Partea 3: Echinacozidul izolat din Cistanche Tubulosa stimulează în mod presupus secreția de hormon de creștere prin activarea receptorului de grelină
Mar 06, 2022
Echinacozidul izolat din Cistanche tubulosa stimulează în mod presupus secreția de hormon de creștere prin activarea receptorului de grelină
Chieh-Ju Wu 1, Mei-Yin Chien 2, Nan-Hei Lin 1, Yi-Chiao Lin 1, Wen-Ying Chen 3, Chao-Hsiang Chen 2,4* și Jason TC Tzen 1,*
1 Institutul Absolvent de Biotehnologie, Universitatea Națională Chung-Hsing, Taichung 402, Taiwan; baby159357520@gmail.com (C.-JW); CMNHEI@mohw.gov.tw (N.-HL); s9755702@gmail.com (Y.-CL)
2 Ko Da Pharmaceutical Co. Ltd., Taoyuan 324, Taiwan; rd1@koda.com.tw
3 Departamentul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională Chung-Hsing, Taichung 402, Taiwan; wychen@dragon.nchu.edu.tw
4 Institutul Absolvent de Farmacognozie, Universitatea Medicală Taipei, Taipei 110, Taiwan
* Corespondenta: gm@koda.com.tw (C.-HC); TCTZEN@dragon.nchu.edu.tw (JTCT); Tel.: plus 886-4-22840328 (ext. 776) (JTCT); Fax: plus 886-4-22853527 (JTCT)
Editor academic: Pinarosa Avato
Primit: 22 ianuarie 2019; Acceptat: 14 februarie 2019; Publicat: 17 februarie 2019
A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Abstract:Cistanchespecia, ginsengul din deșert, a fost înregistrată ca posedă multe activități biologice în farmacopeea tradițională chineză și a fost folosită ca medicament anti-îmbătrânire. Trei glicozide feniletanoide -echinacozid, tubulozidă A și acteozidă — au fost detectate în extractul apos alCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight și constituentul major,echinacozid, a fost purificat în continuare.Echinacozidulcu o concentrație mai mare de 10_6 M a afișat o activitate semnificativă pentru a stimula secreția de hormon de creștere a celulelor pituitare de șobolan. Similar hormonului de eliberare a hormonului de creștere-6, un analog sintetic al grelinei, stimularea secreției de hormon de creștere de către echinacozidă a fost inhibată de substanța P [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11] , un agonist invers al receptorului de grelină. Modelarea moleculară a arătat că toate cele trei glicozide feniletanoide au interacționat în mod adecvat cu buzunarul de legare al receptorului de grelină, iar echinacozidul a afișat o interacțiune puțin mai bună cu receptorul decât tubulozida A și actozida. Rezultatele sugerează că glicozidele feniletanoide, în special echinacozida, sunt constituenți activi presupus responsabili pentru efectele anti-îmbătrânire ale C. tubulosa și pot fi considerate a se dezvolta ca analogi non-peptidici ai grelinei.
Cuvinte cheie: cistanchetubulosa;echinacozid; grelină; secreția de hormon de creștere;feniletanoidglicozide
echinacozidîncistancheare multe efecte
Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 2
4. Materiale și Metode
4.1. Produse chimice și materiale vegetale
Cistanchedeserticola YC Ma a fost obtinuta de pe o piata locala si autentificata de Dr. Nan-Hei Lin.Cistanchetubulosa (Schenk) R. Wight a fost achiziționat de la Sinopharm Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., (Hangzhou, China). Acetonitril de calitate HPLC, acid formic și metanol au fost achiziționate de la ECHO Chemical Co., Ltd, (Miaoli, Taiwan). Mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM), serul fetal bovin dializat (DFBS) și tripsina-EDTA au fost cumpărate de la Invitrogen (Carlsbad, CA, SUA). DNase I am fost cumpărat de la Worthington Biochemical (Lakewood, NJ, SUA). Hormonul de eliberare a hormonului de creștere-6 (GHRP-6) a fost obținut de la Gen Way Biotech, Inc. (San Diego, CA, SUA). Colagenaza de tip I și [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-substanța P au fost cumpărate de la Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, SUA). Trusa ELISA pentru hormonul de creștere a șobolanului a fost achiziționată de la Sunred Biological Technology Corporation (Shanghai, China).
