Partea 5: Cartografierea interacțiunii epigenomice și transcriptomice în timpul formării și retragerii memoriei în Ansamblul Hipocampal Engram

ali.ma@wecistanche.com

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 6

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 5

Date extinse Fig. 2: DAR-urile stabile sunt predominant îmbogățite pentru mărcile de îmbunătățire

(a) Flux de lucru pentru disecția prin citometrie în flux a diferitelor populații neuronale din hipocamp, în timpulmemorieformarea si recuperarea. Grafice FACS reprezentative care arată expresia întregii populații (panoul din stânga). O selecție ulterioară a fost făcută pe nuclee unice și populație NeuN plus /DAPI plus (panoul din mijloc). În sfârșit, selecția s-a făcut pe sub-populația închisă; GFP plus (ajustat la ~2,5% din toate celulele), ARC plus /GFP plus (~0,15% din toate celulele) și nucleele au fost sortate în tuburi Eppendorf de 1,5 ml acoperite cu 200ul de 1% PBS.

Apasa pePudra de extract de Cistanche imbunatateste memoria

(b) Diagrama Venn (stânga) și tabelul (dreapta), ilustrează suprapunerea dintre DAR-urile identificate în diferitele comparații pe perechi în timpulmemorieformare și rechemare.

(c) Analiza statistică bazată pe reeșantionare a fost efectuată pentru a determina dacă îmbogățirile stărilor cromatinei peste emisiile ChromHMM (observate) sunt semnificative statistic. Îmbogățirea așteptată a fost calculată prin efectuarea a 10,000 seturi aleatorii de suprapuneri (permutări) între „toate site-urile accesibile” și „toate site-urile de modificare a histonelor (adică toate emisiile)” și prezentată ca histogramă în figura. O dimensiune a eșantionului din fiecare set randomizat a fost determinată de dimensiunea DAR din fiecare stat. Au fost calculate media și abaterea standard a eșantionului (Tabelul suplimentar 3). Numărul de suprapuneri observate între DAR și fiecare emisie a fost calculat și prezentat sub formă de linii. scorul z a fost calculat ca pârghii; Z=(valori observate (X) – media probei (μ))/(abaterea standard a probei (σ)). z-score Bazal vs. precoce; SE 10,5, WE 6,9. Grajd; SE 16,9, WE 12,7, toate p < 0,0001,="" scor="" z="" early="" vs.="" late;="" sp="" 91,7,="" wp="" 38,7.="" întârziere="" vs.="" reactivat;="" sp="" 26.8,="" wp="" 28.9,="" toate=""><0.0001. p-values="" (two-sided)="" were="" calculated="" from="" the="" z-table.="" a="" full="" analysis="" is="" reported="" in="" supplement="" table="">

(d) Diagrama circulară arată procentul diferitelor stări de amplificare, pentru toate regiunile stabile. Suprapunerea fiecărei regiuni stabile a fost efectuată cu datele H3K4me1 și H3K27ac ChIP-seq publicate anterior, obținute la 1 oră după FS21. Stările de amplificare au fost clasificate ca „amorsate” – se suprapun cu regiunile marcate doar cu H3K4me1, „active” – cu H3K4me1/ H3K27ac sau „latente” – fără suprapunere.

(e) Motifs identified from nucleosome-free regions (NFR) on the ATAC-seq tracks from each state (Basal, Activated -early, Activated -late, and Reactivated). Peaks were divided into positions that were annotated to promoters (5kb from TSS) and enhancers (>5 kb de la TSS). Mărimea cercului indică procentul de îmbogățire (1–50 la sută). Culoarea indică –log (valoarea P).

Date extinse Fig. 3: Amorsarea coordonată a stării epigenetice în timpulmemoriecodificare şi

(a) Proprietățile interacțiunilor detectate de Chicago în fiecare fază (bazal, activat - timpuriu, activat - târziu și reactivat). Setările implicite și un prag de scor de 5 au fost utilizate în apelurile de interacțiune semnificative, efectuate în comun pe toate replicile.

(b) Diagrama circulară reprezintă procentul tuturor interacțiunilor detectate la Chicago, care sunt delimitate fie de H3K27ac/H3K4me1 (67,5 procente de note de amplificare), H3K4me3/H3K9ac (46,2 de procente de semne de promovare) sau de H3K27me3 (1,1 procente de note represive).

(c) Imaginea browserului epigenom WashU, cuprinzând o regiune de ~ 500 Kb din jurul genelor Eif4e2. Arcurile arată intensificatori semnificativi comuni (dreptunghi roșu) și unici (săgeți) care interacționează cu promotorii (dreptunghi albastru).

