Partea 2: Efluxul de magneziu din celulele Drosophila Kenyon este esențial pentru memoria pe termen lung normală și îmbunătățită de dietă

pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Vă rugăm să faceți clic pe ea la partea 1

Vă rugăm să faceți clic pe ea la partea 3

Apasa pePulbere de Cistanche tubulosa pentru memorie

Un rol pentru uex în corpurile ciupercilor

Pentru a localiza uex în creier, am profitat mai întâi de muștele transgenice VT23256-GAL4, în care GAL4 este condus de o secvență de 853 bp din primul intron al uex (Kvon și colab., 2014). UAS-EGFP condus de VT23256-a dezvăluit o expresie limitată în KC-urile ab cu o etichetă deosebit de puternică în neuronii nucleului ab (abc) (Figura 3A). De asemenea, am folosit CRISPR pentru a insera o etichetă de epitop HA-terminal C în cadrul deschis de citire uex (Figura 3 - suplimentul figura 1A). Aceste muște au fost viabile ca homozigoți, ceea ce indică faptul că proteina de fuziune UEX::HA rezultată își păstrează funcția. Muștele de imunocolorare care găzduiesc acest locus uex:: HA cu un anticorp anti-HA au dezvăluit etichetarea proeminentă a tuturor claselor majore de KC din MB, în plus față de expresia mai scăzută în creier (Figura 3B). Acest profil de expresie uex este susținut și de analizele de secvențiere cu o singură celulă (Figura 3-suplimentul figura 1B; Croset și colab., 2018; Davie și colab., 2018). Având în vedere rolul stabilit pentru ab KC în LTM olfactiv (Pascual și Pre´at, 2001; Yu et al., 2006; Krashes și colab., 2007; Krashes și Waddell, 2008), am motivat că un rol mnemonic pentru UEX poate implica expresie în KC.

Apoi am folosit expresia direcționată GAL4-a ARNi pentru a testa dacă 24 de orememorieperformanța necesară uex în MB. Muștele care exprimă uexRNAi (Perkins și colab., 2015) în toate KC abc (c739-GAL4; Yang și colab., 1995; Perisse și colab., 2013) sau numai în KC abc (NP7175- GAL4; Tanaka și colab., 2008) au prezentat normal imediatmemoriedar a afectat semnificativ memoria de 24 de ore (Figura 3C). În schimb, expresia uexRNAi în suprafața ab (abs, 0770-GAL4; Parisse și colab., 2013) sau a0 b0 KCs (c305a-GAL4; Krashes și colab., 2007) nu a modificat semnificativ performanța imediată sau LTM. Apetitiv normal 24 de orememoriePrin urmare, performanța este deosebit de sensibilă la expresia uex în neuronii abc. Pentru a reduce probabilitatea ca defectul de memorie asociat uexRNAi să rezulte dintr-o consecință a dezvoltării, am restricționat, de asemenea, expresia UAS-uexRNAi la vârsta adultă folosind controlul temporal mediat de GAL80ts (McGuire și colab., 2003). La 18˚C permisive, GAL80ts se leagă de GAL4 și suprimă funcția de activator transcripțional. La 30 °C restrictive, GAL80ts nu se mai poate lega de GAL4, ceea ce eliberează GAL4 pentru expresia directă a transgenei UAS-uexRNAi. Muștele au fost crescute prin dezvoltare la 18˚C și mutate la 30˚C după ecloziune. Restricționarea expresiei UAS-uexRNAi la ab KC la muștele adulte folosind c739-GAL4 cu GAL80ts a produs o specificitate similară de 24 de orememoriedefect față de cel observat atunci când UAS-uexRNAi a fost exprimat fără control temporal (Figura 3D-F). Am evaluat eficacitatea declanșării UAS-uexRNAi folosind locusul nostru etichetat uex::HA. Creierele de la muște heterozigote uex::HA care exprimă uexRNAi în KC-urile ab și g cu MB247-GAL4 (Zars și colab., 2000) au fost imunocolorate folosind anticorpi anti-HA. Compararea intensității imunomarcarii în creier de la uex::HA; MB247-GAL4/uexRNAi zboară cu cel de la uex::HA; Muștele MB247-GAL4/ plus au arătat că expresia uexRNAi a redus semnificativ semnalul anti-HA în KC-urile ab și g (Figura 3G și H). Acest rezultat demonstrează eficiența transgenei uexRNAi și utilitatea locusului uex::HA editat CRISPR/Cas9.

Apoi am testat dacă expresia în KC-uri specifice a unei transgene UAS-uex ar putea restabili 24 de orememoriecapacitatea de a uexMI01943 muște.Memorieperformanța muștelor uexMI{{10}}1943 care exprimă UAS-uex în KC-uri ab și g (MB{247-GAL4; Zars și colab., 2000) sau numai KC-urile ab (c{{5} }}GAL4) a fost îmbunătățit semnificativ față de cel al muștelor uexMI01943 și nu a fost distins statistic de cel al martorilor cu un locus uex intact (Figura 4A). În schimb, expresia UAS-uex în KC-urile a0 b0, abc sau abs nu s-a restabilitmemorieperformanța la muștele uexMI01943 și supraexprimarea uex în ab KC ale muștelor de tip sălbatic nu au crescut memoria de 24 de ore (Figura 4A și B). Normal 24 de orememorieperformanța ar putea fi, de asemenea, restabilită muștelor uexMI01943 dacă expresia UAS-uex a fost limitată la neuronii c739-GAL4 (toți ab KC) la vârsta adultă folosind controlul temporal mediat de GAL80ts (Figura 4C și D). Împreună, aceste experimente de ARNi și restaurare cu pierderea funcției stabilesc că UEX joacă un rol important în adulți.

