A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 1

Planta Cistanche are un efect neuroprotector foarte bun

2.6. Efectele anti-apoptotice ale citokininelor determinate de măsurarea activității caspazei-3/7

După cum se arată în testele de colorare PI descrise mai sus, SAL a indus creșteri ale ratelor de moarte a celulelor SH-SY5Y. Deoarece SAL este asociat atât cu apoptoza, cât și cu necroza [51], am investigat, de asemenea, activarea caspazei-3 și 7 (casp{-3/7) ca marker specific al apoptozei (faza de execuție) [52] după expunerea celulelor la CK. Activitățile de caspază-3/7 înregistrate după tratamentul cu fiecare dintre compușii de testat au fost normalizate în raport cu cele înregistrate după tratamentul cu 50{{3{0}} uM SAL (setat la 100 procente). După cum se arată în Figura 4, bine-cunoscutul inhibitor de caspază Ac-DEVD-CHO (inclus ca control specific, legat de apoptoză) a inhibat puternic activitatea caspazei-3/7 la concentrații sub-micromolare (la 36,3 ± 2,66 și 25,2). ± 2,69 la sută din nivelurile din celulele tratate numai cu SAL la 0,05 și, respectiv, 0,5 uM). Niveluri similare de inhibiție au fost observate anterior [53] în diferite modele de neurodegenerare bazate pe celule SH-SY5Y in vitro. Controlul pozitiv NAC a redus, de asemenea, în mod semnificativ activitatea caspazei-3/7, la 88,7 ± 1,87 la sută și 78,5 ± 2,56 la sută din nivelurile induse de SAL la 100 uM și, respectiv, 1000 uM. CK-urile testate au avut o gamă largă de efecte asupra activităților caspazei-3/7. Interesant, din cauza ribozidelor CK, doar cZR a avut efecte semnificative asupra activităților la 0,1 uM (reducându-le la 83,3 ± 4,33% din nivelurile induse de SAL), în timp ce iPR la 1 uM nu a avut o reducere semnificativă a casp-3 ,7. În cele din urmă, K3G a scăzut activitatea caspazei-3/7 cu efect maxim la 10 uM (la 81,7 ± 4,31% din nivelul indus de SAL). În general, SAL a indus o creștere de 1,6-ori a activității caspazei-3/7 în comparație cu celulele de control sănătoase (CTR, Figura 4), în conformitate cu rezultatele unui studiu anterior, în care un studiu similar Au fost utilizate concentrația SAL (400 uM) și aceeași linie celulară [54]. Se știe că NAC influențează activitatea caspazei-3/7 în mai multe modele deneuronalemoartea [55–58]. Cu toate acestea, rezultatele prezentate aici oferă prima demonstrație a caspazei lor-3/7 într-un model indus de SAL bazat pe celule SH-SY5Y deneuronalemoarte. Martorul pozitiv a redus activitatea caspazei-3/7 indusă de 500 uM SAL într-un mod similar cu CK, dar cZR și K3G au fost eficiente chiar și la concentrații submicromolare sau micromolare. Alte studii cu modele de stres asociate cu PD (inhibitorul de proteazom MG 132- sau H2O{2-a indus toxicitate în celulele SH-SY5Y [17] și fibroblaste [15]) și boala Huntington (modelul de foame în ser în Celulele PC12 [19]) au arătat, de asemenea, că CK-urile K și tZR pot avea activități anti-apoptotice (caspază-3) [17] și că atât K cât și tZR pot avea activități anti-senescență [17,19] . Mai mult, asocierile dintre scăderea activării casp-3,7 șineuroprotectoractivitatea au fost raportate pentru modelele SAL și SAL [54,59,60].

Figura 4. Activitatea caspazei-3/7 în modelul de PD indus de SAL. Triplicat în cel puțin patru zile independente. * P în comparație cu vehiculul cu 500 uM SAL, # P în comparație cu vehiculul fără 500 uM SAL.

