cuantificarea suprafeței P62+ pe secțiune glomerulară. Test Mann-Whitney:*P= 0.0420.In(e,f), n =5 șoareci GFP-LC3 și n =8 șoareci CST'9 GFP-LC3. Valorile sunt prezentate ca parcele individuale și medie± SEM. Pentru a optimiza vizualizarea acestei imagini, vă rugăm să consultați versiunea online a acestui articol la șoarecii GFP-LC3, sugerând creșterea fluxului autofag în podocite de șoareci cu abundență mare de calpastatină.

Fluxul autofag poate fi monitorizat prin măsurarea conversiei formei citoplasmatice de LC3, LC3-I, la forma autophagosomală despicată și cuplată cu fosfatidilletanolamină de LC3, CL3-II, pe pata de Vest. Podocite de la șoareci CST au arătat creșterea conversiei LC3-I la LC3-II și scăderea expresiei P62, atât în prezența, cât și în absența bafilomicinei A,(Figura 5a și b), indicând un flux autofagic crescut în podocite cu supraexpresie calpastatină. În cele din urmă, acumularea de puncte GFP+P62+ în podocite după administrarea clorochinei a fost mai importantă la șoarecii CST'g GFP-LC3 decât la șoarecii GFP-LC3, confirmând astfel că supraexpresia calpastatinei duce fluxul autofag în podocite in vivo (Figura 5c-e). În total, datele noastre sugerează că AngII stimulează activitatea calpainei în podocite, că autofagia este inhibată de calpaină în podocite și că inhibarea activității endogene a calpainei prin supraexprimarea calpastatinei este suficientă pentru a stimula fluxul autofag în podocite.

Șoarecii CSTT9 sunt protejați de leziunile podocitelor induse de Angel + HSD

CSTT: șoarecii nu au arătat niciunarinichimodificarea până la vârsta de cel puțin 12 luni (figura suplimentară S5). Am analizat leziunile podocitelor la șoarecii CST'号 în timpul tratamentului cu AngII + HSD. Deși șoarecii WT au dezvoltat o ușoară glomeruloscleroză și leziuni ale podocitelor după 4 săptămâni de hipertensiune arterială, după cum arată expresia anormală a podocalipinei și a nefrinei, șoarecii CSTTg au prezentat mai puține leziuni glomerulare sclerotice(Figura 6a

Figura 5| Blocarea degradării autophagosomale a confirmat creșterea fluxului autofag al podocitelor la șoarecii transgenici calpastatină (CSTT). (a) Analiza western blot a expresiei LC3. Sechestrabil 1(SOSTM1)/P62 și ATG5 în podocite primare de tip sălbatic (W sau CST'9mice. Expresia tubulinei servește ca normalizare. Podocitele au fost tratate sau nu cu bafilomicină A1(BafA1; 100 nM) timp de 4 ore înainte de arestarea culturii. (b) Cuantificarea raporturilor LC3-ll/'tubulină și P62/tubulină.n = 10 Șoareci WT și n =8 Șoareci CST'9. Valorile sunt prezentate ca parcele individuale și media ± SEM. Analiza bidirecțională a varianței asociată pentru tratament: pentru CL3-ll/tubulină: genotip, P= 0,0008;tratament, P<0.0001; for="" p62/tubulin:="" genotype,="" p="0.0884;" treatment,="">< 0.0001.sidak's="" multiple="" comparison="" test:="" for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus="" wt+=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+bafa1,"*p="0.0028" for="" wt+bafa1="" versus="" cstt9="" +bafa1:for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+="" bafa1.(c,d)representative="" immunofluorescence="" images="" of="" the="" expression="" of="" green="" fluorescent="" protein="" (gfp;="" green)="" and="" p62="" (red)="" in="" glomeruli="" from="" 12-week-old="" gfp-lc3="" and="" cst'9="" gfp-lc3="" mice.="" figure="" subparts="" with="" prime="" indicate="" higher="" magnification.="" nuclei="" were="" stained="" with="" hoechst="" （blue）.="" bars="50" μm.="" mice="" were="" treated="" with="" chloroquine（cq;="" 80="" mg/kg）="" 4="" hours="" before="" killing.="" the="" arrowheads="" indicate="" gfp+="" p62+autophagosomes.="" (e)="" quantification="" of="" the="" number="" of="" lc3+="" p62+="" dots="" per="" podocyte.="" n="5" mice="" per="" genotype.="" values="" are="" presented="" as="" individual="" plots="" and="" mean="" ±="" sem.="" unpaired="" t-test="" with="" equal="" sd:*p="0.0302." to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">rinichi-international.org.