Figura 3. Reducerea expresiei uex în celulele ab Kenyon (KC) afectează LTM. (A) Un fragment de promotor uex-GAL4 direcționează expresia GFP în KC abc. Anti-GFP imunocolorat uex-GAL4 (VT23256); Linia UAS-EGFP. (B) Imunocolorarea anti-HA a creierului care adăpostește locusul CRISPR/Cas9-editat uex::HA

arată o etichetare puternică a UEX în toate subdiviziunile majore ale corpului ciupercii (MB). Bare de scară 20 mm. (C) Knockdown RNAi a uex în toate KC-urile ab (c739- GAL4) sau doar abc (NP{7175-GAL4) afectate în mod specific 24 de orememorie. abs ({{0}}GAL4) sau a0 b0 (c305a-GAL4) expresia KC nu a avut niciun efect (p<0.05, figure="" 3="" continued="" on="" next-figure="" 3="">

ANOVA, n=6–10 pentru imediat și n=8–14 pentru 24 de orememorie). (D) S-a observat LTM defect dacă expresia uexRNAi a fost limitată la ab KC ale muștelor adulte folosind controlul temporal mediat de GAL80ts. (E) Performanța LTM nu a fost afectată dacă uexRNAi a fost menținut suprimat pe tot parcursul și (F) performanța LTM a fost restabilită la niveluri normale dacă expresia uexRNAi a fost re-suprimată timp de 3 zile (p<0.05, anova,="" n="6" for="" immediate="" and="" n="8" for="" 24="" hr="" memory).="" (g)="" immunostaining="" shows="" the="" effectiveness="" of="" uexrnai.="" fluorescence="" intensity="" in="" the="" ab="" and="" globes="" of="" uex::ha="" flies="" decreased="" significantly="" when="" uas-uexrnai="" was="" expressed="" with="" mb247-gal4.="" scale="" bars="" 20="" mm.="" (h)="" quantification="" of="" fluorescence="" intensity="" in="" g=""><0.05, t-test,="" n="6–8)." the="" online="" version="" of="" this="" article="" includes="" the="" following="" figure="" supplement(s)="" for="" figure="">

Figura suplimentară 1. Schema de construcție pentru linia uex::HA și diagramele tSNE ale expresiei uex.

ab KC-uri. Constatând că abc RNAi knockdown a uex produce amemoriedefectul (Figura 3C), dar expresia UAS-uex în abc nu salvează defectul mutant uexMI01943 (Figura 4A) sugerează că funcția UEX în KC-urile abc este esențială pentru LTM apetitiv, în timp ce atât KC-urile abc, cât și abs trebuie să aibă UEX funcțional pentru a susține LTM. În plus, capacitatea UAS-uex de a restabili performanța muștelor uexMI0194 oferă un sprijin suplimentar că uex este responsabil pentrumemorieafectarea muștelor uexMI01943.

Expresia uex din MB acceptă Mg2 plus -enhancedmemorie

Apoi am investigat dacă Mg2 plus hrănirea (4 zile cu 80 mM MgCl2) s-ar putea îmbunătățimemorieperformanță la muștele cu funcție uex compromisă. Muștele care poartă alela uexMI01943 (Figura 4F) sau cele care exprimă UAS-uexRNAi în KC-urile ab cu c739-GAL4 (Figura 4E) nu au prezentat o îmbunătățirememorieatunci când sunt hrănite cu 80 mM MgCl2, în comparație cu muștele hrănite cu 1 mM MgCl2. Mai mult, memoria îmbunătățită Mg2 plus a fost recuperată în muștele mutante uexMI01943 când expresia uex a fost restabilită în KC-urile ab (Figura 4F). Toate muștele de control (c739-GAL4, UAS-uexRNAi și UAS-uex) cu expresie uex neperturbate au prezentat o îmbunătățire semnificativămemoriecând este alimentat cu 80 mM comparativ cu 1 mM MgCl2. Supraexprimarea UAS-uex în ab KC cu c739-GAL4 la muștele cu un fundal genetic de tip sălbatic nici nu a îmbunătățit 24 de ore obișnuitememorie(Figura 4B), sau cea la muștele hrănite timp de 4 zile cu 40 sau 80 mM MgCl2 (Figura 4G). De asemenea, am testat dacă 4 zile de suplimentare cu 80 mM MgCl2 au îmbunătățit performanța memoriei de 24 de ore în urma antrenamentului spațial aversiv. Din nou,memoriemuștele mutante de tip sălbatic, dar nu uexMI01943, au prezentat îmbunătățiri (Figura 4 – suplimentul figura 1). Împreună, aceste rezultate indică faptul că este optimmemorieîmbunătățirea cu Mg2 plus hrănirea necesită și poate fi pe deplin susținută de funcția UEX în ab KC.

