pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Discuţie

Fundamentele moleculare ale formării engramelor au reprezentat un domeniu de mare interes. Aici profităm de modelul de șoarece TRAP pentru a elucida dinamica accesibilității cromatinei, arhitectura genomică 3-D și expresia genelor pe durata de viață a unei celule engram. În primul rând, arătăm direct astamemoriecodificarea are un efect vast și de lungă durată asupra accesibilității cromatinei. Odată ce această stare cromatinei este stabilită, evenimentele ulterioare, cum ar fimemorieconsolidarea și rechemarea par să aibă un efect minor asupra peisajului cromatinei. Este posibil ca momentul ales pentru rechemare să nu capteze pe deplin evenimentele cromatinei celulelor reactivate, iar modificările ulterioare ale cromatinei ar putea fi asociate cumemoriereconsolidare sau stingere8. Important, în conformitate cu publicațiile anterioare12, 13,23, datele noastre sugerează cămemorieformarea este în mare măsură un fenomen condus de amplificator.

Faceți clic pe Cistanche UK pentru memorie

În al doilea rând, studiul nostru oferă primul peisaj cuprinzător al arhitecturii genomului 3D în diferite faze alememorieformarea, deoarece am arătat relocalizarea segmentelor mari de cromatină și interacțiunile specifice promotor-amplificator dinamice în cadrul acestor compartimente care permit reglarea fină a diferitelor programe transcripționale. Mai mult, arătăm că promotorii genelor reglate în jos interacționează mai frecvent cu amplificatori care găzduiesc represori transcripționali și invers.

În sfârșit, munca noastră oferă primele dovezi pentru un eveniment de amorsare funcțional, care este caracterizat printr-o creștere inițială a accesibilității amplificatorului în timpul codificării, fără modificări transcripționale așteptate. Analiza noastră a arătat că, odată cu reactivarea, neuronii engramei utilizează un subset de interacțiuni denovopromotor-amplificator, în care amplificatorii amorsați sunt aduși în contact cu promotorii lor respectivi pentru a regla genele implicate în transportul ARNm și în traducerea locală a proteinelor în compartimentele sinaptice. Aceste modificări corespundeau modificărilor morfologice și funcționale așteptate. În mod colectiv, se pare că celulele engramei sunt marcate la nivel epigenetic și interacțiunea dintre accesibilitatea cromatinei, arhitectura genomului 3D și interacțiunile promotor-amplificator descriu un sistem bine coordonat care duce la o creștere transcripțională întârziată în timpul reactivării engramei.

Ca în orice lucrare, au existat câteva limitări ale studiului. Utilizarea șoarecilor TRAP dependenți de tamoxifen permite rezoluția temporală, dar deschide o fereastră de etichetare de aproximativ 12 ore, care ar putea duce la etichetarea nespecifică a neuronilor care nu fac parte din experiența CFC. Mai mult, așa cum s-a sugerat anterior37, neuronii etichetați cu arc ar putea fi eterogene și să includă diferite ansambluri care reglementează atâtmemoriediscriminare și generalizare. În plus, orice punct de timp înainte de 1,5-2 ore (devreme), nu va fi suficient pentru a capta evenimentele transcripționale și translaționale cauzate de recombinarea ADN-ului, adică expresia recombinazei Cre și expresia finală a genei eYFP5. Prin urmare, credem că multe grupuri tranzitorii timpurii de DEG au fost ratate, deoarece s-a arătat anterior că multe IEG-uri revin la nivelurile de bază după 2 ore (cu excepția Arc46). În cele din urmă, deși studiul nostru s-a concentrat pe hipocamp, plasticitatea structurală și sinaptică a fost legată de stocarea pe termen lung a informațiilor în alte regiuni ale creierului, cum ar fi cortexul prefrontal, amigdala2. Studiile viitoare ar trebui să determine dacă aceste modificări epigenetice pot reprezenta un proces critic global implicat în formarea și păstrarea pe termen lung a amintirilor sau dacă este unic pentru circuitele hipocampului.