2.7. Identificarea activității neuroprotectoare citokininei în modelul de moarte celulară indusă de glutamat

Deoarece celulele SH-SY5Y nu exprimă toate subunitățile receptorului NMDA [61], cel mai probabil mecanism de toxicitate pentru glutamat (Glu) este blocarea antiportorului Xc cistină/glutamat cu inducerea masivă a stresului oxidativ [62]. Autorii anteriori au demonstrat deja o asociere între moartea celulară indusă de glutamat și necroptoză în celulele SH-SY5Y [63] și importanța activării caspazei-3 în toxicitatea indusă de glutamat față de acestea [62,64]. Mai multe studii au arătat, de asemenea, apariția morții celulare determinate de fier (feroptoză) după intoxicația cu glutamat [62,65,66] și au indicat apariția a trei tipuri de moarte celulară (necroptoză, apoptoză și ferroptoză) în urma blocării Xc. -sistem antiporter. Pentru a finaliza o evaluare cuprinzătoare aneuroprotectorpotenţialul celui testatcitokinine, sistemul de testare a morții celulare indusă de glutamat a fost inclus într-un panou analitic cu cel cunoscutneuroprotectorchelator de fier deferoxamină (DFO) și inhibitor de necroptoză necrostatina-1 (NEC-1) [67] ca martori pozitivi. Aici, celulele SH-SY5Y au fost diferențiate timp de 48 de ore, apoi tratate cu 160 mM Glu sau în co-tratamentul acestora cu diversecitochininăconcentrații ({{0}}.1–10 uM) timp de 24 de ore și colorate cu PI. În acest model, efectul Glu asupra morții celulare a fost de 100% semnal PI, astfel încât a fost evaluată reducerea morții celulare de către compușii de testat. Glu a indus o creștere de aproape 4-ori a morții celulare în comparație cu martorii sănătoși SH-SY5Y (26,1 ± 0,42 la sută). Screeningul controalelor pozitive șicitokininea arătat că atât martorii pozitivi NEC{0}} (50 uM, 76,6 ± 2,51 la sută) cât și DFO (10 uM, 84,2 ± 4,54 la sută) au scăzut moartea celulară indusă de glutamat. După cum se arată în Figura 5A, din panoul decitokinine, doar treicitokinineau putut să protejezeneuron-cum ar fi celulele SH-SY5Y într-un mod similar cu martorii pozitivi. Cel mai activcitokinineau fost trans-zeatina (tZ) (0,1 uM, 79,5 ± 2,91 la sută; 1 uM, 81,3 ± 2,77 la sută) și cis-zeatina (CZ) (0,1 uM, 82,1 ± 3,29 procent; 1 uM, {{20}},2 ± 2,89 la sută) și kinetina (K) (1 uM, 88,0 ± 3,76 la sută; 1{0 uM, 79,9 ± 3,44 la sută). Pentru a confirma activitatea lor promițătoare, a fost utilizat un test ortogonal pentru a elucida mai detaliat efectele biologice ale CK în acest model: un test de eliberare a lactat dehidrogenazei (LDH) [68], care a arătat, de asemenea, o ({36}}ori) dramatică. creșterea toxicității după tratamentul cu Glu. În mod interesant, determinarea eliberării LDH ne-a permis să diferențiem între activitățile CK și martorii pozitivi (NEC-1 și DFO). CK au avut activitate de protecție moderată, dar semnificativă (tZ a redus ratele de deces la 91,9 ± 1,40 la sută la 0,1 uM; cZ le-a redus la 92,3 ± 1,15 la sută la 0,1 uM și 91,7 la sută ± 1,56 la sută la 1 uM; K le-a redus la 92,3 ± 1,15 la sută la 1 uM; 1,06 procente la 1 uM). Martorii pozitivi NEC-1 și DFO au avut efecte protectoare mai puternice, dar au fost eficiente la concentrații mult mai mari (reducerea ratelor la 76,9 ± 2,94 la sută și 81,6 ± 3,74 la sută la 50 și, respectiv, 10 uM) (Figura 5B). Testul LDH a validat indicațiile obținute cu colorarea PI și efectele observate ale controalelor pozitive au fost în concordanță cu datele publicate [69,70]. Descoperirile privind efectele K în modelul de moarte celulară indusă de Glu în celulele HT22 [18] și observațiile noastre despre efectele CK reprezentative, cum ar fi tZ, cZ și K, arată că CK-urile sunt candidați promițători pentru tratarea bolilor neurodegenerative asociate cu stresul oxidativ. 71]. În cele din urmă, tZ și cZ au fost preferate deoarece au fost eficiente la concentrații mai mici și au fost selectate, împreună cu K, pentru studii ulterioare ale efectelor lor asupra nivelurilor de stres oxidativ și de activare a caspazei-3,7.

