Prima parte|Un inhibitor al NF-kB și un agonist al AMPK: Predicția rețelei și integrarea multi-omică pentru a obține căi de semnalizare pentru acteozidă împotriva bolii Alzheimer

Prima parte|Acteozide: cum să tratezi boala Alzheimer ca unul dintre ingredientele eficiente ale Cistanche?

Ying-Qi Li1†, Yi Chen1†, Si-Qi Jiang1, Yuan-Yuan Shi2, Xiao-Li Jiang1, Shan-Shan Wu1, Ping Zhou1, Hui-Ying Wang1, Ping Li1* și Fei Li1,2 * 1 State Key Laboratorul de Medicină Naturală, Universitatea Farmaceutică din China, Nanjing, China, 2 Colegiul de Farmacie, Universitatea Medicală Xinjiang, Urumqi, China

Boala Alzheimer (AD) este cel mai frecvent tip de demență.Acteozid (ACT) este un compus izolat dinCistanche tubulosa, care posedă proprietăți neuroprotectoare excelente. Cu toate acestea, mecanismul de bază alACTîn reglarea microgliei polarizarea rămâne nedefinită. Prin urmare, a fost stabilit un model de rețea de calcul pentru a identifica obiectivele de conducere aleACTși să prezică mecanismul său prin integrarea mai multor baze de date disponibile. Modelul AD indus de AlCl3-la larvele de pește zebra a fost creat cu succes pentru a demonstra eficacitatea terapeutică a ACT. Ulterior, celulele BV-2 induse de LPS au descoperit rolul pozitiv al ACT în polarizarea M1/M2. Căile NF-κB și AMPK au fost confirmate în continuare prin analiză transcriptomică, analiză metabolomică, tehnici de biologie moleculară și andocare moleculară. Cercetarea a oferit un mecanism infuziv al ACT și a relevat legătura dintre metabolism și polarizarea microgliei din perspectiva funcției mitocondriale. Mai important, a oferit o abordare sistematică și cuprinzătoare pentru descoperirea țintelor de medicamente, inclusiv modificările genelor, metaboliților și proteinelor.

Cuvinte cheie: acteozid, celule BV-2, metabolism, ARN-seq, mitocondrii, neuroinflamație

Pentru mai multe informații, contactați: ali.ma@wecistanche.com

Faceți clic pe Cistanche DHT pentru memorie

INTRODUCERE

Odată cu îmbătrânirea și creșterea rapidă a populației, numărul cazurilor de demență din lume a arătat o tendință ascendentă.Boala Alzheimer(AD) este o boală neurodegenerativă frecventă însoțită de tulburări cognitive și diskinezie (Perea și colab., 2020), care este cel mai frecvent tip de demență. Se caracterizează prin pierderi neuronale severe, plăci senile și încurcături neurofibrilare (Shiao et al., 2017). PatogeniaBoala Alzheimereste multidimensională și se leagă de neuroinflamație. Neuroinflamația este determinată de activarea celulelor gliale, care este strâns legată de apariția și dezvoltarea AD (Hanslik și Ulland, 2020; Linnerbauer și Rothhammer, 2020). În timpul progresiei și exacerbării neuroinflamației, microglia este considerată un factor cheie. Microglia sunt celulele imune primare din sistemul nervos central, care sunt strâns asociate cu o cascadă de procese precum dezvoltarea creierului, întreținerea mediului neuronal, precum și răspunsurile la răni și reparații (Perea și colab., 2020). Mai mult, microglia poate fi stimulată la un fenotip M1 și poate crește expresia citokinelor proinflamatorii atunci când apar boli legate de neuroinflamație, cum ar fi AD (Tsukahara și colab., 2020). Studiile demonstrează, de asemenea, că polarizarea la fenotipul M1 este adesea însoțită de tulburări metabolice (Li L. et al., 2020), ceea ce duce la dezechilibru al metabolismului energetic și disfuncție mitocondrială (Agrawal și Jha, 2020). Aceste modificări adverse sunt derivate din neurodegenerare, chiar și din boala Alzheimer.