Metode

Șoarecii și comportamentul

După cum s-a descris anterior6, șoarecii ArcCreERT2 (plus) au fost crescuți cu linie homozigotă R26R-STOP-floxed-galben fluorescent (eYFP). ~ 140 de descendenți de sex masculin ulterioare au fost genotipați folosind protocolul de genotipizare Jackson Laboratory. Șoarecii au fost găzduiți patru până la cinci pe cușcă într-o cameră de colonie de 12 ore (06:00–18:{00) la 22 de grade și 40–60 la sută umiditate. Mâncarea și apă au fost furnizate ad libitum. Testarea comportamentală a fost efectuată în timpul fazei de lumină. Cu 1 oră înainte de testul comportamental, șoarecii au primit o doză de 4-Hidroxitamoxifen (4- OHT, H6278, Sigma-Aldrich), care deschide o fereastră de etichetare de aproximativ 12 ore5. Pentru a minimiza eticheta nespecifică eYFP, cu o zi înainte de sarcina comportamentală (de exemplu CFC), șoarecii au fost găzduiți singuri într-o cameră întunecată/întunecată de 24 de ore. În plus, pentru a reduce nivelul de anxietate, a fost adăugat un tub în cușcă pentru adăpost și cuibărit. În ziua următoare, șoarecii au fost injectați cu TAM cu 1 oră înainte de CFC. În urma sarcinii comportamentale, șoarecii au fost fie eutanasiați după 1,5-2 ore, iar creierele au fost colectate. sau plasat înapoi în camera întunecată pentru următoarele 48 de ore. După ce șoarecii au fost scoși din întuneric, aceștia au revenit la un ciclu normal de 12 ore (06:00–18:00), în aceeași cameră. 3 zile mai târziu (în total 5 zile după CFC), jumătate din cohorta de șoareci au fost eutanasiați și creierul a fost colectat, în timp ce cealaltă jumătate s-a întors în camera de testare, unde au fost expuși semnalului care induce frica (ton și context) . Toate lucrările la șoarece au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea animalelor din cadrul Diviziei de Medicină Comparată de la Institutul de Tehnologie din Massachusetts. Cistanche se poate îmbunătățimemorie.

Cistanche poate îmbunătăți memoria

Condiționarea contextuală a fricii

Aparatul de condiționare a fricii contextuale (CFC) și programul de achiziție au fost de la TSE-Systems. Șoarecii au fost introduși în camera CFC, după 3 minute de obișnuire inițială, un ton de 3 kilo Hz cu o intensitate de 80 DB a fost prezentat timp de 30 de secunde și a fost terminat cu șoc de picior de 0,7 mA timp de 1 secundă. 70% izopropanol a fost folosit între experimente pentru a curăța cuștile. 5 zile mai târziu, șoarecii au fost introduși în contextul condiționat inițial, împreună cu tonul, iar nivelurile de îngheț au fost măsurate timp de 3 minute (parametrii impliciti ai software-ului TSE utilizați pentru a monitoriza comportamentele de îngheț), pentru a evalua contextual.memorie. Contextul B a fost un context modificat A. Barele din oțel inoxidabil au fost acoperite cu o inserție de plastic alb, pereții exteriori ai camerelor au fost acoperiți cu forme de bandă adezivă pentru a schimba aspectul camerei. Camera a fost parfumată cu vanilie, iluminarea camerei a fost mult mai puternică și șoarecii au fost transportați la aparat într-un cărucior diferit de contextul A.

Droguri

Recombinarea la șoarecii transgenici ArcCreERT2 × R26R-STOP-floxed-EYFP a fost indusă utilizând 4-Hidroxitamoxifen (4-OHT, H6278, Sigma-Aldrich). 4-OHT a fost dizolvat în 2,5 ml de EtOH/100 la sută și agitat pe un agitator timp de 30 de minute. Apoi, s-au adăugat 5 ml de ulei de porumb și s-au agitat într-un agitator timp de 1 oră. În cele din urmă, tuburile au fost plasate timp de 30 de minute la 60 de grade pentru a permite evaporarea completă a EtOH. O singură injecție de 50 mg/kg a fost injectată intraperitoneal (ip).