(d) Exemple de interacțiuni numite de Chicago. Grafice care arată toate numărul de citire de la bait-other-end (amplificator), în intervalul de 500–700 kb (în amonte și în aval) de Grink3 și Promotori Wwc2. Interacțiunile semnificative detectate de Chicago (scor mai mare sau egal cu 5) sunt afișate în roșu, iar interacțiunile sub prag (3 mai puțin sau egal cu scorul < 5)="" sunt="" afișate="" cu="" albastru.="" liniile="" gri="" arată="" numărul="" așteptat,="" iar="" liniile="" întrerupte="" sunt="" limita="" superioară="" a="" intervalelor="" de="" încredere="" de="" 95%.="" (e)="" analiza="" de="" îmbogățire="" a="" suprapunerii="" între="" amplificatori="" și="" dar="" care="" interacționează,="" folosind="" o="" procedură="" de="" permutare="" pe="" 10,000="" seturi="" aleatorii="" de="" site-uri="" accesibile.="" histograma="" prezintă="" distribuția="" aleatorie="" de="" eșantionare="" a="" site-urilor="" accesibile="" pentru="" fiecare="" condiție="" (basal="" vs.="" activat="" -="" precoce,="" activat="" -="" timpuriu="" vs.="" activat="" -="" târziu,="" activat="" -="" târziu="" vs.="" reactivat,="" stabil).="" numărul="" de="" loci="" suprapusi="" este="" prezentat="" în="" linii="" colorate="" din="" neuronii="" bazali,="" activați="" -="" timpurii,="" activați="" -="" târziu="" și="" reactivați.="" dar="" de="" bas="" vs.="" activat="" -devreme="" (scor="" z;="" 7,1,="" 7,7,="" 8,5,="" 10,9).="" dar="" de="" activat="" -devreme="" vs.="" activat="" -tarziu="" (z-score;="" -0,1,="" -0,8,="" -2,4,="" -3,2).="" dar="" de="" activat="" -tarziu="" vs.="" reactivat="" (0,4,="" 1,8,="" 0,4,="" -0,2).="" dar="" de="" stabil="" (scor="" z;="" 1,7,="" 2,0,="" 6,5,="">

Date extinse Fig. 4: Modificări ale cromatinei care apar în timpul activării fazei incipiente

(a) Analiza suprapunerii între numele genelor din analiza diferențială în perechi și datele publicate anterior de i) celule granulare DG activate la 1 oră după expunerea nouă32 ii) 24 de ore după FS20 și iii) după stimularea prelungită (6 ore) a corticalei cultivate de șoarece neuroni cu KCl33. Analiza a fost efectuată de pachetul GeneOverlap R.

(b) Citirile exonice (roșu) și intrronice (albastru) au fost cuantificate separat în toate condițiile și comparate cu activitatea transcripțională măsurată prin DEseq2. Citirile au fost normalizate (RPKM) și modificările log2FC sunt prezentate pentru fiecare stare. diagrama viorii indică media,

intervalul intercuartil și ANOVA minim și maxim, unidirecțional (parametric, nepereche), bazal vs. precoce; F (5, 248)=389.9. Devreme vs. târziu; F (5, 2374)=2183. Întârziere vs. Reactivat. F (5, 1357) {{10}},5, Toate Ps < 0,0001.="" comparațiile="" multiple="" ale="" lui="" bonferroni.="" ns="nesemnificativ," ***p=""><>

(c) Raporturile exon/intron au fost măsurate în fiecare grup în toate condițiile (scara Log2FC). graficul viorii indică media, intervalul intercuartil și minim și maxim, ANOVA unidirecțional (parametric, nepereche), F (5, 1143)=260.2, P<0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test.="" n.s="non-significant," ***p="" <="">

(d) Analiza suprapunerii între DAR și DEG-uri în timpul diferitelormemoriefaze. DAR-urile din regiunile Intergenic și introni au fost mapate la genele lor respective cu hărțile de interacțiune pc-HiC. Analiza suprapunerii a fost efectuată de pachetul GeneOverlap R. Valoarea P (numerele) și raportul de cote (culoare) din testul exact al lui Fisher sunt prezentate în harta termică. ns – nu este semnificativ.

(e) Corelația Pearson între valorile log2FC ale DAR și log2FC DEG care au fost adnotate în acea regiune (regiunile intergenice au fost mapate prin setul de date pc-HiC). Modificările de accesibilitate cromatinei au fost comparate cu citirile exonice analizate (linia roșie), citirile intrronice (liniile albastre) și modificările transcripționale totale (atât citirile intrronice, cât și cele exonice), măsurate prin Desq2 (linia gri). Toate valorile r și p sunt raportate în tabelul suplimentar 9.