cistancherecenziiasupra efectelorneuroprotecție

2.8. Efectele citokininelor asupra stresului oxidativ indus de Glu în celulele SH-SY5Y

Spre deosebire de modelul anterior, Glu poate induce stres oxidativ în celulele SH-SY5Y prin diferite căi. Unul se bazează pe blocarea antiporterului cistină/glutamat (Xc-), care duce la epuizarea glutationului (GSH) și efecte negative asupra activității superoxid dismutază (SOD) [62]. Moartea celulară mediată de Glu implică, de asemenea, în mod presupus formarea ROS condusă de Rac-NADPH-oxidază (în special radicalul superoxid) în celulele SH-SY5Y [72]. Aceste constatări indică faptul că cauza principală a morții celulare în modelul indus de Glu este OS. În cadrul modelului,neuronCelulele asemănătoare au fost co-tratate cu Glu și compuși testați, colorate cu DHE și observate prin microscopie cu fluorescență. După cum se poate observa în Figura 6A, a fost observată o creștere dramatică a fluorescenței DHE roșii în celulele tratate cu Glu, care a fost ameliorată de substanțele de control pozitiv și de CK-urile testate. Pe baza observației la microscopie, cuantificarea nivelurilor de superoxid a fost efectuată în celulele induse de Glu într-o manieră similară, prin testul DHE, cu cele din celulele induse de SAL. Rezultatele au fost normalizate în ceea ce privește nivelurile induse numai de Glu (setate la 100 la sută), care a provocat o creștere dramatică, de aproape 3-ori, a nivelurilor de superoxid în doar 4 ore înneuron-cum ar fi celulele SH-SY5Y în raport cu nivelurile din celulele de control sănătoase (CTR: 33,79 ± 1,45 la sută). După cum se arată în Figura 6B, CK, cum ar fi tZ, cZ și K au redus semnificativ nivelul de superoxid în celulele intoxicate cu Glu: 0.1 uM tZ, 0.1 uM cZ, 1 uM și 10 uM K l-a redus la 81,0 ± 4,03, 80,6 ± 3,89, 81,8 ± 3,39 și 83,8 ± 2,32 procente din nivelurile din celulele tratate numai cu Glu. Aceste niveluri sunt comparabile cu cele obținute cu inhibitorul de necroptoză NEC-1 (80,5 ± 3,19 la sută la 5 uM și 80,4 ± 2,70 la sută la 50 uM) și cu chelatorul de fier DFO (80,2 ± 3,80 la sută la 10 uM). Rezultatele obținute cu modelul de moarte celulară indusă de Glu, în special efectele controalelor pozitive, sunt în concordanță cu rapoartele anterioare [70,73]. Dovezile anterioare că CK-urile au efecte de reducere a OS în modelele induse de Glu sau similare sunt limitate la o demonstrație că K este un agent puternic de reducere a OS (la aproximativ 23 uM) în modelul de moarte celulară indusă de Glu bazat pe celule HT22 [18] ]. Am descoperit că K a avut un efect de reducere a OS la concentrații mai mici (1-10 uM) în celulele noastre SH-SY5Y. În plus, au fost observate efecte benefice pe termen lung ale tZ asupra fibroblastelor umane, inclusiv activitatea de descompunere a peroxidului de hidrogen [15], sugerând că tZ și cZ pot avea efecte indirecte de reducere a OS în modelele de moarte celulară indusă de Glu. În plus, alte rapoarte au subliniat asocierile dintre efectul de reducere a OS mediat de CK și activitatea de protecție [22,74–76]. Luate împreună, tZ, cZ și K au prezentat efecte surprinzător de puternice de reducere a OS, comparabile cu cele ale martorilor pozitivi, în ciuda punctelor forte diferite în ansamblu.neuroprotectorefect.

Figura 5. (A) Rata mortalității aneuron-ca celulele SH-SY5Y în modelul de moarte celulară indus de glutamat (Glu); (B) Toxicitatea indusă de Glu (eliberarea de LDH) aneuron-ca celulele SH-SY5Y. Triplicat în cel puțin trei zile independente.* P în comparație cu vehiculul cu 160 uM Glu, # P în comparație cu vehiculul fără 160 uM Glu.

