Studiu asupra funcției de protecție a Cistanche asupra rinichilor: diferențe dependente de androgeni în cantitățile de MRNA CYP din rinichiul de porc

Diferențele dependente de androgeni în cantitățile de ARNm CYP din rinichiul de porc

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Am raportat anterior diferențe de sex și rasă dependente de androgeni în cantitățile de ARNm ale izoformelor CYP din ficatul de porc. Pentru a clarifica dacă există astfel de diferențe de sex și rasă înrinichi, am examinat cantitățile de mai multe ARNm CYP din rinichi utilizând ambele sexe de porci Landrace, Meishan și/sau de 5-lună de vârstă F1 (LM și ML) lor încrucișați. Au fost găsite diferențe semnificative de sex în cantitățile mai multor ARNm CYP: bărbați femelă pentru CYP4A24/25 la toate rasele. Diferențele de sex în cantitatea de ARNm CYP2B22 (masculi femele) au fost de asemenea observate la toate rasele, cu excepția porcilor Landrace. Mai mult, o diferență semnificativă de sex (masculin testosteronpropionat a indicat că diferențele de sex și rasă în cantitățile acelor ARNm CYP au fost, cel puțin parțial, dependente de nivelurile serice.testosteron. În plus, efectele androgenului asupra cantităților de ARNm CYP din rinichi nu s-au corelat neapărat cu cele din ficat, ceea ce sugerează că există un factor selectiv de țesut responsabil pentru expresia legată de androgeni a genelor CYP. Protectia deCistancheperinichieste complet, care este atribuit elementelor precum echinacozidul, verbascozidul, flavonoidele și glicozidele totale ale alcoolului fenetilic conținute înCistanche. Cistanchenu poate proteja numairinichide la mai multe daune dar și reparați daunele existente larinichi. Prin urmare,Cistancheeste cea mai des folosită plantă în rețetele medicinei tradiționale chineze.Cistancheare valoare medicinală extrem de mare.

Cuvinte cheie:testosteron; CYP;rinichi; diferența de sex; diferența de rasă; porc;rinichicelulă;Cistanche

Misaki Kojima și Masakuni Degawab

Unitatea Genomului Animal, Institutul de Știință a Zootehniei și Pășunilor, Organizația Națională pentru Cercetare în Agricultură și Alimentație (NARO); 2 Ikenodai, Tsukuba, Ibaraki 305–0901, Japonia: și bLaboratorul de toxicologie moleculară, Școala de Științe Farmaceutice, Universitatea din Shizuoka; 52–1 Yada, Suruga-Ku, Shizuoka 422–8526, Japonia. Primit 16 aprilie 2021; acceptat 19 mai 2021

INTRODUCERE

Enzimele de metabolizare a medicamentelor (DME), cum ar fi CYP, sulfotransferaze (SULT) și uridin 5′-difosfat (UDP)-glucuronoziltransferaze (UGT), joacă un rol important în metabolismul xenobioticelor, inclusiv medicamentele și compușii endogeni, cum ar fi hormonii steroizi. și lipide.1,2) Porcii domestici (Sus scrofa domesticus), inclusiv porcii mini, sunt importanți în studiile farmacologice și toxicologice din cauza asemănării funcției DME între oameni și porci, în special CYPs.3–7) Am raportat anterior sexul și generează diferențe în cantitățile de ARNm DME hepatice, inclusiv izoformele CYP, între porcii Landrace și Meishan și am demonstrat în continuare că nivelul androgenului seric este unul dintre factorii critici care produc aceste diferențe.8)

Cistanchetubulosaprevineboală de rinichi,faceți clic aici pentru a obține eșantionul

Therinichiprecum și ficatul este țesutul important responsabil pentru metabolismul și excreția xenobioticelor, inclusiv medicamentele și compușii endogeni și este una dintre cele mai frecvente ținte pentru toxicitatea indusă de medicamente.9,10) S-a raportat că izoformele CYP aparținând Familiile CYP1, CYP2, CYP3 și CYP4 există la porcrinichi.11–15) Cele mai multe dintre aceste izoforme CYP joacă un rol important în metabolismul xenobioticelor și/sau lipidelor la animalele experimentale și la oameni.9,10,16,17) În plus, expresia izoformelor Cyp4a și Cyp4b la șoarecerinichieste reglată de androgeni.18–21)

În studiul de față, am examinat mai întâi diferențele de sex și rasă în cantitățile de ARNm CYP (CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29, CYP3A24, CYP2A4, CYP2A1, CYP2A1, CYP2C33, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29, 6P3A29, CYP3A4, CYP3A4, CYP3A4)rinichide Meishan, Landrace și porcii lor încrucișați F1. În plus, am examinat dacă androgenul este un factor critic care determină diferențele de sex și rasă în cantitățile acelor ARNm CYP la porc.rinichi, prin experimente cu castrarea si/sau administrarea detestosteronpropionat (TP).

MATERIALE ȘI METODE

animale

Au fost utilizați porci Landrace, Meishan și încrucișați F1 (LM, femelă Landrace × mascul Meishan; ML, femelă Meishan × mascul Landrace), la fel ca cei utilizați în studiile noastre anterioare.22) Pe scurt, porcii au fost ținuți la Institutul Național. de Zootehnie și știință a pășunilor, Tsukuba, Japonia. Toți porcii au fost hrăniți cu o dietă comercială cu cereale și au fost furnizați cu apă ad libitum. Porcii au fost uciși prin asomare electrică urmată de exsanguinare între orele 10:00 și 11:00 dimineața. Unii porci masculi Landrace și Meishan au fost castrați la vârsta de 1 lună și eutanasiați la vârsta de 5 luni. O porțiune din rinichi sau ficatul de la fiecare porc a fost îndepărtată rapid, congelată în azot lichid și păstrată la -80 de grade până la analizele ulterioare.

Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de îngrijire a animalelor al Institutului Național de Știință pentru Zootehnie și Pășuni (nr. 1711B060, 1811B032, 1911B068, 20B005NILGS). Toate animalele au fost manipulate în mod uman, în conformitate cu îndrumările Comitetului.

Tratamentul cu androgeni

După cum este descris în rapoartele anterioare,23,24)testosteronpropionat (TP, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, SUA) dizolvat în ulei de porumb a fost injectat intramuscular de cinci ori la intervale de 48-h în piciorul din spate al fiecărui porc, la o doză de 10 mg/kg greutate corporala; porcii au fost eutanasiați la 24 de ore după injecția finală.

Cantitatea de serTestosteron

Cantitatea de sertestosteronla porci masculi individuali a fost măsurat folosindTestosteronKit de test imunosorbent legat de enzime (ELISA) (Enzo Life Sciences Inc., NY, SUA) conform instrucțiunilor producătorului, așa cum s-a descris anterior.24) În plus, au fost utilizate și datele obținute în studiile noastre anterioare.24,25)

Cantități de ARNm CYP

ARN-ul total a fost preparat din țesuturile individuale folosind reactiv TRIzol (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, SUA) și utilizat pentru a determina cantitățile de CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C49, CYP2C49, CYP1A2, CYP1A32, CYP2B22, CYP2C33 ARNm CYP4A24/25 și CYP4B1. Cantitățile acestor ARNm au fost evaluate utilizând RT-PCR în timp real utilizând un sistem PCR în timp real 7500 și un amestec de master verde SYBR (PE Applied Systems, Tokyo, Japonia), așa cum s-a descris anterior,25), cu excepția ARNm CYP3A. Cantitățile de ARNm CYP3A22, CYP3A29 și CYP3A46 au fost examinate utilizând Eagle Taq Master Mix cu ROX (Roche Molecular Systems, Inc., Branch Burg, NJ, SUA) așa cum a fost raportat anterior.22) Seturile de primeri și sondele TaqMan utilizate în prezent au fost aceleași cu cele din studiile noastre anterioare22,25) cu excepția CYP1A1, CYP1A2, CYP4A24/25 și CYP4B1, unde secvențele primerului au fost după cum urmează: CYP1A1, 5′-ACT TCA TCC CTA TCC TCC GTT ACC{53} }′ (înainte) și 5′-GCA TTC TCG TCC ATC CTC TTG TC-3′ (invers); CYP1A2, 5′-GCT ATC GGG ACT TTG ACA AGA ACT-3′ (înainte) și 5′-CCA GGA GAT GGC TGT GGT AAT TG{-3′ (invers); CYP4A24/25, 5′-CAC CGT GCC GCC AGG ATA-3′ (înainte) și 5′-CAA GGA GGA GGA TGT CCA GGA A{-3′ (invers); CYP4B1; 5′-GAG CAC CAG CAT CGT TGT CG-3′ (înainte) și 5′-TCC CCA GAT CCT CCC CCT G{-3′ (înapoi). Proteina ribozomală L7 (RPL7) a fost utilizată ca standard intern. Cantitatea din fiecare cADN a fost evaluată prin metoda curbei standard relative în conformitate cu PE Applied Biosystems User Bulletin #2 (1997). Curbele standard pentru a determina cantitățile de ARNm CYP au fost generate utilizând un amestec de reacție RT cu ARN total din ficatul porcilor femele Landrace de 5-lună sau din rinichiul de 5-lună. femele de porci Landrace sau Meishan, conform scopului

Analize statistice

Diferențele semnificative statistic au fost evaluate prin testul post-hoc al lui Tukey după ANOVA sau testul t Student. Corelațiile dintre parametrii indicați au fost determinate prin analiza de regresie.

REZULTATE

Cantități de ARNm CYP în rinichiul porcilor Landrace și Meishan

Cantitățile de ARNm CYP au fost măsurate mai întâi în rinichiul ambelor sexe de porci Landrace și Meishan în vârstă de 5-lună. Pentru a compara cantitatea fiecărui ARNm CYP dintre rinichi și ficat, cantitatea fiecărui ARNm CYP din rinichi a fost exprimată ca raport relativ la cantitatea corespunzătoare din ficat la femele de 5-porci Landrace în vârstă de o lună, iar rezultatele sunt prezentate în tabelul 1.

La toți porcii examinați, cantitățile de ARNm CYP4A24/25 și CYP4B1 din rinichi au fost mult mai mari decât cele din ficat, în timp ce cele ale celorlalți CYP au fost invers (Tabelul 1). În plus, deși ARNm CYP2E1 și CYP3A22 au fost detectate în rinichi, acele cantități au fost sub o miime din cele din ficat în fiecare rasă (datele nu sunt prezentate).

La ambele rase de porc, cantitățile de ARNm CYP2A19 și CYP3A29 au fost mai mici la masculi decât la femele (Tabelul 1, Fig. 1). În schimb, cantitatea de ARNm CYP4A24/25 la ambele rase de porc a fost semnificativ mai mare la masculi decât la femele. În plus, la porcii Meishan, cantitățile de ARNm CYP2C33 și CYP2C49 au fost semnificativ mai mari la masculi decât la femele. Nu au fost observate astfel de diferențe de sex în cantitățile de ARNm CYP2C33 și CYP2C49 la porcii Landrace. Nu au fost observate diferențe semnificative de sex în cantitățile de ARNm CYP1A1, CYP1A2, CYP2B22 și CYP4B1 la nicio rasă de porc, deși o diferență de sex în cantitatea de ARNm CYP2B22 la porcii Meishan a fost semnificativă prin testul t Student. Mai mult, ARNm CYP3A46 a fost detectat la ambele sexe de porci Landrace, în timp ce a fost sub limita de detectare la ambele sexe de porci Meishan.