Date extinse Fig. 5: Modificările transcripționale în neuronii activați-tarzi au corelat mai mult

(a) Citirile exonice (roșu) și intrronice (albastru) au fost cuantificate separat în toate condițiile pentru fiecare dintre grupurile identificate în Fig 5B. Citirile au fost normalizate (RPKM) și modificările log2FC sunt prezentate pentru fiecare cluster.

(b) Raporturile exon/intron au fost măsurate în fiecare grup în toate condițiile. Diagrama de vioară indică media, intervalul intercuartil și minim și maxim, n=3 eșantioane independente din punct de vedere biologic ANOVA unidirecțional (parametric, nepereche), Dw – cluster târzie; F (3.968)

652) = 93.97, P<0.0001. reactivation="" -cluster;="" f="" (3,="" 1600)="485.2,"><0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test="" to="" deseq2="" reads.="" ***p="" <="">

Extins Date Smochin. 6: Distinct temporal transcripțional programe sunteți fiind sincronizate la

în mod dependent în prezența tamoxifenului. În panoul din dreapta, imagini reprezentative IHC ale DG. Verde – AAV-eYFP, Roșu – Arc endogen. Bara de scară reprezintă 50 μm.

(b) Evaluarea morfologiei coloanelor vertebrale în timpul diferitelormemoriefaze. Panoul din dreapta arată un singur arbore eYFP plus dendritic cu diferite tipuri de țepi (Stubby, Thin, Mushroom, Enlarged). Bara de scară reprezintă 5 μm. boxplot indică media, intervalul intercuartil și minim și maxim, Activat -devreme: n=4 șoareci /5 secțiuni per animal, Activat -tardiv: n=4 șoareci /4 secțiuni per animal, Reactivat: n=4 șoareci/2 secțiuni per animal. ANOVA unidirecțional (parametric, neîmperecheat), Stubby; F (2, 36)=2.313, P=0.1135. Subţire; F (2, 36)=35.12, pag<0.0001. mushroom;="" f="" (2,="" 36)="38.42," p="" <="" 0.0001.="" bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test,="" ***p="" <="">

(c) Imagini reprezentative IHC și cuantificarea nivelurilor de proteine ​​a doi membri ai familiei EIF; (stânga) Eif2a și (dreapta) Eif3e. Bara de scară reprezintă 10 μm. Datele pentru arborele dendritic sunt prezentate ca raport între număr și lungime (μM). n=4 șoareci /5 secțiune per animal, boxplot indică media, intervalul interquartil și minim și maxim, ANOVA unidirecțional (parametric, nepereche) cu testul de comparații multiple al lui Bonferroni, ns - nesemnificativ, Eif2a Shaft; F (2, 20)=4,484, P=0,0246. Soma; F (2, 21)=19.58, P < 0,0001.="" (activat="" -devreme="" vs.="" activat="" -tarziu="" *p="0.0142," activat="" -devreme="" vs.="" reactivat="" *p="">< 0,0001,="" activat="" -tarziu="" vs.="" reactivat="" *p="0.0303)." eif3e="" arbore;="" f="" (2,="" 14)="1.983," p="0.1745." soma;="" f="" (2,="" 23)="8.309," p="0.0019," (activat="" -devreme="" vs.="" reactivat="" *p="0.0057," activat="" -tarziu="" vs.="" reactivat="" *p="" {{="">

(d) Diagrama circulară prezintă procentul de spini de ciuperci măriți (Dh mai mare sau egal cu 3Dn) și spini de ciuperci din neuronii activați-tarzi și reactivați.

(e) Imagini reprezentative (panoul din stânga) și cuantificare (panoul din dreapta) ale nivelurilor de mARN Gria1, în timpul diferitelor faze alememorie. Datele sunt prezentate ca raport între mai multe puncte și lungimea diafului dendritic. Bara de scară reprezintă 10 μm. N=4 șoareci /5 secțiuni per animal, diagrama cu casetă indică media, intervalul intercuartil și minimul și maximul, Shaft; ANOVA unidirecțional (parametric, nepereche) F (2, 15)=10.41, P=0.0015. Testul de comparații multiple al lui Bonferroni, **P=0.0011. panou inferior - Soma; ANOVA unidirecțional F (2, 12)=0.13, P=0.88.