Figura 6| Supraexpresia calpastatinei previne angiotensina Il (Angel)+ dieta bogata in sare (HSD)-mediate podocite prejudiciu. (a,b)

Cistanchepoate scutiboli de rinichi

Imagini reprezentative ale secțiunilor tricrome de glomeruli de tip sălbatic (WT și calpastatină transgenică (CST'9) șoareci după 6 săptămâni de Angll + HSD. Bare = 50 um. (c,d,f,g) Imagini reprezentative de imunofluorescență a expresiei (c,d) Podocalyxin (PODXL) și (f,g)nefrină (NPHS1)în WT și CST'9mice după 6 săptămâni de cuantificări asociate Angel +HSD și (e,h). Bare = 50 um. (ii)

cistanchepoate tratainsuficiență renală acută

Imagini reprezentative imunofluorescență a expresiei tumorii Wilm 1 (WT1; verde) și PODXL (roșu) în glomeruli de la WT și CST'șoareci după 6 săptămâni de Angel +HSD și (k) cuantificarea asociată a numărului de celule WT1+ pe secțiune glomerulară. Nucleele au fost colorate cu Hoechst (albastru). Bare = 50 um. În (e,h,k), valorile sunt prezentate ca parcele individuale și media ± SEM,n = 9 șoareci WT și n = 7 șoareci CSTTg. Test t nepereche cu SD egal:**P=0,0095 in (e),*P=0,0249 in (h), P=0,7891 in (k).

și b)și expresia podocalyxin și nefrină conservată (Figura 6c-h). Astfel de diferențe în fenotipul podocitelor au fost observate într-un stadiu în care densitatea nucleelor podocitelor nu era diferită între WT și șoarecii hipertensivi CST'g (Figura 6i-k).

În mod similar, după 6 săptămâni de hipertensiune arterială, Șoarecii GFP-LC3 și CST'1 GFP-LC3 au prezentat leziuni ale podocitelor, dar leziunile au fost mai proeminente la șoarecii GFP-LC3 (Figura 7). Raportul albumină-creatinină urinară a fost mai mare la șoarecii GFP-LC3 după 4 săptămâni de AnglI + HSD (Figura 7a). Numărul podocitelor nu a fost diferit între cele 2 genotipuri, dar expresia nefrului a fost semnificativ mai scăzută la șoarecii GFP-LC3 (control) (Figura 7b-e). Corelând cu protecția mediată de calpastatină, analiza ultrastructurală a arătat o effacere ușoară și focală a procesului piciorului podocitelor la șoarecii GFP-LC3 tratați cu Angl + HSD cu o mai bună conservare a effacementului procesului piciorului la șoarecii CST'g, deși cuantificarea globală a numărului de procese ale piciorului pe lungimea membranei subsolului glomerular (GBM) nu a fost diferită din punct de vedere statistic, cel mai probabil deoarece leziunea podocitelor este focală și segmentară în modelul nostru (Figura 7f-h). De notat, macrofage și infiltrarea limfocitelor T înRinichinu au fost diferite între grupuri (figura suplimentară S6). Luate împreună, aceste rezultate au demonstrat că calpastatina a prevenit AngII + induse de HSD podocite prejudiciu.

Supraexpresia calpastatinei restabilește fluxul autofag în podocite de la șoareci după tratamentul Angel + HSD

În cele din urmă, ne-am întrebat dacă protecția glomerulară mediată de calpastatină în modelul HSD AngII + a implicat întreținerea autofagiei în podocite. Interesant este faptul că acumularea de P62 indusă de AnglI +HSD în podocite a fost împiedicată la șoarecii CSTTg și GFP-LC3 CST'g (Figura 8a-d), indicând faptul că calpastatina a împiedicat blocarea autofagiei podocitelor. De remarcat, numărul de GFP + P62 + puncte de etichetare a auto-fagozomi a fost similar în podocite de la hipertensivi GFP-LC3 și GFP-LC3 CST șoareci, sugerând astfel că AnglI + HSD indus o încetinire a fluxului autofag podocite, mai degrabă decât o arestare completă (Figura 8e-g).

În predicția silico a locului de clivaj calpain în proteine podocite

Am folosit mai multe instrumente în silico pentru a prezice potențialele ținte calpain în podocite (tabelele suplimentare S1 și S2). Au fost comparate trei baze de date online: GPS-CCD,4CaMPDB,5 și DeepCalpain.° În analiza silico au fost identificate mai multe proteine podocite, nefrină și podocină printre ele, care ar putea fi despicate de calpaine. Astfel, protecția glomerulară mediată de calpastatină ar putea fi legată de o reducere a activității enzimatice a calpainei, ceea ce ar duce la degradarea redusă a unor proteine podocite.