Breed  differences  in  the  amounts  of  several  CYP mRNAs were also found. The amounts of CYP2B22 and CYP4B1 mRNAs in Landrace pigs were signifificantly higher than those  in sex-matched Meishan pigs, while those of CYP2C49 and CYP3A29  mRNAs  were the  opposite.  A  significant  breed  difference (Meishan > Landrace) in the amounts of CYP2C33 and CYP4A24/25  mRNA  was  also  observed in  males,  but  no  such  difference  was  found in  females.  Furthermore, the  breed  differences  (Landrace >Meishan) în cantități de ARNm CYP1A1, CYP1A2 și CYP2A19 între porcii Landrace și Meishan potriviți în funcție de sex au fost, de asemenea, observate.

Efectul androgenului asupra expresiei genice a CYP-urilor reprezentative legate de sex Pentru a clarifica dependența de androgeni a expresiei genice a CYP (CYP2A19, CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49 și CYP3A29) în rinichi, efectele castrarii și/sau tratamentului cu TP au fost examinat folosind porci Meishan și Landrace de 5-lună (Fig. 1). La masculii castrați din ambele rase, cantitatea de ARNm CYP2A19 a fost mai mare decât cea la masculii intacți corespunzători. Mai mult, tratamentul cu TP al masculilor castrați și al femelelor intacte din ambele rase de porc a dus la o scădere a cantității de ARNm. Cantitățile de ARNm CYP2B22 și CYP3A29 au crescut la porcii Meishan castrați, dar nu și la porcii Landrace castrați, în comparație cu masculii intacți corespunzători. Tratamentul cu TP al masculilor castrați și al femelelor intacte din ambele rase de porci a dus la o scădere a cantităților acelor ARNm, deși nu s-au observat efecte semnificative ale TP asupra ARNm CYP2B22 la Meishan castrați și ARNm CYP3A29 la porcii Landrace castrați din cauza interacțiunilor mari. diferenta individuala.

Tabelul 1. Cantități relative de ARNm ale izoformelor CYP renale la porcii Landrace și Meishan de 5-lună

Fig. 1. Efectele castrarii și/sau administrării TP asupra cantităților de ARNm CYP din rinichiul de porc de 5-lună de vârstă

TP a fost injectat intramuscular la {{0}}porci masculi castrați și femele intacți Landrace și Meishan, în vârstă de {{0}}, așa cum este descris în Materiale și Metode. Cantitatea fiecărui ARNm CYP din rinichi a fost determinată prin RT-PCR în timp real și normalizată la cea a RPL7 ca standard intern. Curbele standard au fost generate folosind un amestec de reacție RT cu ARN total din rinichii porcilor Landrace femele de 5-luni, cu excepția determinării cantității de ARNm CYP2C49, unde curbele standard au fost generate folosind un amestec de reacție RT cu ARN total din rinichii porcilor Meishan femele de 5-lună. Fiecare coloană reprezintă media fiecărui grup experimental și fiecare bară reprezintă abaterea standard (SD) a mediei (n= 6 pentru porcii Landrace și Meishan masculi și femele intacți; n= 3 pentru alții). a,b Diferențele semnificative față de porcii masculi intacți corespunzători au fost evaluate prin testul post-hoc al lui Tukey: ap < 0.{{20}}5,="" pb="">< 0,01.="" c,d="" diferențe="" semnificative="" față="" de="" porcii="" tp="" netratați="" corespunzători,="" așa="" cum="" au="" fost="" evaluate="" prin="" testul="" t="" student:="" cp="">< 0,05,="" dp="">< 0,01.="" pătratele="" din="" cyp2b22="" și="" cyp3a29="" indică="" porcii="" meishan="" și,="" respectiv,="" landrace,="" cu="">

Cantitatea de ARNm CYP2C33 a scăzut la porcii Meishan castrați, dar nu și la porcii Landrace castrați, în comparație cu masculii intacți corespunzători, iar tratamentul TP al masculilor castrați și femelelor intacte din ambele rase de porci a dus la o creștere a cantității de ARNm. La porcii Meishan, cantitatea de ARNm CYP2C49 a fost, de asemenea, scăzută prin castrare, iar tratamentul cu TP al masculilor castrați și al femelelor intacte a condus la o creștere a cantității sale. Nu s-au observat astfel de efecte ale castrarii sau tratamentului TP la porcii Landrace.

Fig. 2. Efectele castrarii și/sau administrării TP asupra cantităților de ARNm CYP4A24/25 și CYP4B1 din rinichii și ficatul porcilor de 5-luni

TP a fost injectat intramuscular la porci Landrace și Meishan masculi castrați și femele intacți în vârstă de {{{{10}}}}, așa cum este descris în Materiale și Metode. Cantitatea fiecărui ARNm CYP din rinichi și ficat a fost determinată prin RT-PCR în timp real și normalizată la cea a RPL7 ca standard intern. Curbele standard au fost generate folosind un amestec de reacție RT cu ARN total din rinichii porcilor femele Landrace în vârstă de 5-luni. Fiecare coloană reprezintă media din fiecare grup experimental și fiecare bară reprezintă SD-ul mediei (n= 6 pentru porcii intacți masculi și femele Landrace și Meishan; n= 3 pentru alții). Diferențele semnificative față de porcii masculi intacți corespunzători au fost evaluate prin testul post-hoc al lui Tukey: ap < 0.01.="" b,c="" diferențe="" semnificative="" față="" de="" porcii="" tp="" netratați="" corespunzători,="" așa="" cum="" au="" fost="" evaluate="" prin="" testul="" t="" student:="" pb="">< 0,05,="" cp=""><>