4.2. Analize HPLC/UV și LC_MSn ale extracției cu apă a Cistanche spp.
Tulpină uscată (25 g) deCistanchedeserticola YC Ma orCistanchetubulosa (Schenk) R a fost extras de trei ori cu 500 ml apă distilată timp de 60 de minute la 50 de grade într-o baie de apă. Soluția a fost filtrată printr-un filtru sirian de 13 mm cu filtru cu membrană PP de 0,45 um (Pall Corporation, Glen Cove, NY, SUA) și supusă următoarelor analize. Au fost analizați constituenții chimici din extracte
folosind o coloană Syncronis C18 (4,6 × 250 mm diametru interior, 5 um, Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA) în sistemul HPLC cuplat cu un detector cu matrice de fotodiode model 600E (Waters Corporation,
Milford, MA, SUA). Faza mobilă a constat din (A) apă care conține {{0}},1% acid formic și (B) acetonitril. Gradientul de eluare a fost după cum urmează: 0–60 min, gradient liniar de la 14% B; 0–3 min, 14% până la 17% B; 3–4 min, 17 la sută B; 4–15 min, 17 la sută până la 20 la sută B; 15–20 min, 20 la sută B; 20–50 min, 20 la sută până la 14 la sută B; 50–60
min, 14 la sută B. Lungimea de undă de detectare a absorbanței ultraviolete (UV) a fost setată la 330 nm. Un spectrometru de masă tandem cu capcană liniară quadrupol (LTQ) (Thermo Electron, San Jose, CA, SUA) echipat cu interfață de ionizare electrospray (ESI) a fost conectat la un sistem Surveyor LC (Thermo Electron)
cu o buclă de probă de 5 uL. Gradientul de eluare a fost după cum urmează: 0–9{0 min, gradient liniar de la 14% B; 0–24 min, 14% până la 17% B; 24–25 min, 17 la sută B; 25–36 min, 17 la sută până la 20 la sută B; 36–37 min, 20 la sută B; 37–80 min,
20% to 14% B; 80–90 min, 14% B. The heated capillary temperature was set at 300℃ with a spray voltage of 4.5 kV. Negative ESI mode was firstly scanned ranging from m/z 400–1000. Data-dependent MSN was obtained using the high purity helium (>99,99 la sută) ca gaz de coliziune.
4.3. Izolarea echinacozidei
Extractul apos din tulpina uscată (25 g) de C. tubulosa a fost concentrat sub presiune redusă pentru a da sirop maro intens. Extracția brută a fost suspendată cu apă distilată și liofilizată cu un uscător prin congelare. Pulberea de 100 mg a fost dizolvată în apă distilată de 5 ml și supusă purificării utilizând coloana Sephadex LH-20 (100 ml; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suedia) eluată cu soluție apoasă de metanol 10% și monitorizată prin HPLC . Fracțiile care conțin echinacozid au fost detectate prin citirea absorbanței la 245 nm și recoltate folosind un autosampler.
4.4. animale
Experimentele au fost aprobate de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor din cadrul Universității Naționale Chung_Hsing cu numărul de aprobare al IACUC 106-079. Șobolani masculi Sprague_Dawley cântărind 250_300 g au fost achiziționați de la BioLASCO, Taiwan Co., Ltd. (Taipei, Taiwan). Două animale per cușcă au fost menținute într-un mediu controlat de 23 o2, 60 o 10 la sută umiditate și un ciclu lumină/întuneric de 12 ore. Șobolanii au fost hrăniți cu o dietă standard (calorii furnizate
cu 28,7% proteine, 13,4% grăsimi și 57,9% carbohidrați, 5001 Rodent LabDiet, St. Louis, MO, SUA) și apă distilată ad libitum.