În plus, cel puțin 3 proteine legate de autofagie sunt ținte directe ale calpainelor. ATG5 este despicat de calpaine, ceea ce duce la o perturbare a formării complexului ATG12-ATG5.57 Administrarea inhibitorilor calpainei in vivo a împiedicat, de asemenea, scindarea proteinei autofagie Beclin-1.5"În analiza silico a locului de clivaj putativ pe proteinele legate de autofagie susține ipoteza că calpaina ar putea regla autofagia prin scindarea enzimatică a proteinelor autofagiei.

expresia ARNm a reticulului endoplasmatic (ER) și a markerilor de stres oxidativ în glomeruli de la șoareci tratați cu Angll+ HSD

S-a evaluat stresul reticulului endoplasmatic (ER) și stresul oxidativ prin PCR cantitativ în glomeruli în timpul tratamentului cu AngII +HSD (tabelul 1). La bază, nu am observat nicio modificare a expresiei ARNm a genelor analizate la șoarecii glomeruli5loxlox (Suplimentar de la WT și Nphs2.cre Atg5 Figura S7). După 6 săptămâni de hipertensiune arterială, glomeruli de la șoarecii Nphs2. cre Atg5loxlox au prezentat profiluri diferite de ARNm ale genelor stresului ER și ale căilor de stres oxidativ cu expresie crescută a Sod1, Prdxl, Atf4, Gpxl și Hsp90b1 în comparație cu Glomeruli WT, sugerând astfel că epuizarea autofagiei în podocite a favorizat stresul Er indus de AngII + HSD și stresul oxidativ. În schimb, glomerulii de la șoarecii CST au prezentat downregulation de mai multe gene ale stresului ER și căi de stres oxidativ, precum și scăderea expresiei unor gene pro-apoptotice (Figura 9).

Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că supraexpresia calpastatinei ar putea preveni leziunile glomerulare prin reducerea AngII + ER indusă de HSD și a stresului oxidativ.

DISCUȚIE

În studiul de față, am demonstrat că în hipertensiunea indusă de AngII + HSD, autofagia podocitelor este semnificativ dereglată. În plus, șoarecii cu ștergerea specifică podocitelor atg5 au fost mai predispuși la glomeruloscleroză indusă de AngI+ HSD și la pierderea podocitelor, arătând astfel că autofagia în podocite împiedică dezvoltarea nefropatiei hipertensive, evidențiind rolul critic al autofagiei în leziunea podocitelor induse de Angl + HSD. Se cunosc puține lucruri despre stimulii extracelulari care reglează autofagia celulară, iar aceste rezultate pun în lumină reglarea fiziopatologică a autofagiei podocitelor de către AngII.

În cele mai multe glomerulopatii umane, effacement podocyte picior proces este un semn distinctiv al leziunilor glomerulare care să conducă la proteinurie. Autofagia este probabil să joace un rol esențial în menținerea funcției podocitelor, deoarece aceste celule diferențiate terminal afișează rate ridicate de autofagie chiar și în absența stresului. Un studiu anterior a arătat că autofagia Angi pro-motes prin generarea de specii reactive de oxigen într-o linie celulară podocite murină imortalizată condiționat.5 Producția de specii reactive de oxigen este într-adevăr un inductor general al autofagiei în multe tipuri de celule, iar motivele pentru o astfel de discrepanță cu constatările noastre sunt neclare. Spre deosebire de acest din urmă studiu, am folosit podocite de cultură primară murină păstrând expresia podocină și nefrină și abordări in vivo și nu linii celulare murine. Confirmăm rapoartele anterioare că podocite postmitotice prezintă un nivel neobișnuit de ridicat de autofagie constitutivă. Măsurarea cantității crescute de LC3-II după stimularea AngII în prezența sau absența inhibitorilor lizozomi pentru a determina

dacă fluxul autofag este crescut sau blocat. Studiile anterioare au neglijat acest fenomen.

Aici, am folosit un model hipertensiv bazat pe perfuzie AnglI și HSD. Podocite prezintă receptori ATI și sunt expuse la peptide filtrate liber, cum ar fi AngII1,6,26,61-6 Se presupune că efectele renoprotectoare observate ale inhibiției RAAS ar putea fi - cel puțin parțial - din cauza unei blocadă a acestui RAAS specific podocitelor. De asemenea, studii in vivo

Cistanchepoate scutiboli de rinichi