UEX este un transportator de magneziu conservat funcțional

Având în vedere conservarea secvenței puternice a UEX cu CNNM2/4 de mamifer, am testat dacă CNNM2 ar putea înlocui funcțional UEX și restabili defectul LTM al muștelor uexMI01943. Mai multe mutații punctuale în CNNM2 au fost identificate la pacienții umani cu hipomagnezemie, care este asociată cu o malformație a creierului și dizabilitate intelectuală (Arjona și colab., 2014). Introducerea mutațiilor echivalente în CNNM2 de șoarece (CNNM2E357K, CNNM2T568I, CNNM2S269W și CNNM2E122K) a arătat că aceste leziuni derivate de la pacient afectează transportul magneziului (Arjona și colab., 2014). Am construit muște purtând transgene de tip sălbatic și această variantă mutantă UAS-CNNM2 (Figura 5A). Colorarea pentru o etichetă HA C-terminală asociată a evidențiat expresia clară a tuturor variantelor UAS-CNNM2::HA în neuronii ab atunci când sunt conduse cu c739-GAL4 (Figura 5 - suplimentul figura 1). Cu toate acestea, numai expresia CNNM2 de tip sălbatic, și nu formele punctuale, în ab KC ale uexMI01943

muștele mutante restaurate 24 de orememorieperformanță (Figura 5B).

De asemenea, am testat dacă UEX poate media Mg2 plus extrudarea. UEX exprimat în celule HEK293 localizate pe membrana plasmatică și celulele încărcate cu Mg2 plus și indicatorul Mg2 plus Magnesium Green a prezentat un eflux rapid de Mg2 plus (Figura 5 - Figura supliment 2 și Video 1), în comparație cu celulele transfectate cu vector gol. Extrudarea Mg2 plus condusă de UEX a fost vizibil mai puțin eficientă decât în ​​celulele care exprimă CNNM4 uman (Figura 5 – suplimentul din figura 2), despre care se știe că are o eficiență similară cu CNNM2 (Hirata și colab., 2014). Cu toate acestea, nu știm dacă expresia UEX și CNNM4 este echivalentă. Cu toate acestea, demonstrarea complementării între specii și a activității de eflux Mg2 plus definește UEX ca un omolog funcțional al CNNM2/4 de mamifer.

Figura 4. Salvarea defectului LTM la muștele uexMI01943. Restaurarea expresiei UAS-uex în celulele ab și g (MB247-GAL4) sau ab Kenyon (KCs) salvate 24 de orememorieperformanța uexMI01943 muște, în timp ce expresia în abc, abs sau a0 b0 KC nu a făcut-o (p<0.05, anova="" and="" t-test,="" n="8–12)." (b)="" overexpression="" of="" uas-uex="" in="" ab="" kcs="" did="" not="" enhance="" 24="" hr="">memorieperformanță la muștele de tip sălbatic (ANOVA, n=8–12). (C) LTM defectuos a fost salvat dacă expresia UAS-uex a fost limitată la ab KC ale muștelor adulte folosind controlul temporal mediat GAL80ts (p<0.05, anova,="" n="6" for="" immediate="" and="" n="8" figure="" 4="" continued="" on="">

timp de 24 de orememorie), dar (D) a rămas defect dacă expresia UAS-uex nu a fost eliberată. (E)Memorieîmbunătățirea cu Mg2 plus dietetic este susținută de UEX în ab KC. Memoria muștelor care exprimă UAS-uexRNAi în ab KC nu poate fi îmbunătățită cu Mg2 plus hrănire (test t, n=8). (F) Memoria muștelor mutante uexMI01943 nu poate fi îmbunătățită cu hrana Mg2 plus, dar îmbunătățirea a fost restabilită prin exprimarea UAS-uex în ab KC (p<0.05, t-test,="" n="8–12)." (g)="" the="" memory="" of="" wild-type="" flies="" was="" not="" sensitized="" to="" mg2+="" enhancement="" by="" overexpressing="" uas-uex="" in="" ab="" kcs.="">Memoriea fost îmbunătățită dacă muștele au fost hrănite cu 80 mM MgCl2, dar nu cu MgCl2 suboptim de 40 mM (p<0.05, anova,="" n="">

Versiunea online a acestui articol include următoarele suplimente pentru figura 4:

Suplimentul figura 1. Mg2 plus hrănirea LTM îmbunătățită după antrenament aversiv spațial la muște mutante de tip sălbatic, dar nu uexMI01943.

Este necesar un domeniu CNBH intact pentrumemorie

Având în vedere rolul stabilit pentru semnalizarea cAMP înmemorie- plasticitate relevantă la nevertebrate și mamifere (Kandel, 2012), am testat importanța domeniului CNBH în UEX. Am construit muște purtând o transgenă CNBH UAS-uexR622K cu mutații punctiforme (Figura 6A). Substituția echivalentă a aminoacizilor R622K elimină legarea cAMP în subunitatea de reglare a protein kinazei dependente de cAMP, PKA (Bubis și colab., 1988). Exprimarea UAS-uexR622K în neuronii ab cu c739-GAL4 nu a restabilit performanța memoriei de 24 de ore sau a modificatmemorieperformanța muștelor mutante uexMI01943 (Figura 6B).