Figura 6. (A) Stresul oxidativ (OS) indus de Glu și activitatea de reducere a OS a compușilor indicați la omneuron- asemănător celulelor SH-SY5Y vizualizate prin microscopie cu fluorescență după marcarea cu dihidroetidiu (DHE). Baruri=50 um. Imaginile aratăneuron-cum ar fi celulele SH-SY5Y tratate cu DMSO (control), 160 mM glutamat (Glu) singur și împreună cu: 10 uM deferoxamină (plus DFO), 50 uM necrostatină{{6} } (plus NEC-1), 0,1 uM tZ (plus tZ) și 0,1 uM cZ (plus cZ) timp de 4 ore, apoi colorat cu DHE. (B) Formarea radicalilor superoxid indus de Glu înneuron-ca celulele SH-SY5Y după 4 ore. Graficul afișează cuantificarea celulelor colorate cu DHE folosind cititorul de microplăci Infinite M200 Pro (Tecan, Austria). Triplicat în cinci zile independente.

* P în comparație cu vehiculul cu 160 uM Glu, # P în comparație cu vehiculul fără 160 uM Glu.

2.9. Efectele citokininelor asupra activității caspazei-3/7 în modelul de moarte celulară indusă de Glu

Glu are efecte toxice similare asupra celulelor SH-SY5Y cu efectele raportate anterior asupra celulelor HT22 asociate cu blocarea Xc-antiporter. Astfel, mecanismele de moarte celulară non-apoptotică (feroptoză, necroptoză etc.) sunt implicate în ambele cazuri [62], deși expresia caspazei-3 și, într-o oarecare măsură, subunitatea NMDA a NR1 poate fi mai puternică în SH. -celule SY5Y [61]. Prin urmare, etapele finale ale morții celulare în cele două linii celulare pot diferi. Un rol contributiv al activității caspazei-3 a fost observat în multe studii în modelul de moarte celulară indusă de Glu a celulelor SH-SY5Y [62,77–79]. În acest test,neuronCelulele SH-SY5Y asemănătoare au fost tratate aici cu 160 mM Glu, ceea ce duce la creșterea activității caspazei-3/7. În eforturile de a elucida rolul apoptozei în moartea indusă de Glu a celulelor SH-SY5Y, a fost aplicat un inhibitor specific al caspazei-3/7, Ac-DEVD-CHO, care s-a dovedit a avea un efect inhibitor puternic: la 50 de ani. nM a redus activitatea caspazei-3,7 la 23,70 ± 1,01 la sută din nivelul celulelor tratate

numai cu Glu și la 0,5 uM a blocat aproape complet activitatea (reducând-o la un nivel normalizat de doar 7,22 ± 1,05 la sută; comparabil cu nivelul observat în celulele sănătoase:

7,8 ± 0,39 la sută), așa cum se arată în Figura 7. Aplicarea martorilor pozitivi a dus la o scădere treptată, dependentă de doză, a activității caspazei-3,7. Interesant, NEC-1 a avut un efect ușor cu efect maxim la 50 uM și DFO a avut o activitate inhibitorie mai robustă la 1{0 uM (reducerea activității la 80,5 ± 1,85 și 75,8 ± 3). .00 procente, respectiv). Pe de altă parte, doar efecte ușoare, dar semnificative asupra casp-3,7 au fost obținute de tZ la 1 uM (89,5 ± 2,50 la sută), cZ la 0,1 uM (87,4 ± 1,62 la sută) și K la 1 uM ( 91,0 ± 2,06 procente). Luate împreună, rezultatele arată că ambele controale pozitive au avut o activitate de scădere a activității caspazei-3/7 mai puternică decât CK-urile testate, dar CK-urile au avut efecte la concentrații mult mai mici. În general, rezultatele indică faptul că modularea activității caspazei-3/7 joacă un rol cheie înneuroprotectoractivitatea agenților precum DFO [58] în modelul de moarte celulară indusă de Glu [79,80]. Cu toate acestea, așa cum se arată în această secțiune, NEC-1 a avut și elneuroprotectoractivitate, sugerând că alte tipuri de moarte celulară ar putea fi implicate în moartea indusă de Glu a celulelor SH-SY5Y asemănătoare neuronilor [63,67,81]. Indicații că mecanismele independente de caspază sunt implicate în moartea celulară indusă de Glu au fost, de asemenea, obținute în analizele efectelor NEC-1 [70], DFO [69] și K [18] asupra celulelor HT22.