Acteozid (ACT), a glicozid feniletanoid, este derivat în primul rând dinCistanche tubulosa. Dovezile tot mai mari au sugerat că ACT posedă numeroase activități farmacologice, inclusivneuroprotector(Wei și colab., 2019),antiinflamator(Lai și colab., 2019) șiantioxidant(Ji et al., 2019) efecte. În special, s-a dovedit că Acteoside poateîmbunătățirea învățării și a memorieiafectarea, precum și reglarea în creștere a metabolismului energetic la șobolanii induși de streptozotocină (Chen J. și colab., 2020). În plus, poate inhiba, de asemenea, moartea celulelor apoptotice neuronale și deteriorarea mitocondrială la șoarecii experimentali cu encefalomielita autoimună (Li W. et al., 2020). Cu toate acestea, efectul ACT asupra polarizării microgliei M1/M2 și mecanismul său sunt rar raportate. Până în prezent, mecanismele precum repararea funcției mitocondriilor și reglarea metabolismului celular sunt neclare și sunt necesare cercetări științifice suplimentare pentru a clarifica mecanismul exact.

Scopul prezentului raport este de a investiga eficacitatea terapeutică a ACT, precum și mecanismul molecular de bază al ACT asupra AD. Aici, o metodă sistematică in silico de identificare a țintei medicamentului este stabilită pe baza bazelor de date consolidate. Investigăm în continuare posibilele mecanisme ale ACT la nivel biologic molecular prin integrarea secvențierii ARN (ARN-seq) cu metode metabolomice și tehnici de biologie moleculară. Combinația de strategii de screening sistematic in silico, in vivo și in vitro oferă un nou protocol pentru a descoperi în mod obiectiv compușii multi-țintă ai medicinei tradiționale chineze.

MATERIALE ȘI METODE

Modelarea rețelei

Patru platforme online au fost combinate pentru a prezice și a descoperi ținteleActeozid, și anume, GeneCards1, abordarea ansamblului de similaritate (SEA2), SwissTargetPrediction3 și PharmMapper4. Toate asociațiile de gene ale AD au fost colectate independent de la DisGeNET5 și GeneCards. După analiza interacțiunii țintă-țintă efectuată de baza de date String6, rețeaua a fost integrată în continuare de software-ul Cytoscape (Versiunea 3.8.2). Analiza de îmbogățire GO și KEGG a fost efectuată pe baza de date DAVID7 pentru a adnota și a mina rețeaua.

Animale și gruparea modelelor

În acest studiu au fost aleși peștii zebra de tip sălbatic (tulpina AB, în vârstă de 4 luni) (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Acestea au fost menținute sub un ciclu lumină/întuneric de 14/10-h la 28◦C, urmând metoda anterioară (Li YQ și colab., 2020). Toate experimentele peștilor zebra au fost efectuate sub supravegherea Comitetului de etică a animalelor din China Pharmaceutical University. Larvele de pește zebra au fost împărțite în șase grupuri și tratate de la 3 zile post-fertilizare (dpf) la 7 dpf: grup de control, grup model, grup model plus clorhidrat de donepezil (DPZ, Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.) și model plusActeozid(Puritate HPLC mai mare sau egală cu 98 la sută, Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.) grupuri. Grupul de control a fost menținut în mediu cu 0,2% DMSO și grupul model a fost tratat cu 150 pM AlCl3 (pH 5,8). Grupul model plus DPZ a fost co-tratat cu AlCl3 și 8 pM DPZ. Modelul plusActeozidgrupurile au fost co-tratate cu AlCl3 și diferite concentrații de ACT (200, 100 și 50 pM).

Analiza Comportamentală

Mișcările larvelor de pește zebra au fost înregistrate de un analizor de comportament ViewPoint (Zebralab, 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) la 28◦C. Pe scurt, parametrii comportamentali și procesarea rezultatelor au fost în concordanță cu metoda pe care am stabilit-o mai devreme (Li YQ et al., 2020). Aici, viteza medie (AS), schimbarea vitezei (1S), rata de recuperare a discineziei (DRR) și eficiența răspunsului (RE, procente) au fost selectate pentru a evalua recuperarea diskineziei la peștele-zebra.