De asemenea, am folosit CRISPR pentru a încerca să introducem mutația R622K în CNBH al locusului uex nativ (Bassett et al., 2013; Gratz și colab., 2013; Yu și colab., 2013). În mod neașteptat, această abordare nu a introdus înlocuirea R622K, ci a înlocuit T626 în CNBH cu NRR. Din fericire, muștele homozigote pentru această alelă uexT626NRR au fost viabile ca adulți, spre deosebire de acelea homozigote pentru uexD, ceea ce sugerează că UEX-ul codificat uexT626NRR își păstrează funcția. Cu toate acestea, muștele homozigote pentru uexT626NRR sau heterozigote uexT626NRR/uexMI01943 au prezentat o durată puternică de 24 de orememoriedefect (Figura 6C). Imediatmemoriea fost, de asemenea, afectată la muștele homozigote uexT626NRR, spre deosebire de muștele care poartă toate celelalte combinații de alele uex. In plusmemoriede muște uexT626NRR nu au putut fi îmbunătățite cu hrana Mg2 plus (Figura 6D). Prin urmare, mutația uexT626NRR decuplează esențialul

Figura 5. uex codifică un transportor Mg2 plus conservat evolutiv. (A) Model al structurii proteinei CNNM2 care prezintă mutații punctuale relevante clinic.

Adaptat și modificat din Arjona și colab., 2014. (B) Supraexprimarea CNNM2 de tip sălbatic, dar nu mutant, în celulele ab Kenyon salveazămemoriedefect al muștelor mutante uexMI01943 (pag<0.05, anova,="" n="6–8" for="" immediate="" and="" n="8–12" for="" 24="" hr="">

Versiunea online a acestui articol include următoarele suplimente pentru figura 5:

Figura supliment 1. Expresia transgenică a variantelor mutante ale CNNM2.

Figura supliment 2. Mg2 dependent de UEX plus eflux în celule HEK293.

rol pentru uex dintr-o funcție înmemorieși sugerează că activitatea reglată a nucleotidelor ciclice este esențială pentru ca UEX să susțină normal și Mg2 plus - îmbunătățitmemorie. Deși am confirmat utilizând Western blotting că o proteină de lungime completă este exprimată în muștele uexT622NRR (Figura 6E), anticorpul nostru nu ne-a permis să verificăm dacă proteina UEXT626NRR se localizează corespunzător în creier. Prin urmare, sunt necesare lucrări suplimentare pentru a caracteriza localizarea celulară, legarea cAMP și funcția de transport Mg2 plus a proteinei codificate de această alele uexT626NRR.

Manipularea cronică a cAMP modifică localizarea UEX în KC

Am testat dacă cAMP ar putea modifica în mod acut activitatea UEX prin aplicarea forskolinei pe celulele HEK293 care exprimă UEX. Cu toate acestea, nu a fost observată nicio modificare evidentă a dinamicii Mg2 plus eflux dependentă de UEX (datele nu sunt prezentate). Prin urmare, am testat dacă expresia KC a UEX:: HA a fost modificată la muștele cu modificări cronice ale

Metabolismul cAMP, prin introducerea de mutații relevante pentru învățare în adenilat ciclaza stimulată de Ca2 plus - codificată de rutabaga sau fosfodiesteraza specifică cAMP codificată de dunce. Imunocolorarea anti-HA a creierului de la rut2080; uex::HA și dnc1; Muștele uex::HA au dezvăluit o schimbare izbitoare în localizarea UEX (Figura 7A și B și videoclipurile 2–4). În timp ce UEX::HA este de obicei detectat în lobii tuturor KC-urilor la un nivel aproximativ echivalent la muștele de tip sălbatic, etichetarea a fost mai mică în lobul MB g și mai pronunțată în KC-urile abc în fundalurile mutante rut2080 și dnc1 (Figura 7C) , deși expresia generală MB a UEX::HA este similară între muștele de tip sălbatic și mutante (Figura 7D). În plus, analizele Western blot ale proteinei extrase din capetele acestor muște nu au evidențiat o diferență semnificativă în nivelurile generale de expresie UEX::HA (datele nu sunt prezentate). Prin urmare, aceste date sunt în concordanță cu funcția UEX de reglare a cAMP și, probabil, cu localizarea sa celulară în KC.