Imunohistochimie (IHC)

Șoarecii au fost perfuzați transcardic cu 25 ml de soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) rece ca gheață, urmat de 40 ml de paraformaldehidă 4% în PBS. Creierele au fost îndepărtate și post-fixate în 4% PFA peste noapte la 4 grade și transferate în PBS până la secționare. Creierele au fost montate pe o etapă de vibratom (Leica VT1000S) folosind superglue și secționate cu o grosime a feliei de 40 μm. Feliile au fost spălate cu PBS și blocate folosind 1% albumină serică bovină (BSA) preparată în PBS care conține 0,1% Triton-X100 (PBST) timp de 2 ore la temperatura camerei. Tamponul de blocare a fost aspirat și feliile au fost incubate cu anticorpul primar corespunzător (Tabelul suplimentar 11) peste noapte la 4 grade pe un agitator. Feliile au fost apoi spălate de trei ori câte 15 minute fiecare cu tampon de blocare și apoi au fost incubate cu anticorpii secundari conjugați Alexa Fluor 488, 594 sau 647 timp de 2 ore la temperatura camerei. După trei spălări de 15 minute fiecare cu tampon de blocare și o spălare finală cu PBS timp de 10 minute, feliile au fost montate cu fluromount-G (Electron microscopic Sciences). Cistanche se poate îmbunătățimemorie.

Hibridizare in situ (RNAscope®)

Probele au fost preparate pe baza instrucțiunilor producătorului pentru testul RNAscope® multiplex fluorescent v2 (diagnosticare celulară avansată, SUA), cu puține modificări și combinate cu protocolul de imunohistochimie (IHC). În primul rând, probele au fost colorate pentru anticorpi primari (Arc și GFP) și secundari (Alexa Fluor 488 și, respectiv, 594) (așa cum este descris în protocolul IHC de mai sus). Felii de creier au fost încorporate pe o lamă de sticlă și

deshidratat timp de 30 min la RT. Apoi, s-a trasat o barieră în jurul fiecărei secțiuni cu stiloul hidrofob Immedge™ și probele au fost tratate cu peroxid de hidrogen RNAscope® timp de 10 minute la temperatura camerei (nu s-a aplicat nicio recuperare a țintei și tratament cu protează). Pe baza instrucțiunilor producătorului, secțiunile au fost supuse hibridizării sondei (RNAscope® Probe-Mm-Gria1, 26241, Advanced cell diagnostics), amplificării și dezvoltării semnalului HRP-C1 folosind canalul TSA® Plus Cyanine 5. Cistanche poate îmbunătăți memoria.

Analiza imagistică

Imaginile au fost obținute folosind un microscoape confocale LSM 710 sau LSM 880 (Zeiss) cu obiective de 10×, 20×, 40× sau 63× la setări identice pentru toate condițiile. Imaginile au fost cuantificate folosind ImageJ 1.42q sau Imarisx64 8.1.2 (Bitplane, Zurich, Elveția). Pentru fiecare condiție experimentală, cinci secțiuni coronale de la cel puțin cinci animale au fost utilizate pentru cuantificare. Cistanche poate îmbunătăți memoria.

Quantification of tagged cells—The surfaces module was utilized to detect Arc+ and eYFP+ cells. Double positive cells (co-localization of Arc+/eYFP+) were then counted using the Surface-To-Surface Xtension module. After applying the 'area' filter (>6μM) pentru a elimina etichetarea nespecifică, cuantificarea celulelor dublu pozitive a fost efectuată în CA1, CA3 și DG. Cistanche poate îmbunătăți memoria.

Cuantificarea proteinelor Eif și Gria1/ARNm - Modulul de suprafețe a fost utilizat pentru a detecta și a reda 3D axonii neuronilor pe baza semnalului GFP. Punctele pozitive EiF2a, Eif4E, Eif3E și Gria1 -au fost apoi numărate utilizând modulul pete. În cele din urmă, modulul Spots Close - To -Surface Xtension a fost rulat pentru a găsi subsetul de puncte care sunt mai aproape de obiectele de suprafață decât pragul definit de 1uM și excluderea punctelor care se încadrează în afara acestui interval.

Morfologia coloanelor vertebrale - Colonii vertebrali au fost clasificați în trei tipuri în funcție de lungimea coloanei vertebrale (L), diametrul capului (Dh) și diametrul gâtului (Dn). Tepii ciuperci – Dn=L, Tepii subțiri – L > Dn și Dh Mai mari sau egali cu Dn, Tepii ciuperci – Dh Mai mari sau egali cu 2Dn, Tepii măriți de ciuperci – Dh Mai mare sau egal cu 2Dn.Cistanche poate îmbunătăți memoria.