4.5. Cultura de celule pituitare primare
Celulele pituitare au fost izolate conform unei metode de dispersie enzimatică modificată dezvoltată de Yamazaki și colab. [29]. Pe scurt, șobolanii masculi Sprague Dawley au fost anesteziați cu Zoletil 50 (40 mg/kg, IP; Virbac Laboratories, Carros, Franța), iar glandele pituitare anterioare au fost îndepărtate și dispersate pentru a cultiva celule pituitare în suspensie, așa cum s-a descris anterior [30].
4.6. Analiza secreției hormonului de creștere
Celulele hipofizare anterioare primare de 4 × 104 celule/godeu au fost cultivate la 37 de grade sub 5% CO2 timp de 2 zile înainte de analiza secreției hormonului de creștere conform protocolului descris anterior [30].
După îndepărtarea mediului de cultură, celulele au fost înfometate în mediu Dulbecco's Modificat Eagle (DMEM) fără ser timp de 90 de minute pentru a stabiliza secreţia hormonală bazală. Mediul de foame a fost înlocuit cu DMEM proaspăt care conține echinacozidă (de la 10_8 la 10_5 M) sau GHRP-6 (un agonist al receptorului de grelină uman, GHSR, 10_7 M) ca martor pozitiv, iar celulele au fost incubate timp de 15 și 30 de minute la 37 de grade sub 5% CO2. Pentru detectarea efectului antagonist, celulele au fost incubate cu un GHSR
agonist invers, [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-substanță P (0,5 uM), și apoi tratat cu DMEM care conține echinacozidă (10_5 M) sau GHRP-6 (10_7 M) timp de 30 de minute. Mediul a fost colectat pentru
determinarea secreției de hormon de creștere cu ajutorul unui kit ELISA de hormon de creștere la șobolan (Shanghai Sunred Biological Technology Corporation).
4.7. Analize statistice
Datele au fost prezentate ca valori medii o SD. Diferențele au fost analizate prin T-Test. Calculele statistice au fost efectuate de GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, SUA). Un nivel de p < 0.05="" a="" fost="" considerat="" a="" fi="" semnificativ="">
4.8. Modelare omologie și andocare
Modelarea omologiei și andocarea la un receptor uman de grelină, receptorul secretagog al hormonului de creștere (GHSR, număr de acces AAI13548), a fost stabilită în urma construcției noastre anterioare [21,24]. Pe scurt, structurile cristaline ale 1 și 2 receptori adrenergici (PDB 2YCY și 3PDS) cu liganzi legați, cianopindolol și FAUC50 au fost folosite ca șabloane pentru a construi structura GHSR [31,32]. Structura GHSR cu cea mai mică energie totală PDF a fost selectată pentru andocare ulterioară cu GHRP-6, echinacozidă, tubulozidă A și acteozidă. Toate procesele de modelare au fost efectuate folosind platforma Discovery Studio 2.1 (http://accelrys.com/).
Structura 3D a GHRP-6 a fost descărcată din baza de date compusă Pub-Chem de pe site-ul web NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Structurile 3D de echinacoside, tubuloside A și acteoside au fost construite folosind programul Chem3D (http://www.cambridgesoft.com/). Locul de legare a ligandului al GHSR a fost definit ca spațiul sferic cu o rază de 14 Å de la centrul buzunarului de legare în simularea de andocare. Andocarea GHRP-6, echinacozidei, tubulozidei A sau actozidei la locul de legare al GHSR a fost efectuată in silico prin utilizarea modulului LibDock în pachetul Discover Studio 2.1 și redusă la minimum prin algoritmul de minimizare inteligentă cu câmpul de forță CHARMm în Pachetul Discover Studio 2.1 [33]. Pentru a compara afinitățile de legare relative ale echinacozidei, tubulozidei A și actozidei în GHSR, zona centrală activă construită cu GHRP-6 în GHSR a fost utilizată pentru andocare, iar energia de legare a fost calculată de GEMDOCK (Institutul de Bioinformatică , Universitatea Națională Chiao Tung, Taiwan).