To date, there are no reports concerning the constitutive amounts of CYP4A24/25  and  CYP4B1 mRNAs and sex differences in their amounts in the pig liver, although a clear sex  difference  (male >femelă) în cantitate de ARNm CYP4A24/25 se observă aici în rinichiul de porc (Tabelul 1). Prin urmare, pentru a clarifica efectele androgenului asupra expresiei acelor ARNm în rinichi și ficatul porcilor Landrace și Meishan, am examinat nu numai efectele castrarii, ci și efectele tratamentului cu TP la masculii castrați și femelele intacte ( Fig. 2). Cantitatea de ARNm CYP4A24/25 din rinichi a fost scăzută atât la porcii Landrace, cât și la porcii Meishan prin castrare, iar tratamentul TP al masculilor castrați și femelelor intacte din ambele rase de porci a dus la o creștere a cantității sale. Cu toate acestea, în ficatul ambelor rase de porc, nu au fost observate astfel de efecte ale castrarii și, de asemenea, nu a fost observată nicio diferență de sex în cantitatea de ARNm CYP4A24/25. De asemenea, nu a fost observat niciun efect semnificativ al tratamentului cu TP asupra cantității de ARNm CYP4A24/25 hepatic la ambele rase de porci, deși creșterea cantității acestuia prin tratamentul TP a fost observată numai la masculii castrați de porci Landrace. În plus, ARNm CYP4B1 nu a arătat nicio diferență de sex atât în ​​rinichi (Fig. 2 și Tabelul 1) cât și în ficat pentru fiecare rasă de porc. La ambele rase de porc, cantitatea de ARNm CYP4B1 nu a fost modificată semnificativ prin castrare și/sau tratament cu TP (Fig. 2).

Am descoperit anterior că tratamentul cu TP a dus la o creștere a cantității de ARNm CYP3A46 în ficatul porcilor Landrace.22) Prin urmare, efectele tratamentului cu TP și castrarea asupra cantității de ARNm din rinichi au fost examinate în continuare folosind {{3} }porci Landrace în vârstă de o lună (Fig. 1). Deși castrarea masculilor nu a avut un efect semnificativ asupra cantității de ARNm CYP3A46 din rinichi, tratamentul cu TP al masculilor castrați și al femelelor intacte a dus la o scădere a cantității de ARNm CYP3A46. În plus, ARNm CYP3A46 a fost sub limita de detecție atât în ​​rinichi, cât și în ficat a tuturor porcilor Meishan tratați cu castrare și/sau TP.22)

Factori genetici responsabili pentru expresia legată de sex a ARNm CYP

We have previously reported that sex-related expression of CYP mRNAs in the pig liver is, at least in part, dependent on the amount of serum testosterone,8) and  that  the  amount  is  determined  by  autosomal  dominant  inheritance.25) Therefore, using F1 progeny (LM and ML) of Landrace and Meishan pigs, the amounts of sex-related CYP mRNAs in the kidney were measured (Fig. 3). Incidentally, the amounts of serum testosterone in 5-month-old male LM and ML pigs, as well as Meishan pigs, were >40 ng/mL, iar cei de la porcii masculi Landrace de 5-luni au fost<23 ng>

In both LM and ML pigs, the mRNA amounts of CYP2A19, CYP2B22, and CYP3A29 in males were much lower than those in  females,  while  the  converse  was  observed  for  CYP2C33 and CYP4A24/25.  For CYP2C49 mRNA,  a  significant  sex  difference (males >femelele) a fost observată la porcii ML, dar nu a fost observată nicio diferență semnificativă la porcii LM din cauza diferențelor interindividuale considerabile între porcii LM masculi. ARNm CYP3A46 a fost detectat la porcii LM și ML, precum și la porcii Landrace și o diferență de sex (masculi< females)="" in="" the="" amount="" of="" cyp3a46 mrna was observed in lm and ml pigs ="">

Fig. 3. Diferențele de sex în cantitatea de ARNm CYP în rinichiul porcilor LM și ML de 5-lună

Cantitatea de ARNm din fiecare CYP din rinichi a fost determinată prin RT-PCR în timp real și normalizată la cea a RPL7 ca standard intern. Curbele standard au fost generate folosind un amestec de reacție RT cu ARN total din rinichii porcilor Landrace femele de 5-luni, cu excepția determinării cantității de ARNm CYP2C49, unde curbele standard au fost generate folosind o reacție RT amestec cu ARN total din rinichii porcilor Meishan femele de 5-lună. Fiecare cerc arată un porc individual (n= 6 și 9 pentru porcii LM masculi și respectiv femele; n= 7 și 10 pentru porcii ML masculi și, respectiv, femele). Bara indică media din fiecare grup. a,b Diferențele semnificative între masculi și femele din fiecare rasă au fost evaluate prin testul t Student: ap < 0.05,="" pb=""><>

Relația dintre cantitatea de testosteron seric și exprimarea mARN-urilor CYP legate de sex în rinichi