Determinarea activității acetilcolinesterazei și colin acetiltransferazei

După tratarea de la 3 la 7 dpf, larvele de pește zebra au fost colectate pentru a măsura activitățile acetilcolinesterazei (AChE) și acetiltransferazei colină (ChAT). Pe baza protocolului producătorului, activitatea a fost detectată prin kiturile de test imunosorbent legat de enzime (ELISA) (MLBIO Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China)

Culturi celulare și tratamente

Linia celulară BV-2 a fost achiziționată de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, Statele Unite). Au fost cultivate în DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, China). Mediul a fost suplimentat cu 10% FBS (Gibco, Grand Island, NY, Statele Unite), 100 U/ml penicilină și 100 mg/ml streptomicină, însoțite de 95% aer/5% CO2 la 37°C. Celulele BV-2 au fost incubate cu ACT (50, 25 și 12,5 pM) sau stimulate cu lipopolizaharidă (LPS, 1 pg/ml; Sigma Aldrich, St Louis, MO, Statele Unite) timp de 24 de ore. Celulele au fost observate la microscop inversat (Nikon ECLIPSE Ti2, Japonia).

Test de viabilitate celulară

Testul Kit Counting Kit-8 (CCK-8) (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) a fost utilizat pentru a evalua viabilitatea celulelor. Pe scurt, absorbanța a fost măsurată la 450 nm cu un cititor de microplăci (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, Statele Unite).

Analiza producției de oxid nitric

Oxidul nitric (NO) a fost determinat prin măsurarea nivelurilor de nitriți din supernatantul culturii BV-2 folosind reactivul Griess. Pe scurt, mediul (100 µl) a fost transferat pe o nouă placă de 96-godeuri, același volum de reactiv Griess a fost adăugat în fiecare godeu și a reacţionat timp de 15 minute la întuneric. Absorbția la 540 nm a fost determinată de un cititor de microplăci.

Nivelurile de citokine inflamatorii în supernatant

Concentrațiile de TNF-, IL-1 și IL-10 în supernatantul celulei BV-2 au fost determinate prin truse ELISA conform instrucțiunilor producătorului.

Determinarea metabolismului celular prin analiza HPLC-Q-TOF-MS

Celulele BV{{0}} au fost însămânțate într-un vas cu șase godeuri separat (n=6/grup). După tratament, mediul a fost îndepărtat, iar celulele au fost spălate de trei ori cu PBS rece. Au fost apoi expuși imediat la azot lichid pentru a suprima metabolismul celular. Celulele au fost recoltate cu 8{{30}} procente de metanol rece. Pentru a facilita precipitarea proteinelor, celulele au fost agitate puternic timp de 1 min și centrifugate la 13,000 rpm (15 min, 4◦C). Suspensia celulară a fost uscată sub un curent de azot. Reziduul uscat a fost reconstituit în 150 pl de acetonitril 25% prerăcit. Pentru a asigura stabilitatea și acuratețea analizei secvenței, fiecare probă de celulă cu volum egal (10 µl) a fost combinată ca probe de control al calității. În timpul detectării metaboliților, aceste probe au fost injectate la fiecare șase probe pentru a confirma stabilitatea lor. O alicotă de 1-pl a fost injectată pentru HPLC-Q-TOF-MS. Analiza a fost efectuată pe un sistem HPLC Agilent 1290 conectat cu spectrometrul de masă Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Statele Unite). Separarea a fost efectuată pe o coloană ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 min × 100 mm, 1,7 µm). Faza mobilă a fost compusă din 0,1% acid formic-apă (v/v; A) și acetonitril (B). Rata de asociere a fost stabilită la 0,4 ml/min cu următoarea condiţie optimă de eluare a gradientului: 0 până la 2 min, 5% B; 2 până la 20 min, 5 până la 95 la sută B (mod ioni pozitivi); 0 până la 2 min, 5 procente B; 2 până la 20 min, 5 până la 95 la sută B (mod ion negativ). Parametrii de funcționare ai spectrometrului de masă au fost stabiliți astfel: temperatura gazului, 320◦C; gaz de uscare, 10 L/min; nebulizator, 35 psi; VCap, 4,000 V; fragment, 120 V. Datele brute au fost operate sub MassHunter Workstation Software versiunea B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Statele Unite). Datele brute au fost preprocesate de platforma XCMS. Analiza componentelor principale (PCA) și analiza discriminantă parțială a celor mai mici pătrate (PLS-DA) a datelor normalizate au fost efectuate cu MetaboAnalyst8. În combinație cu literatura de specialitate, metaboliții diferențiali (VIP > 1, testul t p < 0,05)="" au="" fost="" identificați="" pe="" hmdb9.="" în="" cele="" din="" urmă,="" analiza="" căii="" a="" fost="" efectuată="" cu="">

