Partea 3: Tipul receptorilor canabinoizi 2 promovează fibroza renală prin orchestrarea semnalizării B-catenin

Persoană de contact: emily.li@wecistanche.com

Cistanche este bun pentru rinichi

Cu toate acestea, rareori s-a raportat că există o relație între CB2 și β-catenin.

CB2 este un membru al familiei GPCR. Curtea a constatat anterior că CB2 este exprimat în celule tubulare, fibroblaste și macrofage." CB2 este, de asemenea, exprimat în podocite și celule mesangiale.3Interpretarea CB2 în CKD a fost contro-versală în trecut. În ciuda upregulation de CB2 ARNm și ligandul său endogen principal 2-AG în modelele CKD, sa raportat anterior că un agonist CB2 ar putea ameliora fibroza renală."În schimb, studiile noastre anterioare au identificat un rol vătămător de CB2 în fibroza renală prin experimente genetice knockout și teste cu mai selectiv CB2 inverse agonist XL-001, un agonist nou CB2 inverse care prezintă cea mai puternică afinitate de legare la receptorul CB2, cu cea mai bună selectivitate față de receptorul CB1 (2594-fold) și un Ki de 0,5 nM. De notat,β-catenin și țintele sale sunt suprimate prin ablația genetică sau inhibarea farmacologică a CB2. Având în vedere că CB2 este un membru al familiei GPCR, CB2 ar putea modula β-catenin. Cu toate acestea, această ipoteză trebuie validată. În acest studiu, am arătat că CB2 mediază activarea β-catenină printr-o undă de semnal GPCR.

Studiul nostru confirmă, de asemenea, rolul emergent al sistemului endocanabinoid în fibroza renală. Dintre cele 2 endo-canabinoide principale, anandamida (N-arachidonoylethanolamine)are o afinitate mai mare pentru CBl, în timp ce 2-AG are o afinitate similară pentru CB1 și CB2 (afinitatea sa pentru CB1 este puțin mai mare). Prin urmare, 2-AG este agonistul endocanabinoid primar pentru receptorul CB2. În special,rinichicortexul prezintă niveluri bazale la fel de ridicate de anandamidă și2-AG; cu toate acestea, nivelurile de 2-AG sunt crescute mai mult în obstructivăFibrozadecelrinichi, însoțită de scăderea nivelurilor de anandamidă, care are ca rezultat activarea atât a CB2, cât și a CB1."De remarcat, rolul dăunător al CB2 în patogeneza patogenezeiRenalăFibrozaa fost demonstrată de abordările genetice în studiul nostru recent'', și este confirmată în continuare în prezentul studiu.

Deși un raport anterior a arătat că CB2 este exprimat atât de celule inflamatorii, cât și de podocite la un nivel bazal ridicat,8 CB2 și ligandul său endogen principal 2-AG sunt de fapt upregulated după UUO și IRI.7Notabil, în fibroza renală a șoarecilor și o varietate de nefropatii umane, CB2 este exprimat predominant în epiteliul tubular renal, precum și în fibroblastele interstițiale și leucocite (Figura 2; Figura suplimentară S1), sugerând că upregulation de CB2 este o caracteristică patologică comună în fibrotic copil-neys. În studiile noastre pe animale, am adoptat hibridizarea in situ a fluorescenței CB2 pentru a identifica modelul său de expresie din cauza costului scăzut. Colorarea a arătat că CB2 este exprimat în principal în epiteliu tubular. Motivul din spatele acestei discrepanțe poate consta în sensibilitatea tehnicii de hibridizare in situ a fluorescenței în detectarea mRNA-urilor foarte abundente și a timpului de expunere pentru imagistică. Am observat CB2 nu numai în membrana celulară, ci și în zona citoplasmatică tubulară, sugerând internalizarea receptorilor în compartimentele intracelulare, cum ar fi endozomii și lizozomii.6Specificitatea testului de hibridizare in situ a fluorescenței a fost confirmată cu un anticorp CB2 primar și ambele au fost verificate la șoarecii de eliminare CB2 (figura suplimentară S1). Interesant, am observat formarea heterodimer de CB2 cu CB1 în UUO-afectateRinichiși transformarea celulelor tubulare induse de factorul de creștere β (figura suplimentară S4), sugerând că efectele lor stimulatorii pot fi sinergice. Cu toate acestea, expresia CB1 nu a fost afectată de AM1241 sau XL-001, ceea ce adaugă o complexitate suplimentară mecanismelor. După cum s-a menționat anterior în ceea ce privește efectele reciproc inhibitoare ale CB2 și CB1, "ar trebui efectuate mai multe studii pentru a verifica efectele interconectate ale acestora, o investigație care să depășească domeniul de aplicare al studiului actual. Cu toate acestea, constatările noastre anterioare și prezente arată în mod constant că blocarea CB2 este o strategie de intervenție terapeutică po-tentială pentru a preveni fibroza renală. Împreună cu informarea pacienților cu CKD, constatările noastre oferă avertismente de sănătate grupului cu creștere rapidă.