UEX este necesar să mențină un [Mg2 plus ]i fluctuant în ab KC

Deși MagFRET poate raporta [Mg2 plus ], nu răspunde suficient de rapid pentru a înregistra semnale evocate de stimul. Prin urmare, am construit muște care găzduiesc transgene UAS pentru doi senzori Mg2 plus codați genetic mai noi, MagIC (fără FRET; Koldenkova și colab., 2015) și MARIO (bazat pe FRET; Maeshima și colab., 2018). Nu am putut detecta expresia UAS-MARIO în creierul muștei și, prin urmare, am putut folosi doar UAS-MagIC. Sa raportat că MagIC răspunde cel mai puternic la Mg2 plus, dar și într-o măsură mai mică la Ca2 plus (Koldenkova și colab., 2015). Prin urmare, am verificat mai întâi specificitatea răspunsurilor MagIC într-un preparat de creier de muscă ex vivo permeabilizat de celule. Creierele au fost îndepărtate de la muștele care exprimă UAS-MagIC în ab KC cu c739-GAL4 (Figura 8A), incubate într-un vas cu soluție salină (Barnstedt și colab., 2016) și modificările fluorescenței au fost monitorizate înainte și după aplicarea băii. - ţinerea substanţelor chimice. În timp ce aplicarea MgCl2 a evocat o creștere dependentă de doză a răspunsului MagIC, chelarea Mg2 plus cu EDTA a produs o scădere dependentă de doză (Figura 8B și Videoclipurile 5 și 6). În comparație, CaCl2 a înregistrat doar o ușoară creștere la cele mai mari concentrații, în timp ce mai mult Ca2 plus chelator selectiv EGTA a avut un efect redus (Figura 8B). Aceste rezultate demonstrează că UAS-MagIC poate monitoriza [Mg2 plus ]i în KC-urile ab din creierul muștei.

S-a demonstrat că creșterea AMPc intracelular provoacă flux de Mg2 plus din celulele de mamifere (Romani și Scarpa, 2000; Vormann și Gu¨nther, 1987; Jakob și colab., 1989; Romani și Scarpa, 1990b; Romani și Scarpa, 1990a; Vormann și Gu¨nther, 1987; Gu¨nther şi colab., 1990; Howarth şi colab., 1994). Deoarece experimentele noastre au indicat, de asemenea, că AMPc ar putea regla UEX, apoi am testat dacă stimularea sintezei cAMP cu forskolină (FSK) ar putea altera semnalele MagIC în ab.

Figura 6. Domeniul de omologie de legare ciclică a nucleotidelor (CNBH) al UEX este necesar pentru memorie. (A) Schemă care arată detaliile secvenței domeniului CNBH în UEX și modificările de aminoacizi efectuate în uexR622K și uexT626NRR. (B) Exprimarea unei transgene UAS-uexR622K în celulele ab Kenyon nu a salvat defectul LTM al muștelor mutante uexMI01943 (p<0.05, anova,="" n="8)." immediate="" memory="" was="" also="" unaffected.="" (c)="" flies="" homozygous="" for="" uext626nrr="" have="" defective="" short-="" and="" long-term="" memory,="" while="" trans-heterozygous="" uext626nrr/uexmi01943="" flies="" only="" exhibit="" impaired="" ltm=""><0.05, anova,="" n="8)." figure="" 6="" continued="" on="" next="">

Figura 6 a continuat

(D) Mg2 plus alimentar nu a îmbunătățit memoria muștelor homozigote uexT626NRR/ uexT626NRR (p<0.05, t-test,="" n="8)." (e)="" western="" blot="" analysis="" of="" uex="" protein="" expression="" in="" fly="" head="" extracts.="" genotype="" from="" left="" to="" right:="" wild-type,="" uext626nrr/uext626nrr,="" uext626nrr/+,="" uext626nrr/uexmi01943,="" uexmi01943/+.="" the="" blot="" was="" first="" probed="" with="" anti-uex="" antibody="" (upper="" panel),="" and="" then="" stripped="" and="" re-probed="" with="" anti-tubulin="" antibody="" (lower="" panel)="" as="" a="" loading="">

KC-uri. Pentru aceste experimente am folosit din nou un preparat ex vivo pentru creier, dar de data aceasta celulele nu au fost permeabilizate. S-a demonstrat că FSK de 30 mM evocă o creștere maximă a AMPc în KC, care aproximează cea observată în urma condiționării apetitive (Louis et al., 2018). Aplicarea 30 mM FSK la c739-GAL4; Creierele UAS-MagIC au evocat o dinamică consistentă în fluorescența MagIC. După o creștere inițială bruscă, răspunsurile au scăzut încet înapoi spre linia de bază, înainte de a crește din nou lent până la un punct în care semnalul a început să fluctueze. (Figura 8C și D și Video 7). Semnăturile cheie ale acestui răspuns au fost înregistrate numai în semnalul Venus sensibil la Mg2 plus (Figura 8D). În contrast, fluorescența mCherry nu a fluctuat, ci a scăzut constant de-a lungul timpului înregistrării (probabil ca rezultat al foto-albirii), demonstrând că fluctuația semnalului Venus nu este un artefact de mișcare (Figura 8E). Foarte important, răspunsurile MagIC induse de FSK au fost mai mari decât cele după aplicarea soluției saline (Figura 8-figura suplimentul 1A). Cu toate acestea, un răspuns fluctuant s-a dezvoltat, de asemenea, după aplicații cu soluție salină (Figura 8 - figura suplimentului 1B), sugerând că semnalul ritmic MagIC poate fi un răspuns general la o creștere a [Mg2 plus ]i care urmează perturbării celulare.