Cistanche poate îmbunătăți memoria

Pregătirea țesuturilor

Țesutul hipocampic a fost extras și congelat rapid. După extracție, probele au fost imediat omogenizate în {{0}},5 mL PBS rece cu gheața cu inhibitori de protează (Pi) (11836170001, Roche ). Pentru a atenua cât mai mult posibil impactul de sortare, numai în experimentele NC-RNAseq și capture-HiC, suspensia a fost fixată cu 1% (pentru NC-RNAseq/HiC) sau 2% (pc-HiC) paraformaldehidă timp de 10 minute, stinsă. cu glicină 2,5 M timp de 5 minute și spălat de două ori cu 5 ml de PBS. Acest proces păstrează peisajul transcripțional și al cromatinei și minimizează distorsiunea de sortare. Pentru ATACseq, RNAseq și capture-HiC, suspensia a fost centrifugată la 1200 g, 4 grade, timp de 5 minute, iar peletul a fost resuspendat în 5 ml tampon hipoton NF-1 (0,5 procente Triton X{-100/ 0,1 M zaharoză/5 mM MgCI2/1 mM EDTA/ 10 mM Tris-HCI, pH 8,0, Pi). Apoi, suspensia a fost omogenizată (pistil A) cu 30 de lovituri și pistilul a fost spălat cu 5 ml suplimentar de tampon NF-1 pentru un total combinat de 10 ml. Suspensiile au fost colectate toate într-un tub conic de 15 ml, filtrate cu un filtru cu ochiuri de 70 μm (08–771-2, Falcon) și incubate pe gheață timp de 30 de minute. Nucleele granulate (toate centrifugele au fost de 4 grade, 1.600 × g timp de 15 minute) au fost resuspendate în 10 ml PBS plus 1% BSA plus Pi și incubate pe gheață timp de 1 oră. Nucleii au fost centrifugați și peletul a fost resuspendat în 1 mL PBST plus 1% BSA plus Pi și incubat cu anticorpi primari NeuN, Arc și GFP peste noapte la 4 grade. Anticorpii nelegați au fost spălați de două ori cu 5 mL de PBS și, în final, resuspendați în 1 mL PBS plus 1% BSA plus Pi și anticorpi secundari timp de 2-4 ore la 4 grade. După două spălări, nucleele au fost resuspendate în 0,5 ml (PBS plus 1% BSA plus Pi) și filtrate cu un filtru de plasă de 40 μm pentru sortarea FACS. Diclorhidrat de 4′,6-Diamidin{-2'-fenilindol (DAPI) a fost adăugat direct în tuburile FACS (1:5000, 10236276001, Sigma-Aldrich). Cistanche se poate îmbunătățimemorie.

Citometrie în flux

Pentru citometria în flux, nucleele au fost închise mai întâi utilizând parametrii zonei pulsului de dispersie frontală și laterală (FSC-A și SSC-A), excluzând resturile, urmate de excluderea agregatelor folosind lățimea pulsului (FSC-W și SSC-W). Apoi colorarea de control izotip a fost utilizată pentru a seta porțile NEUN plus, ARC plus și GFP plus. Pentru a asigura o populație neuronală omogenă, populația NeuN plus a fost blocată înainte de a se încadra populațiile bazate pe ARC plus și GFP plus fluorescență. Am sortat patru populații diferite din trei momente de timp diferite; Aproximativ 1,5–2 ore după expunerea la FS i) NeuN plus /GFP plus ii) NeuN plus /GFP-. După cinci zile, în absența extragerii, am colectat iii) NeuN plus /GFP plus . Într-o cohortă diferită, șoarecii au fost reexpuși la stimulul condiționat. La 1,5–2 ore după reexpunere am colectat iv) NeuN plus /ARC plus /GFP plus. Toate nucleele au fost sortate în tuburi Eppendorf de 1,5 ml conţinând; 500 ul PBS plus 1% BSA plus Pi pentru ATCAseq, 200 ul de tampon de digestie (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit pentru FFPE, Cat. AM1975, Invitrogen) pentru RNAseq, 500 ul de liză proaspătă rece ca gheață tampon (10mM Tris pH=8, 10mM NaCl, 0,2% Igepal CA-630, apă de calitate Pi și PCR) pentru Hi-C/capture-HiC. Analiza datelor a fost efectuată cu Flowjo (v10).