Concentrația de androgen seric este considerat a fi unul dintre factorii critici care produc diferențele de sex și rasă în cantitățile mai multor ARNm CYP din rinichiul de porc. Prin urmare, relația dintre concentrația serică de androgeni și expresia legată de sex a ARNm CYP (CYP2A19, CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A29, CYP3A46 și CYP4A24/25) în rinichi a fost examinată în continuare folosind 1- {17}} și 5-porci de o lună. Unii dintre porcii de 1-luni (imaturi,< 10 ng  testosterone/ml ="" serum) ="" were ="" treated ="" with ="" tp="" and="" used="" as="" samples="" for="" the="" present="" experiments.="" the="" concentrations="" of="" serum="" testosterone="" in="" the="" tp-treated="" pigs="" were ="" 28–59 ng/ml. ="" in ="" addition, ="" serum ="" testosterone ="" amount ="" increased="" in="" an="" age-dependent="" manner="" in="" males25) ="" but ="" not ="" in ="" females="" of="" all="" the="" pigs=""><7 ng  testosterone/ml ="" serum) ="" used. ="" therefore,="" as="" representative="" samples="" of="" females,="" 1-month-old="" and ="" 5-month-old ="" pigs ="" but ="" not ="" 3-month-old ="" pigs ="" were ="" used ="" for ="" the="" present="">

The mRNA amounts of CYP2A19, CYP2B22, CYP3A29, and CYP3A46 in all the pigs with high concentrations (>aproximativ 30 ng/mL) de testosteron seric au fost scăzute în comparație cu cele de la toți porcii cu concentrații scăzute de testosteron seric (<30 ng l). ="" in ="" particular, ="" the ="" amount ="" of ="" cyp3a29="" mrna="" decreased="" in="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent ="" manner ="" in ="" all ="" the ="" breeds ="" of ="" pig ="" examined ="" (fig. ="" 4). ="" furthermore,="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent="" decrease="" in="" the="" amount="" of="" cyp3a46 mrna was also observed ="" in="" all="" the="" pigs="" except="" meishan="">

Cu toate acestea, cantitățile de ARNm CYP2C33 și CYP4A24/25 au crescut într-o manieră dependentă de concentrația de testosteron seric la toate rasele de porci examinate (Fig. 5). Cantitatea de ARNm CYP2C49 a crescut într-o manieră dependentă de concentrația de testosteron seric la porcii Meishan, LM și ML, dar nu la porcii Landrace. În plus, s-a observat o mică creștere a cantității de ARNm CYP2C49 la porcii Landrace și Meishan de 1-luni tratați cu TP. Acest lucru sugerează că expresia unui astfel de efect asociat cu TP este dependentă de nivelul de expresie al factorului (factorilor) transcripționali care răspund la TP pentru expresia genei CYP2C49, care este implicată în maturare.

DISCUŢIE

În studiul de față, am găsit inițial diferențe de sex și rasă în cantitățile mai multor ARNm CYP din rinichi folosind porci Landrace și Meishan de 5-lună și descendenții lor F1 (LM și ML). Ulterior, pentru a clarifica efectul androgenului asupra cantităților de ARNm CYP renale, am examinat efectele castrarii și/sau tratamentului cu TP asupra acelor cantități. Aceste rezultate sunt rezumate în tabelul 2. Analizând astfel de diferențe de sex și rasă în raport cu concentrația de testosteron seric, aici am demonstrat că testosteronul seric este cel puțin unul dintre factorii critici care produc acele diferențe în cantitatea fiecărui ARNm CYP din rinichi.

Fig. 4. Corelații negative între concentrațiile serice de testosteron și cantitățile de ARNm CYP2A19, CYP2B22, CYP3A29 și CYP3A46 în rinichiul de porc

Concentrațiile serice de testosteron și cantitățile de ARNm CYP au fost măsurate așa cum este descris în Materiale și Metode. Unele dintre concentrațiile de testosteron seric ale porcilor individuali au fost luate din datele obținute anterior.24,25) Fiecare simbol reprezintă fiecare porc individual. Pătrate deschise și pastile, 1-masculi și, respectiv, femele de o lună de porci Landrace și Meishan (n= 3 pentru ambele sexe de porci Landrace și Meishan); pătrate gri, 3-porcii masculi Landrace și Meishan de o lună (n= 4 pentru porcii Landrace și n= 6 pentru porcii Meishan); pătrate închise și pastile, 5-masculi și, respectiv, femele de o lună de porci Landrace și Meishan (n= 6 pentru ambele sexe de porci Landrace și Meishan); triunghiuri închise și deschise, 5-porci masculi și femele LM de o lună, respectiv (n= 6 pentru masculi și n= 9 pentru femele); triunghiuri inverse închise și deschise, 5-porci ML masculi și femele de o lună, respectiv (n= 7 pentru masculi și n= 10 pentru femele); cercuri închise și deschise, 1-porci masculi și femele de lună Landrace și respectiv porci Meishan tratați cu TP (n= 3 pentru ambele sexe de porci Landrace și Meishan). Corelațiile au fost examinate folosind datele de la toate animalele testate și determinate prin analiză de regresie, unde r este coeficientul de corelație.