Măsurarea potențialului membranei mitocondriale

Potențialul membranei mitocondriale (MMP) a fost detectat utilizând sonda fluorescentă FL JC-1 (Beyotime, China) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Pe scurt, celulele din diferite grupuri au fost clătite cu PBS și incubate cu soluție de colorare JC-1 timp de 20 de minute la 37◦C. După colorare, celulele au fost spălate de două ori folosind tampon de colorare. Apoi, semnalele fluorescente FL au fost detectate prin citometrie colegi (BD Accuri C6).

Măsurarea adenozinei mitocondriale 50 -trifosfatului

Concentrația de adenozină 50 -trifosfat (ATP) în mitocondrii a fost detectată printr-un kit de testare ATP (Beyotime, China). Pe scurt, mediul de cultură al celulelor BV-2 din diferite grupuri a fost aruncat, iar celulele au fost omogenizate cu tampon de liză pe gheață. Supernatantul obținut după centrifugare (12,000 g, 5 min) a fost utilizat pentru a determina concentrația de ATP. Luminescența a fost detectată de EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

Măsurarea nivelului speciilor de oxigen reactiv intracelular

Kitul de testare a speciilor reactive de oxigen (ROS) (Beyotime, China) a fost folosit pentru a măsura nivelurile de ROS. Celulele din diferite grupuri au fost incubate cu DCFH-DA (10 pM) timp de 20 de minute la 37°C. După încărcarea sondei, celulele au fost spălate de trei ori cu DMEM. Apoi, semnalele fluorescente FL au fost detectate prin citometrie colegi (BD Accuri C6).

Microscopia electronică cu transmisie

Celulele BV-2 au fost însămânțate într-un vas cu șase godeuri. Mediul a fost îndepărtat şi 1 ml de 2,5% glutaraldehidă a fost adăugat rapid în fiecare godeu. Apoi, celulele au fost adunate și fixate cu glutaraldehidă nouă 2,5% la 4°C peste noapte. După fixare, deshidratare și încorporare, celulele au fost observate cu un microscop electronic cu transmisie HT7800 (Hitachi, Tokyo, Japonia).

ARN-Seq și analiza datelor bioinformatice

ARN total din celulele BV-2 a fost extras folosind reactiv Trizol (Vazyme Biotech, China). Toate probele analitice au fost trimise la Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) pentru analiza secvenței ARN. Datele au fost analizate pe platforma online Majorbio Cloud Platform10. RSEM11 a fost folosit pentru a cuantifica abundența genelor. În esență, expresie diferențială

analiza a fost efectuată utilizând DESeq2/DEGseq/EdgeR cu valoarea Q mai mică sau egală cu 0.05; DEG-uri cu|log2FC| > 1 și valoarea Q Mai mică sau egală cu 0.05 (DESeq2 sau EdgeR)/Valoare Q Mai mică sau egală cu 0,001 (DEGseq) au fost considerate a fi gene exprimate semnificativ diferite. În plus, au fost efectuate analize de îmbogățire funcțională, inclusiv GO și KEGG, pentru a identifica care DEG-uri au fost îmbogățite semnificativ în termeni și căi GO la valoarea p corectată de Bonferroni Mai mică sau egală cu 0,05 în comparație cu fundalul întregului transcriptom. Datele originale ale secvenței au fost trimise în baza de date a Arhivei de citire a secvenței NCBI.