Chip-qPCR

Imediat după următoarea sortare, 10,000 celule au fost granulate la 4 grade, 1600 × g timp de 15 minute și resuspendate în tampon de liză SDS. ChIP a fost realizat pe baza instrucțiunilor producătorului pentru Kitul ChIP-IT High Sensitivity® (HS) (nr. catalog 53040, Active Motif, SUA) folosind anti-H3K4me1 (Abcam, ab8895, 1:100) și anti-H3K27ac (Abcam, ab4729, 1:100) anticorpi. Testele ChIP au fost efectuate într-o unitate PCR în timp real Bio-Rad CFX96 connect folosind amestecul de reactivi SsoFast™ EvaGreen® qPCR (Bio-Rad, 172–5202). Probele au fost testate în trei exemplare și rezultatele au fost normalizate la intrare. Secvențele de perechi de primeri pentru testele ChIP-qPCR sunt enumerate în Tabelul suplimentar 12.

Cistanche poate îmbunătăți memoria

ATAC-seq

pregătirea bibliotecilor— Bibliotecile ATAC seq au fost pregătite așa cum a fost descris anterior în 49, cu modificări minore. 10,000 celule din fiecare grup, au fost extrase de la 8-10 șoareci diferiți și considerate ca N=1. Pentru pregătirea bibliotecii au fost utilizate 3-4 replici biologice (N=3-4). Imediat după următoarea sortare, celulele au fost centrifugate (4 grade, 1.600 × g timp de 15 minute) și resuspendate în tampon de liză rece proaspăt de 50 ul (0,15% NP-40 în loc de Igpal) și legănate pe gheață timp de 10 minute . Apoi, reacția de segmentare (kit de pregătire a probei de ADN Nextera 24 reacții, FC-121–1030, Illumina) a fost efectuată în volum de 25 ul (12,5 ul TD, 1,25 ul TDE1, 11,25 ul apă fără nuclează), timp de 30 ul. min la 37c cu legănat ușor. Fragmentele de ADN crescute au fost amplificate și codificate cu bare folosind reacția PCR (1 ciclu; 5min – 72c, 30sec – 98c, 10 cicluri; 15sec – 98c, 30sec – 60c, 3min – 72c). Urmând protocolul producătorului, ADN-ul amplificat a fost curățat și purificat utilizând bile AMPure 1,8x (perle AmpureXP, Beckman Coulter, A63880). După QC al bioanalizatorului pentru dimensiunea și distribuția bibliotecii, bibliotecile au fost secvențiate pe platforma Illumina Nextseq 550 la Centrul MIT BioMicro. Cistanche poate îmbunătăți memoria.

Analiza ATAC-seq — Datele brute fastq ale citirilor de secvențiere la capătul împerecheat de 40-bp au fost aliniate la genomul de referință mm9 al șoarecelui folosind Bowtie 2.0 în modul final de pereche50. Colecția Samtools51 a fost folosită pentru sortarea, eliminarea duplicatelor PCR (roșu în sus), indexarea fișierelor BAM (index) și calcularea statisticilor bibliotecii (flagstat, vezi Tabelul suplimentar 13). Fișierele BAM au fost subeșantionate de la citirile aliniate, împerecheate și unice corespunzător la 50M. Vârfurile cromatinei deschise au fost analizate utilizând software-ul MACS252. Regiunile cu acces diferențial (DAR) au fost identificate de Diffbind v1.16.353 cu parametrii și setările implicite pentru a utiliza DESeq2 (limită; FDR < 0,01;="" modificări="" ale="" ori=""> 1,5). Matricea completă a numărărilor normalizate (RPKM54) a fost preluată de pachetul DiffBind. Pentru o generație de piese de tip bigwig, fișierele de semnal de pileup (fragment pileup per milion de citiri) în format biografie au fost construite utilizând funcția MACS2 call peak cu steagurile -B –SPMR. Apoi, îmbogățirea pliului normalizat (FE) pe urmele lambda de intrare a fost generată folosind funcția bdgcmp a MACS2 cu setarea - m FE. Apoi fișierele bedGraph au fost convertite în format bigwig. Cistanche poate îmbunătăți memoria

Instrumentele IGV55 au fost folosite pentru vizualizarea fișierelor mari. ChromHMM56 a fost utilizat pentru a stabili un model de stare a cromatinei din două studii independente care au utilizat țesutul hipocampus în vrac înainte și după șocul piciorului21,22 și pentru a determina ofertele de îmbogățire a pliului față de modelul de stare. Analiza îmbogățirii motivelor57,58 și adnotarea vârfurilor au fost efectuate cu instrumentele HOMER59. Toate codurile sunt disponibile într-un fișier software suplimentar