Am găsit anterior diferențe de sex (bărbați< female)="" in="" the="" amounts="" of="" cyp1a1="" and="" cyp1a2="" mrnas="" in="" the="" liver="" of="" meishan, lm, and ml pigs but not in landrace pigs.23–25) however, ="" no ="" such ="" sex ="" differences were ="" observed in the ="" kidney ="" of landrace="" and="" meishan="" pigs.="" on="" the="" contrary,="" there="" was="" a="" sex="" difference="" (male="" >="" female)="" in="" the="" amount="" of="" cyp4a24/25="" mrna="" in ="" the ="" kidney ="" but ="" not ="" in ="" the ="" liver. ="" sex ="" differences ="" in ="" the ="" amounts="" of="" cyp2a19,="" cyp2c33,="" and="" cyp2c49="" mrnas="" in="" the="" pig="" kidney,="" especially="" in="" meishan,="" lm,="" and="" ml="" pigs,="" correlated="" with="" the="" previous="" results="" in="" the="">< female="" for="" cyp2a19;="" male="" >="" female="" for="" cyp2c33="" and="" cyp2c49.="" interestingly, ="" sex ="" differences ="">< female)="" in="" the="" amounts="" of="" cyp2b22,="" cyp3a29, and/or cyp3a46="" mrnas="" in="" the="" kidney="" of="" meishan,="" lm,="" and="" ml="" pigs="" were="" the="" opposite="" of="" that="" previously obtained in the liver.22) sex differences in the amount of ="" cyp2a19,="" cyp3a29,="" and="" cyp4a24/25 ="" mrnas ="" were ="" observed ="" in the kidney of all the breeds of pig examined. although ="" sex ="" differences ="" in cyp2b22,="" cyp2c33, ="" and/or cyp2c49 ="" were ="" observed in meishan, lm, ="" and ml ="" pigs, ="" no ="" such ="" sex ="" differences ="">

Tabelul 2. Rezumatul diferențelor de sex și rasă dependente de androgeni în expresia genică a izoformelor CYP în rinichiul de porc

These  sex  and  breed  differences  can  be  explained  by  the  differences  in  the  concentration  of  serum  testosterone  in  male pigs. Male 5-month-old Meishan, LM, and ML pigs had high concentrations of serum testosterone (>aproximativ 40 ng/mL), în timp ce cele ale porcilor Landrace au avut concentrații scăzute (<23 ng l). ="" because ="" the ="" amount ="" of ="" cyp2a19="" and="" cyp3a29 ="" mrnas ="" considerably ="" decreased ="" in ="" pigs ="" with ="">aproximativ 20 ng/mL de testosteron seric, diferențe de sex (masculin< female)  in ="" their ="" amounts ="" were ="" observed ="" in ="" all ="" the ="" breeds ="" of ="" pig. ="" likewise, ="" since ="" the ="" amount ="" of ="" cyp4a24/25="" mrna="" increased="" in="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent manner up to 80 ng/ml, a sex difference (male =""> female) was observed in all the breeds of pig. However, because  clear changes in the amount of CYP2B22, CYP2C33, and CYP2C49 mRNAs occurred at >30 ng/mL de testosteron seric, diferențe de sex în cantitățile lor au fost observate la porcii Meishan, LM și ML, dar nu și la porcii Landrace. În consecință, se crede că astfel de diferențe de sex și rasă depind de cele ale concentrației serice de testosteron. Această ipoteză este susținută în continuare de experimentele care utilizează porci castrați și/sau tratați cu TP. Și anume, cantitățile acelor ARNm la bărbații castrați (<12 ng  testosterone/ml ="" in ="" serum) ="" were ="" almost ="" the="" same="" as="" the="" corresponding="" females.="" serum="" concentrations="" of="" testosterone="" in="" 5-month-old="" castrated="" males="" and="" intact="" females="" rose="" to="">100 ng/mL la tratamentul TP. În consecință, la porcii tratați cu TP, cantitățile de ARNm CYP2C33 și CYP4A24/25, ARNm CYP2C33 și CYP4A24/25 au crescut la fel de mult sau mai mult decât cele de la porcii Meishan masculi de 5-luni, iar cantitățile de ARNm CYP2B22, CYP3A29 și CYP3A46 au scăzut la fel de mult ca și la porcii masculi corespunzători.

Se crede că o diferență în profilul de secreție al hormonului de creștere (GH) între masculi și femele la multe animale, în special la rozătoare, are ca rezultat diferențe de sex în cantitățile mai multor enzime care metabolizează medicamentele, inclusiv CYP, în ficat.26) De exemplu, diferențele de sex în cantitățile de ARNm ale izoformelor Ugh, Sult și Cyp4a din ficatul de șoarece sunt influențate de secreția de GH cu model masculin și/sau androgeni, în timp ce acele diferențe de sex sunt reglementate în primul rând de androgenii din rinichi.21,27. ,28) Mai mult, se propune un locus de tranzacționare, numit reprimare dependentă de GH (GDR), pentru a regla gena pentru 15 -hidroxilaza steroidului specific feminin (Cyp2a4) în ficatul de șoarece,29), dar această genă este raportată. să fie reglate reciproc de androgeni în ficat și rinichi la șoareci masculi.30) În schimb, am constatat anterior că la porcii Landrace cu o diferență de sex în profilul de secreție de GH,31) nu au existat diferențe de sex în cantitățile de ARNm hepatic ale mai multe izoforme CYP, SULT și UGT care arată diferențe de sex la porcii Meishan.22–25,32) Prin urmare, se crede că astfel de diferențe de sex la porci sunt în principal dependente de diferențele în concentrația serică de testosteron. Cu toate acestea, deoarece profilul de secreție al GH este modificat de androgeni,33–35) este posibil ca modificările cantităților de ARNm observate la castrare și/sau administrarea TP să apară, cel puțin parțial, printr-o modificare mediată de androgeni a GH. modelul de secreție nu poate fi exclus.