Figura 10| Receptorul canabinoizilor de tip 2(CB2) este o țintă în aval de β-catenin (β-pisică). (a) Analiza bioinformatică a relevat prezența site-urilor de legare a factorului de celule T putative (TCF) (TBSs) în regiunea promotor a genelor CB2 umane și de șoarece. Secvențele și pozițiile TBS-urilor putative din genele CB2 sunt evidențiate (roșu), în timp ce secvența consensului TBS este dată în partea de jos a acestui panou. (b) Rezultatele testelor reprezentative de imunoprecipitare a cromatinei (ChlP) care arată legarea TCF sau a factorului de legare a potențiatorului limfoid (LEF)-1 de regiunea promotorului genei CB2. Omenescrinichicelulele tubulare proximale (HKC)-8 au fost transfectate cu plasmidă de expresie β-catenină (pFlag-β-cat)sau pcDNA3 timp de 24 de ore. Ysates celulare au fost precipitate cu un anticorp împotriva TCF, LEF-1, histone H3, sau lgG nonimmune, și testul cip a fost efectuat pentru promotorii genei CB2. Lizatul diluat total a fost utilizat ca ADN de intrare genomică totală. (c) Prezentarea grafică a nivelului ARNm cb2. Celulele HKC-8 au fost transfectate cu plasmidă pFlag-β-cat sau pcDNA3. ARN-ul total a fost analizat prin reacția cantitativă în lanț a polimerazei.*P<0.05 versus="" the="" pcdna3="" group="" (n="3)." (d,e)representative="" western="" blot="" and="" quantitative="" data="" show="" overexpression="" of="" β-catenin-induced="" upregulation="" of=""><0.05 versus="" the="" pcdna3="" group="" (n="3)." (f="" representative="" graphs="" show="" β-catenin="" induced="" the="" formation="" of="" a="" cb2/β-arrestin="" 1(β-arr1)/="" proto-oncogene="" src="" complex.="" cell="" lysates="" were="" immunoprecipitated="" (ip)="" with="" an="" antibody="" against="" cb2,="" followed="" by="" immunoblotting="" (b)="" with="" anti-β-arrestin="" 1(β-arr1),="" or="" anti-src.(g-i)representative="" westem="" blot="" and="" quantitative="" data="" show="" the="" expression="" of="" cb2,="" β-arrestin="" 1(β-arr1),="" and="" src.="" hkc-8="" cells="" were="" transfected="" with="" pflag-β-cat="" (or="" pcdna3)="" plasmid="" in="" the="" presence="" or="" absence="" of="" cb2="" small="" interfering="" rna=""><0.001 versus="" the="" pcdna3=""><0.001 versus="" the="" flag-β-catenin="" group="" alone="" (n="">a consumatorilor endocanabinoidi, atât în scopuri recreative, cât și medicinale. Utilizarea cronică grea ar putea duce la activarea continuă a receptorilor CB1 și CB2, care pot avea efecte negative asuprarinichiSănătate.

Deși un raport anterior a arătat că β-arestareaîn 1 joacă un rol în fibroza renală și activarea β-catenin", clarificăm în continuare mecanismele funcționale ale β-arestareaîn calea CB2/β-catenin mediată 1 în detaliu. Am constatat β-arestareîn 1 este mai abundentă decât β-arestareîn 2 la șoareci IRI (date nu sunt prezentate). Este bine cunoscut faptul că β-arrestin 1 este responsabil pentru activarea GPCR și transducția semnalului în aval prin Src, AKT, protein kinaza extracelulară reglată de semnal (ERK1/2) și alte kinaze.2că activarea Src ar putea media mai multe căi pro-fibroză, cum ar fi receptorul factorului de creștere epidermică și traductorul de semnal și activatorul de transcriere (STAT)3", nu am putut exclude posibilitatea ca aceste căi să fie, de asemenea, căile din aval ale CB2. Cu toate acestea, observațiile noastre sugerează că semnalizarea β-catenin este mediată de complexul β-arrest indus de CB2 în complexul 1/Src. În plus, β-arrestin 1 este un regulator de punct de control principal și servește ca o proteină de schelă pentru a iniția activarea β-catenin prin translocarea acestuia în nucleu. O altă constatare inedită este că CB2 este o țintă de β-catenin. Mai multe obiective de β-catenin au fost anterior CB2 a fost identificat în acest studiu. Prin urmare, este remarcabil faptul că calea CB2/β-catenin pare să creeze o buclă de activare reciprocă care pro-motes cooperativ patogeneza fibrozei renale.