Figura 7. Activitatea caspazei-3/7 în modelul Glu de deteriorare oxidativă aneuron-ca celulele SH-SY5Y. Triplicat în cel puțin patru zile independente. * P în comparație cu vehiculul cu 160 uM Glu, # P în comparație cu vehiculul fără 160 uM Glu.

3. Concluzii

În rezumat, studiul nostru a arătat că CK și metaboliții lor auneuroprotectoractivități în modelul indus de SAL deboala Parkinsonși daune oxidative induse de Glu în SH-SY5Y diferențiat umanneuronalecelule. S-a descoperit că K3G, cZR și iPR au semnificații biologiceneuroprotectorActivități. Mai mult, CK active au fost eficiente la concentrații mai mici (sub-micromolare și micromolare) decât substanța de control pozitiv NAC. K3G, cZR și iPR au avut, de asemenea, efecte pozitive asupra viabilității, citotoxicității, stresului oxidativ și activității caspazei-3,7 (cu excepția iPR). Demonstrațiile ortogonale indică cu tărie că activitatea stresului antioxidant joacă un rol cheie în efectele protectoare ale CK în modelul de moarte celulară indusă de SAL. Doar trei metaboliți din panoul testat de CK (tZ, cZ și K) sunt protejațineuron-cum ar fi celulele SH-SY5Y în modelul de deteriorare oxidativă indusă de Glu într-un mod similar cu chelatorul de fier NEC1 și inhibitorul de necroptoză DFO. Pentru a confirma activitatea lor promițătoare, le-am testat efectele în testul de eliberare ortogonală a lactat dehidrogenazei (LDH). CK au avut activitate protectoare moderată, dar semnificativă. Acest lucru a fost mai slab decât activitățile corespunzătoare ale substanțelor de control, dar în ciuda diferențelor de modulare aneuronalesănătate, toate cele trei CK testate au stimulat reduceri puternice ale formării radicalilor superoxid, în mod similar cu substanțele de control pozitiv. De asemenea, CK-urile au avut efecte comparabile asupra stresului oxidativ indus de Glu în celulele SH-SY5Y cu cele ale NEC1 și DFO, dar acești compuși au avut efecte inhibitorii mai puternice asupra activității caspazei-3/7 decât CK-urile. Deoarece moartea celulară indusă de Glu nu se bazează pe o cale dependentă de caspază, așa cum se arată în studiile asupra efectelor DFO și NEC-1 asupra celulelor HT-22 [70], CK-urile pot modula aparent ambele caspaze- moartea celulară dependentă și independentă prin reducerea stresului oxidativ [18,82]. În studiile în curs, mecanismul detaliat de acțiune al CK și/sau efectele lor mitocondriale asupraneuronalesau celulele astrocitelor vor fi investigate.

cistancheexperienţăpentruPDșimemorie

4. Materiale și Metode

4.1. Produse chimice și reactivi

Citochininăstandardele au fost obținute de la OlChemIm (Olomouc, Cehia). Calcein AM (soluție de 1 mg/mL) și kit de eliberare LDH și un kit de excrescență Neurite au fost achiziționate de la ThermoFisher. Iodură de propidiu, dihidroetidiu, componente ale tamponului de testare caspaza- 3/7, mediu DMEM/F{{12 1:1, ser fetal bovin, tripsină, ATRA, bromhidrat de salsolinol, sare monosodic glutamat, deferoxamină, N-acetilcisteină , Ac-DEVD-CHO și DMSO pentru culturi celulare au fost achiziționate de la Sigma Aldrich (Merck). Substratul Ac-DEVD-AMC a fost furnizat de Enzo Life Science.