Date extinse Fig. 7: Interacțiunile cu potențiatori combinatori diferiți conduc la o direcție

(a) Diagramele Venn arată procentul de suprapunere între accesibilitatea cromatinei (DAR) în toatememoriefaze (BAS vs. Activat -devreme, cerc grilă verde deschis; Activat -devreme vs. Activat -tarziu, cerc grilă verde închis; Activat -tarziu vs. Reactivat, cerc grilă portocaliu) și modificări transcripționale totale din toate clusterele identificate (Dw – târziu, Sus – târziu, Stabil, Reactivare, cerc grilă albastră). DAR-urile intergenice și intronii au fost mapate la genele lor respective cu hărțile de interacțiune pc-HiC. Procentul de suprapunere a fost calculat din toate DEG-urile identificate în clustere (n=1095).

(b) Analiza suprapunerii între DAR (pe perechi) și DEG din fiecare cluster. DAR-urile intergenice și intronii au fost mapate la genele lor respective cu hărțile de interacțiune pc-HiC.

Analiza suprapunerii a fost efectuată de pachetul GeneOverlap R. Valorile P și valorile Jaccard (culoare) din testul exact al lui Fisher sunt prezentate pe harta termică (stânga). Procentul de suprapunere a fost calculat din toate DEG-urile identificate în clustere (dreapta).

( c ) Imagine reprezentativă a cromatinei și modificărilor transcripționale ale locusului Gabrb3 din clusterul Dw-tardiv. În timp ce interacțiunile stării timpurii au fost între promotor și amplificatori cu activatori transcripționali (Ap1), interacțiunile stării tardive au fost cu represori transcripționali (Slug). Urmele browserului genomului IGV superioare (violet - Bazal, verde deschis - Activat - timpuriu, verde închis - Activat - târziu și portocaliu - Reactivat) prezintă modificări transcripționale (ncRNA-seq), pistele din mijloc arată dinamica accesibilității cromatinei (ATAC-seq) pe promotor (dreptunghi roșu) și potențiatori (dreptunghi gri). Interacțiunile semnificative promotor-amplificator sunt reprezentate sub formă de arce (urse de browser WashU). Pista inferioară prezintă motive care au fost identificate prin instrumentele HOMER (Slug, Ap1 și Rest).

(d) Diagrame de agregare pentru motive individuale. Valorile de îmbogățire (motive pe bp/per vârf) a șase motive selectate (doi represori, doi activatori și doi bivalenți) au fost evaluate în jurul centrului vârfurilor (-/ plus 4000 bp) din fiecare cluster.

Date extinse Fig. 8: Modelul propus al accesibilității cromatinei, interacțiunii promotor-amplificator și dinamica transcripțională a neuronilor engramei memoriei hipocampale

regiuni, care adăpostesc motive activatoare transcripționale. Această reprogramare promotor-amplificator are ca rezultat creșterea expresiei genelor, care probabil permite stabilizareamemorie. Recall - neuronii engram reactivați au utilizat un subset de interacțiuni amorsate promotor-amplificator, care este asociat cu modificările transcripționale implicate în transportul ARNm la compartimentele sinaptice și traducerea proteinelor. Factorul de transcripție – TF, E(1–3) – amplificatori diferiți care interacționează cu același promotor, Roșu - represori transcripționali, Albastru - activatori transcripționali.

Material suplimentar

Consultați versiunea web de pe PubMed Central pentru materiale suplimentare.

Mulțumiri

Mulțumim lui E. Niederst, J. Penney, S. Barker, RT Stott, M. Victor, A. Watson, N. Dedic, E. Lockshin și membrilor L.HT Lab pentru discuții și sugestii utile. Mulțumim managerilor de laborator Y. Zhou, E. McNamara pentru întreținerea coloniei de șoareci. Mulțumim lui P. Autissier (Institutul Whitehead) pentru ajutor cu FACS. Finanțare: Aceste lucrări au fost susținute de granturile NIH RF1AG062377, AF1AG054012, RO1NS102730, RF1AG064321, Fundația JPB, Fundația de Cercetare a Sindromului Alana Down, Fundația de Cercetare a Sindromului LuMind Down, Fondul Cure Alzheimer, CIRCUITS și Robert A consortium Renee E. Belfer Family Foundation către LH.T. Această lucrare a fost, de asemenea, susținută în parte de NIH Grants R01AG058002, U01NS110453, R01AG062335, UG3NS115064 către MK și LH.T, și R01AG067151, R01MH109978, U01MH119509, R01MHG008155, U24H . HSM este susținut de Burroughs Wellcome Fund și de bursa postdoctorală UNCF-Merck. C. A este susținut de Fundația JPB. RMR este susținut de grantul NIH T32 5T32HD09806. Trusa de pregătire pentru biblioteci Hi-C a fost primită ca un cadou generos de la DovetailTM (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, SUA). Mulțumim echipei Dovetail pentru discuții utile și sugestii.