În rezumat, rezultatele noastre sugerează că cb2 exprimat aberant este implicat critic în fibroza renală prin activarea β-arrestin 1 induse de β-catenin. β-catenin declanșează expresia CB2, care facilitează activarea receptorilor și transmiterea undei semnalului. Aceste rezultate(i) ilustrează o nouă cale CB2/β-catenin care promovează fibroza renală și (ii) implică faptul că inhibarea țintită a CB2 sau β-arrestin 1 poate proteja împotriva fibrozei prin inhibarea buclei de activare reciprocă.

METODE CONCISE

Pentru metode detaliate, a se vedea metodele suplimentare.

Modele animale

Masculul C57BL/6 șoareci au fost achiziționați de la Centrul experimental pentru animale al Southern Medical University (Guangzhou, China). Pentru modelul IRI, pediculii bilaterali au fost tăiați cu cleme de microaneurysm timp de 32 de minute la 37,5 °C în timpul perioadei de ischemie și recuperare. Modelul UUO a fost stabilit prin triplarea ureterului stâng cu 4-0 mătase după o incizie abdominală a liniei mediane. Pentru modelul UIRI, pediculele stângi au fost tăiate timp de 35 de minute folosind cleme de micro-anevrism, iar contralateralulrinichia fost eliminat cu 1 zi înainte de sacrificiu. Pentru modelul de nefropatie indusă de acid folic, șoarecii masculi C57BL/6 au fost tratați cu acid folic printr-o singură injecție intraperitoneală de 25 mg/kg greutate corporală. Expresia in vivo a Wnt1 sau CB2 sau doborârea β-stopin 1 la șoareci a fost efectuată printr-o abordare de livrare a genelor bazată pe hidrodinamică.",5 Desenele experimentale detaliate sunt prezentate în figurile 5a, 7a și 9a. Experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul de Etică a Animalelor de la Southern Medical University, Guangzhou, China. Perechile de reproducție ale șoarecilor nuli CB2(CB2/)cu vârsta cuprinsă între 6-8 săptămâni, în fundal C57BL/6N, au fost achiziționate de la Cyagen Biosciences (stocul nr. KOCMP-21582-Cnr2; Cyagen Biosciences, Guangzhou, China). Deficitul de receptori cb2 a fost confirmat prin transcriere inversă-PCR.

Probe de biopsie renală umană și cultură celulară

Omenescrinichisecții (3 μm) au fost obținute din biopsii renale efectuate la Spitalul Nanfang și la Spitalul Popular Districtual Huadu, Southern Medical University, Guangzhou, China. Biopsiile normale de control au fost derivate din nontumoralerinichiŢesuturia pacienților care au avut carcinom renal. Studiile care au implicat secții de rinichi umani au fost efectuate cu acordul informat al pacientului și au fost aprobate de Comitetul de Etică Instituțională de la Spitalul Nanfang și spitalul raional de oameni Huadu. Celulele epiteliale tubulare proximale umane (HKC-8) au fost furnizate de Dr. Lorena C. Racusen (Universitatea Johns Hopkins, Baltimore, MD). Fracțiunile nucleare și citoplasmatice au fost separate cu un kit comercial (BestBio, Shanghai, China).

Determinarea creatininei serice și a nivelurilor de azot ureic din sânge

Nivelul creatininei serice și al azotului ureic din sânge a fost determinat de un analizor automat de chimie (ANALIZOR DE CHIMIE AU480, Beckman Coulter, Atlanta, GA).

Hibridizarea in situ

Sondele CB2 au fost achiziționate de la Boster Technology, Wuhan, China.Rinichisecțiunile (8 μm) au fost fixate cu formaldehidă de 4% și evaluate prin colorarea cu fluorescență a CB2 folosind un kit comercial (MK2530, Boster Biological Technology, Wuhan, China).

Histologie și colorare imunohistochimică și imunofluorescență

Parafină-embeddedrinichisecțiunile au fost colorate folosind colorarea periodică a acidului-Schiff și a tricromului Masson pentru a identifica tubulii răniți și pentru a determina depunerea colagenului. Leziunile au fost cuantificate folosind o tehnică asistată de calculator. Colorarea imunohistochimică și imunofluorescență a fost efectuată în secțiuni de parafină și, respectiv, congelate. Anticorpii sunt descriși în metodele suplimentare.