S-a raportat anterior că Drosophila MB prezintă o oscilație lentă ({0}}.004 Hz) Ca2 plus în creierul ex vivo, în timp ce o oscilație mult mai rapidă de 20 Hz este evocată de mirosuri la lăcustele MB (Laurent și Naraghi, 1994; Rosay și colab., 2001). Deși caracterizarea noastră inițială a MagIC în creierul muștei a indicat un răspuns preferențial la Mg2 plus (Figura 8B), am testat totuși în mod explicit dacă FSK a indus fluctuația [Ca2 plus ]i a KC-urilor ab, folosind expresia UAS-GCaMP6f (Chen și al., 2013). FSK a indus o creștere întârziată a răspunsului GCaMP, dar nu a fost observată o activitate oscilatorie clară (Figura 8 - suplimentul figura 1C-E).

În cele din urmă, am testat dacă răspunsurile MagIC observate au fost sensibile la starea genei uex. Am generat muște uexMI01943 care au adăpostit și c379-GAL4 și UAS-MagIC și am comparat răspunsurile MagIC induse de FSK și soluție salină cu cele ale muștelor cu un locus uex de tip sălbatic. Muștele mutante uexMI01943 au arătat un răspuns FSK crescut față de cel al muștelor de tip sălbatic, în timp ce răspunsurile evocate de soluție salină nu se distingeau (Figura 8F și G). Răspunsurile evocate de analogul inactiv FSK, ddFSK, au fost, de asemenea, insensibile la statutul uex (Figura 8 - suplimentul figura 1F). Prin urmare, mutația uex crește în mod selectiv răspunsurile MagIC evocate de FSK.

De asemenea, am observat că urmele MagIC de la muștele mutante uex nu au prezentat un semnal fluctuant (Figura 8H și Figura 8 - suplimentul figura 1G). Pentru a cuantifica această diferență, am calculat densitatea spectrală a puterii medii (PSD) a urmelor din uexMI01943 și muștelor de tip sălbatic tratate cu FSK sau ser fiziologic. În ambele condiții, PSD-ul mediu a fost deplasat semnificativ spre stânga către frecvențe mai joase la mutanții uexMI01943 în comparație cu controalele de tip sălbatic (Figura 8I). Creierele de muște de tip sălbatic au avut o activitate oscilativă semnificativ mai mare centrată în jurul valorii de 0,015 Hz decât cele de la mutanții uexMI01943. Prin urmare, aceste date sugerează că UEX este necesar pentru menținerea ritmică lentă a KC [Mg2 plus ]i. Important, descoperirea că semnalele MagIC sunt crescute și modificate la mutanții uex confirmă că răspunsurile MagIC observate sunt dependente de Mg2 plus. Mai mult, ei sugerează că KC a exprimat limitele UEX Mg2 plus acumulare, în concordanță cu un rol în extrudare.

Discuţie

Am observat o îmbunătățire a performanței LTM olfactive atunci când muștele au fost hrănite timp de 4 zile înainte de antrenament cu hrană suplimentată cu 80 mM [Mg2 plus]. Acest rezultat seamănă cu cel raportat la șobolani, deși au fost necesare perioade mai lungi de hrănire pentru a ridica creierul [Mg2 plus ] la niveluri de îmbunătățire a memoriei (Slutsky et al., 2010). O diferență în timpul optim de hrănire poate reflecta dimensiunea animalului și poate o biodisponibilitate mai mare a Mg2 plus alimentar la Drosophila. În timp ce Mg2 plus -L-treonat (MgT) a fost un mijloc mai eficient de a furniza Mg2 plus decât clorură de magneziu la șobolani (Slutsky et al., 2010), am observat o îmbunătățire similară a performanței memoriei atunci când muștele au fost hrănite cu clorură de magneziu. , sulfat de magneziu sau MgT (datele nu sunt prezentate).

Figura 7. Expresia uex a celulei Kenyon (KC) este modificată la muștele mutante rutabaga și dunce. (A) Creierele colorate cu anti-HA dezvăluie că localizarea proteinei UEX::HA este modificată în rut2080; uex::HA și dnc1; uex::HA zboară, devenind mai proeminent în abc KC (săgeți). Bare de scară 20 mm. (B) Imagini mărite ale corpurilor de ciuperci (MB) care evidențiază expresia abc KC în muștele mutante rut2080 și dnc1, în comparație cu muștele uex::HA de tip sălbatic. Bare de scară 20 mm. (C) Cuantificarea intensității fluorescenței. Stânga, micrografie cu o linie de măsurare prin vârful lobului a și ROI dreptunghiulare pentru lobul g și o zonă de control. Profilurile de intensitate a fluorescenței medii, relative de-a lungul vârfului lobului arată un semnal semnificativ mai mare la muștele mutante rut2080 și dnc1 în regiunea centrală ocupată de KC-urile miezului ab (*p<0.05, anova,="" n="6–10)." right,="" the="" relative="" intensity="" in="" the="" g="" lobe="" was="" significantly="" lower="" in="" rut2080="" and="" dnc1="" mutant="" flies,="" as="" compared="" to="" wild-type="" controls=""><0.05, anova,="" n="6–10)." scale="" bars="" 10="" mm.="" (d)="" left,="" micrograph="" showing="" circular="" rois.="" right,="" figure="" 7="" continued="" on="" quantification.="" total="" intensity="" over="" all="" six="" rois="" on="" the="" mbs="" was="" not="" significantly="" different="" between="" the="" rut2080,="" dnc1,="" and="" wild-type="" brains="" (p="">0.13; ANOVA, n=6–10).