4.2. Testele de activitate ORAC Radical Scavenging

Capacitatea compuşilor de a capta radicalii liberi in vitro a fost determinată prin testul Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC). Pe scurt, fluoresceină (100 uL, 500 mM) și 25 uL din soluția de compus testat au fost adăugate la o microplacă de 96-godeuri pre-incubată la 37oC. Apoi, 25 uL de 250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3. Cultură celulară SH-SY5Y

Linia celulară de neuroblastom uman SH-SY5Y achiziționată de la ATCC (Colecția Americană de Cultură de Tip, Manassas, VA, SUA) a fost crescută în mediu de vultur modificat de la Dulbecco și amestec de nutrienți F12 de șuncă (DMEM: F-12, 1:1). ), suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS) și 1% penicilină și streptomicina la 37 oC într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2. Celulele au fost trecute de până la 20 de ori și mediile au fost schimbate de două sau de trei ori pe săptămână. Densitatea celulelor a fost setată în mod corespunzător pentru analiza planificată (5000, 7000, 10.000 sau 20.000 celule per godeu) în 96-plăci cu mai multe godeuri în 100 uL volume totale de mediu pentru fiecare experiment. A doua zi după însămânțare, s-a adăugat celulelor ATRA în mediu FBS DMEM/F12 1% până la o concentrație finală de 10 uM și incubarea a fost continuată pentru încă 48 de ore pentru a induce diferențierea, a permite formarea de neurite mai lungi și a reduce proliferare.

4.4. Microscopie

Micrografii aleneuronCelulele asemănătoare SH-SY5Y au fost obținute folosind un microscop cu fluorescență LED DM IL (Leica Microsystems, Mannheim, Germania) cu un filtru de excitație adecvat pentru test sau o configurație de câmp luminos cu o cameră digitală de înaltă performanță DP73 (Olympus, Tokyo, Japonia). ). Deoarece raportul semnal-zgomot pentru colorare a fost moderat, contrastul a fost ușor ajustat în software-ul ImageJ (Fiji) fără a afecta observația rezultată. Imaginile originale sunt incluse în Materialele suplimentare.

4.5. Colorarea membranei celulare (kit de creștere a neuritei, Invitrogen™)

NeuronCelulele asemănătoare SH-SY5Y (5000 celule per godeu) obținute prin procedura de diferențiere de 48 de ore au fost colorate cu un kit de excrescență Neurite (Invitrogen™) conform recomandărilor producătorului, cu modificări minore. Celulele au fost spălate cu PBS, etichetate cu o soluție din colorantul de colorare a membranei furnizată cu trusa (urmând protocolul pentru plăci cu 96 de godeuri) în PBS timp de 20 de minute la 37 oC, spălate din nou cu PBS și vizualizate la microscop cu fluorescență ( cu lungimi de undă de excitare și, respectiv, de emisie de 533 și respectiv 585 nm).

4.6. Tratamentul celular

După procedura de diferențiere, mediul de diferențiere a fost schimbat la 1% mediu DMEM/F12 suplimentat cu compuși de testat la concentrații de 0,1, 1 și 10 uM (cu 7000 celule per godeu pentru testele de citotoxicitate) sau împreună cu toxina SAL la 500 uM (cu 7000–10.000 celule per godeu) sau 160 mM Glu (cu 20.000 de celule per godeu) pentru o durată adecvată pentru tipul de analiză (viabilitate, moarte celulară etc.). Celulele martor au fost tratate cu un mediu care conține 0,1% DMSO.

4.7. Viabilitatea celulară și moartea celulară

ViabilitateaneuronCelulele SH-SY5Y care au crescut în microplăci 96-godeuri (cu aproximativ 7000 celule per godeu) după 24 de ore de tratamente au fost evaluate prin testul Calcein AM cu modificări minore [31]. Soluția de Calcein AM în PBS utilizată a avut o concentrație de 0,75 uM și timpul de incubare a fost setat la 50 min. Numărul de celule vii din fiecare godeu a fost determinat utilizând un cititor de microplăci Infinite M200 Pro (Tecan, Austria), cu lungimi de undă de excitație și, respectiv, de 517 nm.

Moartea celulară aneuronCelulele asemănătoare (modelul SAL: 10,000 celule per godeu; modelul Glu: 20,000 celule per godeu) a fost determinată prin testul PI, așa cum este raportat de Stone și colab. 2003 cu mici modificări [83]. Pe scurt, mediul modelului indus de SAL a fost aspirat și schimbat într-o soluție de 1 ug/mL de PI în PBS, dar celulele supuse inducției Glu au o aderență mai slabă, așa că a fost adăugată o soluție de 1 mg/mL de PI în PBS. dați o concentrație finală de 1 ug/mL. În ambele cazuri, celulele au fost incubate încă 15-25 de minute la temperatura camerei, apoi fluorescența PI a fost măsurată cu un cititor Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Austria) cu 535 și, respectiv, 617 lungimi de undă de excitare și emisie. Fluorescența PI rezultată, obținută numai cu toxine, a fost stabilită ca moartea celulară de 100%.