Breed  differences  in  amounts  of  the  mRNAs  of  CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, and CYP4B1  between  sex-matched  Landrace  and  Meishan  pigs  were  also  observed  in  the  kidney  (Table  1),  while  no  such  clear  breed  differences  were  observed  in  the  liver.22,25) Additionally, as for CYP2C49 mRNA,  individual  differences  in  each  breed  of  pig  were  observed  regardless  of  serum  testosterone  concentration,  suggesting that these varieties have genetic diversity. Incidentally, pig  breeds  are  not  genetically  homogeneous.  Interestingly,  CYP3A46 mRNA was  clearly  detected in  both the  kidney  and  the liver of Landrace pigs but was below the detection limit in  both organs of Meishan pigs.22) Furthermore, CYP3A46 mRNA was  clearly  detected  in  both  the  kidney  and  the  liver  of  LM  and ML pigs, indicating that expression of CYP3A46 mRNA, as well as serum testosterone,25)  is  determined  by  autosomal  dominant inheritance. Because 5-month-old male LM and ML pigs, but not Landrace pigs, had high concentrations of serum  testosterone (>40 ng/mL), a fost observată o diferență de sex în cantitatea de ARNm CYP3A46 la porcii LM și ML, dar nu și la porcii Landrace. Aceste descoperiri sugerează cu tărie că factorii genetici (de rasă) și selectivi ai țesuturilor, împreună cu testosteronul seric, sunt implicați în nivelurile de expresie legate de sex și de rasă a mai multor gene CYP. Din păcate, acești factori rămân neclari.

În concluzie, demonstrăm aici că există diferențe de sex și rasă în cantitățile de ARNm ale izoformelor familiei CYP2, CYP3 și CYP4 din rinichiul de porc și sugerăm cu tărie că aceste diferențe depind de factorii genetici ai gazdei, inclusiv de concentrația de androgen seric. . În plus, arătăm diferențe tisulare între rinichi și ficat în expresia genelor CYP legate de sex/androgeni și sugerăm cu tărie că există un factor selectiv de țesut responsabil pentru expresia legată de androgeni a genelor CYP. În viitor, sunt necesare cercetări pentru a identifica factorul gazdă genetic legat de sex și factorul selectiv de țesut responsabil pentru reglarea genelor CYP. În orice caz, deoarece androgenul este unul dintre factorii gazdă care determină nivelurile de expresie ale mai multor CYP responsabili de metabolismul medicamentului, se consideră că măsurarea concentrației serice de testosteron contribuie la dezvoltarea unui tratament medicamentos individual adecvat.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută parțial de un Grant-in-Aid pentru cercetare științifică din partea Societății Japoneze pentru Promovarea Științei (nr. 19K06463, MK). Autorii mulțumesc Unității de operare Tsukuba 7, Centrul de suport tehnic al Regiunii Centrale, NARO, Tsukuba, Japonia pentru îngrijirea animalelor și pentru colectarea țesuturilor.

REFERINȚE

1) Almazroo OA, Miah MK, Venkataramanan R. Metabolismul medicamentelor în ficat. Clin. Liver Dis., 21, 1–20 (2017).

2) Nebert DW, Wikvall K, Miller WL. Citocromii umani P450 în sănătate și boală. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 368, 20120431 (2013).

3) Burkina V, Rasmussen MK, Pilipenko N, Zamaratskaia G. Comparație dintre citocromul P450 uman, porcin, rozător și piscicol care metabolizează xenobiotic. Toxicologie, 375, 10–27 (2017).

4) Nielsen SD, Bauhaus Y, Zamaratskaia G, Junqueira MA, Blaabjreg K, Petrat-Melin B, Young JF, Rasmussen MK. Expresia constitutivă și activitatea citocromului P450 la porcii convenționali. Res. Veterinar. Sci., 111, 75–80 (2017).

5) Puccinelli E, Gervasi PG, Longo V. Xenobitotic care metabolizează citocromul P450 la porc, un model animal promițător. Curr. Drug Metab., 12, 507–525 (2011).

6) Schelstraete W, Clerck LD, Govaert E, Millecam J, Devreese M, Deforce D, Bocxlaer JV, Croubels S. Characterization of porcine hepatic and intestinal drug-metaboliizing CYP450: comparison with human orthologues from a cantitative, activity and selectivity perspective. Sci. Rep., 9, 9233 (2019).

7) Skaanild MT. Citocromul P450 porcin și metabolismul. Curr. Farmacia. Des., 12, 1421–1427 (2006).

8) Kojima M. Diferențele de sex și rasă în expresia genică constitutivă a enzimelor hepatice de metabolizare a medicamentelor la porcii Meishan și Landrace: diferențe mediate de testosteron. Jpn. Agric. Res. Q., 54, 7–12 (2020).

9) Bajaj P, Chowdhury SK, Yucha R, Kelly EJ, Xiao G. Modele de rinichi emergente pentru a investiga metabolismul, transportul și toxicitatea medicamentelor și xenobioticelor. Drug Metab. Dispos., 46, 1692–1702 (2018).

10) Knights KM, Rowland A, Miners JO. Metabolismul renal al medicamentelor la om: potențialul de interacțiuni medicament-endobiotice care implică citocromul P450 (CYP) și UDP-glucuronoziltransferaza (UGT). Br. J. Clin. Pharmacol., 76, 587–602 (2013).

11) Kojima M, Morozumi T. Clonarea a șase cADN-uri de lungime completă care codifică enzimele citocromului P450 de porc și expresia genică a acestor enzime în ficat și rinichi. J. Health Sci., 50, 518–529 (2004).

12) Lundell K. Clonarea și exprimarea a două hidroxilaze noi ale acizilor grași din ficat și rinichi de porc [citocrom P450 (CYP)4A24 și CYP4A25]. Biochim. J., 363, 297–303 (2002).

13) Nannelli A, Chirulli V, Longo V, Gervasi PG. Exprimarea și inducția de către rifampicină a CYP2B și CYP3A reglate de CAR și PXR în ficat, rinichi și căile respiratorii ale porcului. Toxicologie, 252, 105– 112 (2008).