Creșterea [Mg2 plus ]e în creierul șobolanului duce la o reglare compensatorie a exprimării subunității NR2B a NMDAR și, prin urmare, la o creștere a proporției de NMDAR-uri care conțin NR2B postsinaptic. Această clasă de NMDAR-uri au un timp de deschidere mai lung (Chen și colab., 1999; Erreger și colab., 2005), sugerând că această schimbare în compoziția subunității reprezintă un mecanism de plasticitate homeostatică (Turrigiano, 2008) pentru a se adapta blocului NMDAR crescut impus de crescând [Mg2 plus ]e. În plus, supraexprimarea NR2B în creierul anterior al șoarecelui poate îmbunătăți facilitarea și învățarea sinaptică șimemorieperformanță (Tang și colab., 1999), susținând o creștere a NR2B fiind un factor important în Mg2 plus -enhancedmemorie. Cu toate acestea, chiar și în studiul original in vitro al plasticității sinaptice îmbunătățite cu Mg2 plus (Slutsky și colab., 2004), sa observat că curenții NMDAR au fost insuficienti pentru a explica pe deplin modificările observate.

Studiile noastre de pierdere a funcției subunității NMDAR în Drosophila KC nu au afectat obișnuit sau Mg2 plus îmbunătățitmemorie. În plus, nu am detectat o schimbare evidentă a nivelurilor de expresie la nivelul creierului a subunităților receptorilor de glutamat la muștele hrănite cu Mg2 plus. Deși activitatea NMDAR a fost anterior implicată în Drosophila olfactivmemorie, efectele au fost atribuite în mare parte funcționării în afara MB (Xia și colab., 2005; Wu și colab., 2007). În plus, supraexprimarea Nmdar1 în toți neuronii, sau în mod specific în toate KC, nu a modificat STM sau LTM. Supraexpresia ectopică în MB a unei versiuni NMDARN631Q, care nu poate fi blocată de Mg2 plus , LTM afectat (Miyashita et al., 2012). Cu toate acestea, această mutație permite intrarea Ca2 plus legată de ligand, fără a fi nevoie de depolarizare neuronală corelată, care poate perturba funcția KC în moduri neașteptate. Este poate cel mai demn de remarcat faptul că depresia sinaptică relevantă pentru învățare în MB poate fi determinată de semnalele de predare dopaminergice transmise sinapselor de ieșire colinergice de la KC sensibile la mirosuri la MBON-uri specifice (Claridge- Chang și colab., 2009; Aso și colab., 2012). Burke și colab., 2012; Liu și colab., 2012; Owald și colab., 2015; Hige și colab., 2015; Barnstedt și colab., 2016; Parisse și colab., 2016; Aso și colab., 2014; Owald și Waddell, 2015; Handler și colab., 2019). Este posibil ca KC să primească glutamat, dintr-o sursă care nu a fost încă identificată, dar în prezent nu există un loc evident în rețeaua MB pentru plasticitatea dependentă de NMDAR. Prin urmare, dovezile sugerează că Drosophila LTM normală și Mg2 plus îmbunătățită este independentă de semnalizarea NMDAR în KC. În plus, măsurătorile noastre MagFRET indică faptul că hrana cu Mg2 plus crește, de asemenea, [Mg2 plus ]i al KC-urilor ab cu aproximativ

mate 50 mM.

Am identificat un rol pentru uex, ortologul unic de muscă al familiei conservate evolutiv de Mg2 de tip CNNM plus transportatori de eflux (Ishii et al., 2016). Există patru gene CNNM distincte la șoareci și oameni, cinci la C. elegans și două la peștele zebra (Ishii și colab., 2016; Arjona și colab., 2013). Locul uex produce patru transcrieri ARNm îmbinate alternativ, dar toate codifică aceeași proteină 834 aa. Rolul precis al proteinelor CNNM în transportul Mg2 plus este oarecum controversat (Funato și colab., 2018a; Arjona și de Baaij, 2018; Funato și colab., 2018b; Gimenez-Mascarell și colab., 2019). Unii propun că proteinele CNNM sunt transportatori direcți de Mg2 plus, în timp ce alții susțin că acestea funcționează ca senzori ai concentrației intracelulare de Mg2 plus [Mg2 plus ]i și/sau regulatori ai altor transportatori de Mg2 plus. Am descoperit că expresia ectopică a Drosophila UEX îmbunătățește efluxul Mg2 plus în celulele HEK293 și că UEX endogen limitează [Mg2 plus ]i în ab KC din creierul muștei. Prin urmare, dacă UEX nu este el însuși un transportor Mg2 plus, trebuie să fie

capabil să interacționeze eficient cu transportatorii umani de Mg2 plus eflux și să influențeze extrudarea Mg2 plus în Drosophila. Deoarece UEX este singura proteină CNNM din muscă, poate îndeplini toate rolurile celor patru CNNM-uri individuale ale mamiferelor. Cu toate acestea, capacitatea șoarecelui CNNM2 de a restabilimemoriecapacitatea de a uex muște mutante sugerează cămemorie-funcția UEX relevantă poate fi înlocuită cu cea a CNNM2.