Contribuții ale autorului: experimente pe animale, C.-JW, Y.-CL și W.-YC; Identificare și purificare: MY.C., N.-HL și C.-HC; Modelare moleculară: C.-JW, Y.-CL și JTCT; Proiectare și redactare: C.-HC și JTCT
Finanțare: lucrarea a fost susținută parțial de un grant acordat lui Jason TC Tzen de la Universitatea Națională Chung-Hsing (NCHU-102D604).
Mulțumiri: Autorii îi mulțumesc lui Tian-Shun Weng pentru împărtășirea experienței sale profesionale în utilizarea speciilor Cistanche.
Conflicte de interese: Toți autorii declară că nu există conflicte de interese.
Referințe
1. Wang, T.; Zhang, X.; Xie, W. Cistanche deserticola YC Ma, „Desert ginseng”: O recenzie. A.m. J. Chin. Med. 2012,40, 1123–1141. [CrossRef] [PubMed]
2. Wang, T.; Chen, C.; Yang, M.; Deng, B.; Kirby, MG; Zhang, X. Extractul de etanol de Cistanche tubulosa mediază nivelurile hormonilor sexuali de șobolan prin inducerea enzimelor steroidogene testiculare. Farmacă. Biol. 2016, 54, 481–487. [CrossRef] [PubMed]
3. Lin, WY; Chun, Y.; Jack, C.; Kao, ST; Tsai, FJ; Liu, HP Căi moleculare legate de promovarea longevității și îmbunătățirea cognitivă a Cistanche tubulosa la Drosophila. Phytomedicine 2017, 26, 37–44. [CrossRef]
4. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Reversarea prin extracte apoase de Cistanche tubulosa din deficiențe comportamentale în modelul de șobolan asemănător bolii Alzheimer: Relevanța pentru depunerea de amiloid și funcția neurotransmițătorului central. Complement BMC. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]
5. Xuan, GD; Liu, CQ Cercetări privind efectul glicozidelor feniletanoide (PEG) ale Cistanche deserticola asupra anti-îmbătrânire la șoarecii în vârstă indusă de D-galactoză. Zhong Yao Cai 2008, 31, 1385–1388. [PubMed]
6. Jiang, Y.; Tu, PF Analiza constituenților chimici la speciile Cistanche. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]
7. Gao, C.; Wang, C.; Wu, G. Cistanche glicozide totale asupra influenței învățării și memoriei șobolanilor cu demență vasculară și cercetarea mecanismului. Bărbie. Iarbă. Med. 2005, 36, 1852–1855.
8. Li, F.; Yang, Y.; Zhu, P.; Chen, W.; Qi, D.; Shi, X.; Zhang, C.; Yang, Z.; Li, P. Echinacozidul promovează regenerarea osoasă prin creșterea raportului OPG/RANKL în celulele MC3T3-E1. Fitoterapia 2012, 83, 1443–1450. [CrossRef]
9. Shimoda, H.; Tanaka, J.; Takahara, Y.; Takemoto, K.; Shan, SJ; Su, MH Efectele hipocolesterolemice ale extractului de Cistanche tubulosa, un medicament tradițional chinezesc brut, la șoareci. A.m. J. Chin. Med. 2009, 37, 1125–1138. [CrossRef]