14) Puccinelli E, Gervasi PG, La Marca M, Buffy P, Longo V. Expresia și inductibilitatea prin fenobarbital a CYP2C33, CYP2C42, CYP2C49, CYP2B22 și CYP3As în ficatul porcin, rinichii, țesutul subțire și nazal. Xenobiotica, 40, 525–535 (2010).

15) Shang H, Guo K, Liu Y, Yang J, Wei H. Expresia constitutivă a ARNm CYP3A în țesuturile de porc miniaturale Bama. Gene, 524, 261–267 (2013).

16) Imaoka S, Hiroi T, Tamura Y, Yamazaki H, Shimada T, Komori M, Degawa M, Funai Y. Activarea mutagenă a 3-metoxi-4-aminoazobenzenului de către citocromul renal P450 de șoarece CYP4B1: Clonarea și caracterizarea CYP4B1 de șoarece. Arc. Biochim. Biophys., 321, 255–262 (1995).

17) Jarrar YB, Lee SJ. Funcționalitatea moleculară a polimorfismelor genetice ale citocromului P450 4 (CYP4) și implicațiile lor clinice. Int. J. Mol. Sci., 20, 4274 (2019).

18) Hiratsuka M, Matsuura T, Watanabe E, Sato M, Suzuki Y. Diferențele de sex în nivelul constitutiv al activităților hidroxilazei acidului lauric renal și proteinele legate de CYP4A la șoareci. Biol. Farmacia. Bull., 19, 512–517 (1996).

19) Degawa M, Miura S, Hashimoto Y. Citocromul microzomal renal P-450 dependent de androgeni, responsabil pentru N-hidroxilarea și activarea mutagenă a 3-metoxi-4-aminoazobenzenului în BALB/c mouse. Cancer Res., 50, 2729–2733 (1990).

20) Isern J, Meseguer A. Reglarea hormonală și caracterizarea regiunii 5′-flancare a genei Cyp4b1 de șoarece. Biochim. Biophys. Res. Commun., 307, 139–147 (2003).

21) Zhang Y, Klaassen CD. Reglarea hormonală a izoformelor Cyp4a în ficatul și rinichiul de șoarece. Xenobiotica, 43, 1055–1063 (2013).

22) Kojima M, Degawa M. Diferențele de sex în nivelurile ARNm constitutive ale CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29 și CYP3A46 în ficatul de porc: comparație între porcii Meishan și Landrace. Drug Metab. Pharmacokinet., 31, 185–192 (2016).

23) Kojima M, Sekimoto M, Degawa M. O nouă diferență legată de gen în expresia constitutivă a enzimelor subfamiliei citocromului hepatic P4501A la porcii Meishan. Biochim. Pharmacol., 75, 1076–1082 (2008).

24) Kojima M, Sekimoto M, Degawa M. Reglarea în jos mediată de androgeni a genelor subfamiliei CYP1A în ficatul de porc. J. Endocrinol., 207, 203–211 (2010).

25) Kojima M, Degawa M. Nivelul seric de androgen este determinat de moștenirea autosomal dominantă și reglează genele CYP legate de sex la porci. Biochim. Biophys. Res. Comun., 430, 833–838 (2013).

26) Waxman DJ, Holloway MG. Diferențele de sex în exprimarea enzimelor hepatice care metabolizează medicamentele. Mol. Pharmacol., 76, 215–228 (2009).

27) Buckley DB, Klaassen CD. Mecanismul de expresie a ARNm a UDP glucuronoziltransferazei divergente în funcție de gen în ficatul și rinichiul de șoarece. Drug Metab. Dispos., 37, 834–840 (2009).

28) Alnouti Y, Klaassen CD. Mecanisme de reglare specifică genului a sulfotransferazelor de șoarece (Sults). Xenobiotica, 41, 187–197 (2011).

29) Aida K, Negishi M. Un locus cu acțiune trans reglează reprimarea transcripțională a genei steroizilor 15 -hidroxilazei specifice femelei la șoarecii masculi. J. Mol. Endocrinol., 11, 213–222 (1993).

30) Squires EJ, Negishi M. Reglarea reciprocă a reprimării dependente de sex a testosteronului 15 -hidroxilazei (P-45015) în ficat și rinichi la șoarecii masculi de către androgeni. Dovezi pentru o singură genă. J. Biol. Chem., 263, 4166–4171 (1988).

31) Arbona JR, Marple DN, Russell RW, Rahe CH, Mulvaney DR, Sartin JL. Tipare secretoare și rata de clearance metabolică a hormonului de creștere porcin la porci selectați pentru creștere. J. Anim. Sci., 66, 3068–3072 (1988).

32) Kojima M, Degawa M. Diferențele de sex în expresia genelor constitutive a sulfotransferazelor și UDP-glucuronoziltransferazelor în ficatul de porc: reglarea mediată de androgeni. Drug Metab. Pharmacokinet., 29, 192–197 (2014).

33) Chowen JA, Frago LM, Argente J. Reglarea secreției de GH de către steroizi sexuali. EURO. J. Endocrinol., 151 (Suppl. 3), U95–U100 (2004).

34) Dubreuil P, Pelletier P, Couture Y, Lapierre H, Petitclerc D, Moris set J, Gaudreau P, Brazeau P. Efectele de castrare și testosteron asupra eliberării hormonului de creștere endogen și indus de somatocrină la porcii masculi intacți și castrați. Domest. Anim. Endocrinol., 6, 15–24 (1989).

35) Giustina A, Veldhuis JD. Fiziopatologia neuroreglării secreției de hormon de creștere la animalele de experiment și la oameni. Endocr. Rev., 19, 717–797 (1998).