Interesant, niciuna dintre variantele relevante pentru boală ale CNNM2 nu a fost capabilă să completezememoriedefect al muștelor mutante uex. Varianta CNNM2 T568I înlocuiește un singur aminoacid în al doilea domeniu CBS (Arjona și colab., 2014). Proteina tirozin fosfatazele oncogene din familia PRL (fosfataza ficatului regenerant) se leagă de domeniile CBS ale CNNM2 și CNNM3 și pot inhiba funcția lor de transport Mg2 plus (Hardy și colab., 2015; Gimenez-Mascarell și colab., 2017). ; Zhang și colab., 2017). Prin urmare, va fi interesant să testăm rolul domeniilor UEX CBS și dacă fly PRL-1 reglementează activitatea UEX.

Analiza ARN-seq arată că uex este puternic exprimat în tractul digestiv și în sistemele nervoase ale muștelor adulte și larve, precum și în ovare (Gelbart și Emmert, 2010; Croset și colab., 2018; Davie și colab., 2018), sugerând că multe mutații uex vor fi pleiotrope. Alela noastră uexD, care șterge 272 de aminoacizi (inclusiv o parte a celui de-al doilea CBS și întregul domeniu CNBH) de la capătul C-terminal UEX, are ca rezultat letalitatea dezvoltării atunci când este homozigot, demonstrând că uex este o genă esențială. CNNM4 de mamifer este localizat pe membrana bazolaterală a celulelor epiteliale intestinale (Yamazaki et al., 2013). Acolo se crede că funcționează în transportul transcelular de Mg2 plus prin schimbul de Mg2 plus intracelular cu Na plus extracelular după intrarea apicală prin canalele TRPM7. Letalitatea la Drosophila ar putea apărea din incapacitatea de a absorbi suficient Mg2 plus prin intestinul larvei. Cu toate acestea, expresia restricționată neuronal a uexRNAi cu elav-GAL4 duce, de asemenea, la letalitatea larvelor (datele nu sunt prezentate), sugerând că UEX are un rol suplimentar în dezvoltarea timpurie a sistemului nervos, cum ar fi CNNM2 la oameni și peștele zebra (Arjona și colab., 2014; Accogli). et al., 2019). Poate în mod surprinzător, muștele care poartă combinații homozigote sau trans-heterozigote ale mai multor alele uex hipomorfe au apetitive și aversive defectuoase.memorieperformanță, dar par să nu fie afectate altfel.

Modificarea genetică a locusului uex pentru a adăuga o etichetă HA C-terminală la proteina UEX ne-a permis să-i localizăm expresia în creier. Etichetarea este deosebit de importantă în toate clasele majore de KC. Restricționarea exprimării uex la toate ab KC ale muștelor adulte sau chiar doar subsetul abc a reprodus defectul LTM. Deteriorarea LTM a fost evidentă dacă expresia uexRNAi în neuronii ab

Figura 8. UEX limitează o creștere a [Mg2 plus ]i și susține o oscilație lentă în celulele ab Kenyon (KC). (A) Explant creierul muștei care exprimă UAS-MagIC condus de c739-GAL4. Panoul superior, vedere cu contrast de fază cu câmp larg; panouri din mijloc, vederi fluorescente ale canalelor Venus și mCherry; panoul inferior, o secțiune confocală la nivelul somatei KC care arată canalele Venus și mCherry. Bare de scară 20 mm. (B) MagIC răspunde selectiv la modificările [Mg2 plus ]i în KC. Urme de raport MagIC după aplicarea în baie a 10, 20 sau 40 mM MgCl2 sau CaCI2; 5, 10 sau 20 mM EDTA sau EGTA. (C) Urma reprezentativă a figurii 8 a continuat în continuare - Figura 8 a continuat

Raportul MagIC în urma aplicării FSK arată o undă inițială urmată de o creștere treptată și dezvoltarea unei oscilații lente. (D) Răspunsurile primare rezultă din modificări ale semnalului Venus sensibil la Mg2 plus. (E) Semnalul mCherry prezintă o decădere constantă. (F) Răspunsurile MagIC evocate de FSK sunt mai mari la muștele mutante uex. Răspunsurile MagIC medii arată că FSK a indus o creștere semnificativ mai mare a mutanților uexMI01943 decât la muștele de tip sălbatic. (G). Răspunsurile MagIC evocate de soluție salină medii nu au fost modificate semnificativ la muștele mutante uex. (H) Urmele individuale ale canalelor Venus (verde) și mCherry (roșu) arată că oscilația lentă este evidentă numai în canalul Venus al muștelor de tip sălbatic, dar nu mutante uex. (I) Analiza densității spectrale de putere (PSD) a seriilor de timp de la 200 la 900 s a tuturor datelor arată că urmele de la muștele de tip sălbatic au o activitate oscilativă semnificativ mai mare, centrată în jurul valorii de 0,015 Hz, decât cele de la muștele mutante uex.

Versiunea online a acestui articol include următoarele suplimente pentru figura 8:

Figura supliment 1. Urme individuale pentru imagistica MagIC și GCaMP.