10. Tang, F.; Hao, Y.; Zhang, X.; Qin, J. Efectul echinacozidei asupra fibrozei renale prin inhibarea căii de semnalizare TGF- 1/Smads în modelul de șoareci DB/DB al nefropatiei diabetice. Drug Des. Devel. Acolo. 2017, 11,2813–2826. [CrossRef]
11. Xiong, WT; Gu, L.; Wang, C.; Soare, HX; Liu, X. Efectele anti-hiperglicemice și hipolipidemice ale Cistanche tubulosa la șoarecii DB/DB diabetici de tip 2. J. Etnofarmacol. 2013, 150, 935–945. [CrossRef] [PubMed]
12. Bao, XX; Ma, HH; Ding, H.; Li, WW; Zhu, M. Optimizarea preliminară a unei formule de medicină chineză pe bază de plante bazată pe efectele neuroprotective într-un model de șobolan al bolii Parkinson indusă de rotenonă. J. Integr. Med. 2018, 16, 290–296. [CrossRef] [PubMed]
13. Kojima, M.; Hosoda, H.; Data, Y.; Nakazato, M.; Matsuo, H.; Kanagawa, K. Ghrelin este o peptidă acilată care eliberează hormon de creștere din stomac. Natura 1999, 402, 656–660. [CrossRef] [PubMed]
14. Zigman, JM; Jones, JE; Lee, CE; Saper, CB; Elmquist, JK Expresia ARNm a receptorului de grelină în creierul de șobolan și șoarece. J. Comp. Neurol. 2006, 494, 528–548. [CrossRef] [PubMed]
15. Castaneda, TR; Tong, J.; Datta, R.; Culler, M.; Tschop, MH Ghrelin în reglarea greutății corporale și a metabolismului. Față. Neuroendocrinol. 2010, 31, 44–60. [CrossRef] [PubMed]
16. Rudman, D.; Feller, AG; Nagraj, HS; germani, GA; Lalitha, PY; Goldberg, AF; Schlenker, RA; Cohn, L.; Rudman, IW; Mattson, DE Efectele hormonului uman de creștere la bărbații peste 60 de ani. N. Engl. J. Med. 1990, 323, 1–6. [CrossRef] [PubMed]
17. Liu, H.; Bravata, DM; Olkin, I.; Nayak, S.; Roberts, B.; Garber, AM; Hoffman, AR Revizuire sistematică: siguranța și eficacitatea hormonului de creștere la vârstnicii sănătoși. Ann. Intern. Med. 2007, 146, 104–115. [CrossRef] [PubMed]
18. Giordano, R.; Bonelli, L.; Marinazzo, E.; Ghigo, E.; Arviat, E. Tratamentul cu hormon de creștere în îmbătrânirea umană: beneficii și riscuri. Hormoni 2008, 7, 133–139. [CrossRef] [PubMed]
19. Sattler, FR Hormonul de creștere la bărbați în vârstă. Cea mai bună practică. Res. Clin. Endocrinol. 2013, 27, 541–555. [CrossRef]
20. Iată, YH; Chen, YJ; Chang, CI; Lin, YW; Chen, CY; Lee, MR; Lee, VS; Tzen, Teaghrelins JTC, tetraglicozide flavonoide acilate unice din ceaiul Chin-shin oolong, sunt presupusi agonişti orali ai receptorului de grelină.
J. Agric. Food Chim. 2014, 62, 5085–5091. [CrossRef]
21. Hsieh, SK; Iată, YH; Wu, CC; Chung, TY; Tzen, JTC Identificarea intermediarilor biosintetici ai teaghrelinelor și a compușilor asemănător teaghrelinei din ceaiurile oolong și acoperarea lor moleculară la receptorul grelinei.