4.8. Măsurarea stresului oxidativ prin testul Dihidroetidiu (DHE).

Celulele au fost diferențiate și tratate așa cum este descris în secțiunea anterioară pentru inducția SAL (10,000 celule pe godeu, 24 de ore sau inducție Glu (20,000 celule per godeu, 4 ore). la tratamente, celulele au fost centrifugate la 500 xg timp de 330 s, apoi mediile de cultură au fost înlocuite (după aspirație) cu soluție de DHE 10 uM în PBS. 96-plăci cu mai multe godeuri cu celule au fost incubate la întuneric timp de 30 de minute în cameră temperatura, apoi fluorescența DHE a fost măsurată cu un cititor de microplăci Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Austria) cu lungimi de undă de excitare și de emisie de 500 și respectiv 580 nm. Fluorescența DHE rezultată obținută numai cu SAL sau Glu a fost setată la 100% radical superoxid. Microfotografii ilustrative cu fluorescență ale celulelor colorate cu DHE au fost obținute după măsurarea DHE cu cititorul de microplăci.

Planta Cistanche are un efect neuroprotector foarte bun

4.9. Măsurarea activității caspazei-3/7

Testele caspazei-3/7 într-un singur pas au fost efectuate conform unei proceduri publicate anterior [84]. Pentru culturile supuse inducției SAL și inducției Glu, amestecurile de reacție (caspază-3, 7 tampon și componente cu celule în 96-plăci cu mai multe godeuri) au fost incubate timp de 2 ore și 3 ore la 37 oC, respectiv. Activitatea caspazei-3/7 a fost apoi măsurată cu un cititor de microplăci Infinite M200 Pro (Tecan, Austria) cu lungimi de undă de excitare și, respectiv, de emisie de 346 și, respectiv, 438 nm.

4.10. Analize statistice

Experimentele au fost efectuate în trei exemplare și repetate în trei până la cinci (n {{0}}-5) zile independente. Toate datele sunt exprimate ca medie ± SEM. Valorile pentru toate variabilele măsurate sunt exprimate ca medii ± SEM, care au fost calculate folosind Prism 8.4.3 (GraphPad Software, La Jolla, CA, SUA), care a fost, de asemenea, folosit pentru a genera cifrele. Analiza statistică a fost realizată de pachetul software PAST (ver. 1.97) [85]. Pentru experimentul de diferențiere a fost utilizat testul t Student. Restul experimentelor au fost evaluate prin testul neparametric Kruskal–Wallis cu testul post-hoc Mann–Whitney cu corecție secvențială Bonferroni. O valoare de p < 0,05="" a="" fost="" considerată="">

Materiale suplimentare: Imaginile originale sunt disponibile online.

Contribuții ale autorilor: Contribuțiile autorilor au fost după cum urmează: Investigație, metodologie, validare, analiză de date, GG, CWD și JG; scriere — pregătirea proiectului original GG, CWD și MS; curatarea datelor, achiziția de finanțare, supravegherea, scrierea - revizuire și editare, CWD, MS și PK Toți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului.

Finanțare: Această lucrare a fost susținută financiar parțial de granturi de la Agenția Internă de Granturi a Universității Palacky din Olomouc, Republica Cehă (IGA{{0}}PrF{_2020_021), Agenția de Granturi Cehe ({{ 2}}S) și Fondul European de Dezvoltare Regională — Proiectul ENOCH (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/ 0000868) și o bursă pentru studenți de la Fondul de dotare al Universității Palacky.

Declarația Comitetului de revizuire instituțională: Nu se aplică.

Declarație de consimțământ informat: Nu se aplică.

Declarație de disponibilitate a datelor: Datele sunt conținute în articol sau material suplimentar.

Mulțumiri: Autorii le mulțumesc Ditei Jordovd, Janei Hrubešovd și Lucie Koplikovd pentru asistența tehnică excelentă. În plus, autorii mulțumesc Sees-editing Ltd., Marea Britanie pentru editarea în limba engleză a manuscrisului.

Conflicte de interese: Autorii declară că nu există conflicte de interese.

Disponibilitatea probelor: Probele de compuși nu sunt disponibile de la autori.