J. Food Drug Anal. 2015, 23, 660–670. [CrossRef]
22. Hsieh, SK; Chung, TY; Li, YC; Iată, YH; Lin, NH; Kuo, PC; Chen, WY; Tzen, Ginkgoghrelins JTC, glicozide flavonoide acilate unice din Folium Ginkgo, stimulează secreția de hormon de creștere prin activarea receptorului de grelină. J. Etnofarmacol. 2016, 193, 237–247. [CrossRef]
23. Han, L.; Mavis, BY; Liu, E.; Zhang, Y.; Li, W.; Cântec, X.; Fu, F.; Gao, X. Caracterizarea structurală și identificarea glicozidelor feniletanoide din Cistanches deserticola YC Ma prin UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Phytochem. Anal. 2012, 23, 668–676. [CrossRef]
24. Lu, D.; Zhang, J.; Yang, Z.; Liu, H.; Li, S.; Wu, B.; Ma, Z. Analiza cantitativă a Cistanches Herba folosind cromatografie lichidă de înaltă performanță cuplată cu detectarea matricei de diode și spectrometrie de masă de înaltă rezoluție combinată cu metode chimiometrice. J. Sep. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef]
25. Luna, M.; Kim, HG; Hwang, L.; Seo, JH; Kim, S.; Hwang, S.; Kim, S.; Lee, D.; Chung, H.; Oh, MS; et al. Efectul neuroprotector al grelinei în 1-metil-4-fenil{-1, 2, 3, un model de 6-tetrahidropiridină de șoarece al bolii Parkinson prin blocarea activării microgliale. Neurotox. Res. 2009, 15, 332–347. [CrossRef]
26. Lupien, SJ; Isabelle, OM; Hupbach, A.; Tu, MT; Buss, C.; Walker, D.; Pruessner, J.; Mcewen, BS Dincolo de conceptul de stres: încărcare alostatică - O perspectivă biologică și cognitivă a dezvoltării. În Psihopatologie de dezvoltare: Volumul doi: neuroștiința dezvoltării; John Wiley & Sons, Inc.: New York, NY, SUA, 2015; p. 578–628.
27. Rizzo, M.; Rizvi, AA; Sudar, E.; Soskic, S.; Obradovic, M.; Montalto, G.; Boutjdir, M.; Mihailidis, DP; Isenovic, ER O revizuire a efectelor cardiovasculare și anti-aterogene ale grelinei. Curr. Farmacă. Des. 2013, 19, 4953–4963. [CrossRef]
28. Holst, B.; Lang, M.; Brandt, E.; Bach, A.; Howard, A.; Frimurer, TM; Beck-Sickinger, A.; Schwartz, TW Agonişti inversi ai receptorului de ghrelină: identificarea unui nucleu peptidic activ şi a epitopilor de interacţiune pe receptor. Mol. Pharmacol. 2006, 70, 936–946. [CrossRef]
29. Yamazaki, M.; Nakamura, K.; Kobayashi, H.; Matsubara, M.; Hayashi, Y.; Kanagawa, K.; Sakai, T. Efectul de reglare al grelinei asupra secreției de hormon de creștere din celulele pituitare anterioare de șobolan perfuzate. J. Neuroendocrinol. 2002, 14, 156–162. [CrossRef]
30. Iată, YH; Chen, YJ; Chung, TY; Lin, NH; Chen, WY; Chen, CY; Lee, MR; Chou, CC; Tzen, JTC Emoghrelin, un derivat unic de emodin din Heshouwu, stimulează secreția de hormon de creștere prin activarea receptorului de grelină. J. Etnofarmacol. 2015, 159, 1–8. [CrossRef]
31. Moukhametzianov, R.; Warne, T.; Edwards, PC; Serrano-Vega, MJ; Leslie, AG; Tate, CG; Schertler, GF Două conformații distincte ale helixului 6 observate în structurile legate de antagonişti ale unui receptor beta1-adrenergic. Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 2011, 108, 8228–8232. [CrossRef]
32. Rosenbaum, DM; Zhang, C.; Lyons, JA; Holl, R.; Aragao, D.; Arlow, DH; Rasmussen, SG; Choi, HJ; Devree, BT; Sunahara, RK; et al. Structura și funcția unui complex ireversibil agonist-beta(2) adrenoceptor. Natura 2011, 469, 236–240. [CrossRef]
33. Brooks, BR; Bruccoleri, RE; Olafson, BD; State, DJ; Swaminathan, S.; Karplus, M. CHARMM—Un program pentru energie macromoleculară, minimizare și calcule dinamice. J. Comput. Chim. 1983, 4, 187–217. [CrossRef]