Reacție cantitativă în lanț a polimerazei în timp real

ARN-ul total al celulelor BV-2 a fost recoltat utilizând reactiv de izolare ARN-easyTM (Vazyme Biotech, China), iar reacția de transcripție inversă a fost efectuată cu FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, China). Reacțiile au fost efectuate conform protocolului producătorului. ADNc a fost supus testelor cantitative în timp real de reacție în lanț a polimerazei (qRT-PCR) cu primeri specifici și TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, China). Primerii sunt enumerați în Tabelul suplimentar 1 și -actina a fost utilizată ca control intern. Pentru analiza cantitativă a fost utilizată metoda 22 1 1 CT.

Analiza Western Blot

Celulele BV-2 au fost lizate prin tampon de liză RIPA (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, China) care conține 1% cocktail de inhibitor de protează (Thermo Fisher) pentru a obține proteina totală. Proteinele au fost separate cu 10% SDS-PAGE și transferate pe membranele NC. După blocare cu 5% lapte degresat/BSA, membranele au fost incubate cu AMPK (Proteintech), p-AMPK (Affiffinity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), p-NF-κB (ABclonali) sau anticorpi GAPDH (ABclonali) în 5% TBST la 4◦C peste noapte. Membranele au fost incubate cu un anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean (ABclonal) la temperatura camerei timp de 1 oră. Pentru vizualizare și cuantificare au fost utilizate substratul ECL Western blot (Tanon, China), sistemul de imagistică cu gel (Tanon, China) și software-ul ImageJ.

Andocare moleculară

Analiza de andocare moleculară a fost efectuată folosind software-ul Autodock (versiunea 4.2). Afinitatea dintre ACT și proteine ​​a fost observată de software-ul AutodockTools. Structurile proteice tridimensionale (3D) ale AMPK (PDB ID: 5g5j) și NF-kB (PDB ID: 4q3j) au fost preluate din Protein Data Bank12.

Analize statistice

Toate datele sunt exprimate ca medie ± abatere standard și analizate de GraphPad Prism Software (Versiunea 8.0.1). Diferențele dintre grupuri au fost analizate prin analiza unidirecțională a varianței (ANOVA), urmată de testul de comparație multiplă al lui Tukey. p < 0.05="" a="" fost="" considerat="" semnificativ="">

REZULTATE

ACT-AD vizează rețeaua de interacțiune și predicția căilor

Prin consolidarea mai multor baze de date, au fost achiziționate 253 de ținte ale ACT, în timp ce au fost adunate un total de 1.697 de ținte legate de AD. După maparea rețelei țintă, un total de 70 de ținte au fost absorbite în rețeaua de interacțiune țintă ACT-AD (Figura 1A). Analiza de îmbogățire KEGG a implicat că ACT ar putea avea un efect țintă cu spectru larg și multiplu (Figura 1B). De asemenea, a sugerat că ACT are mai multe căi, puncte țintă și elemente în tratamentul AD. Clasificați aceste căi pentru a obține o interpretare corectă a mecanismelor. ACT s-ar putea corela în principal cu transducția semnalului, sistemul endocrin, sistemul imunitar și creșterea și moartea celulelor pentru a juca un rol de confruntare împotriva AD (Figura 1C). Este de remarcat faptul că marea majoritate a acestor căi sunt legate de reacții inflamatorii. Se speculează că acțiunea antiinflamatoare a ACT ar putea fi o parte inextricabilă a rolului său de confruntare împotriva AD.

ACT a atenuat diskinezia și a îmbunătățit funcția sistemului colinergic la larvele AD Zebrafish

Pentru a verifica modelul de rețea, a fost folosit modelul AD indus de AlCl3-la larvele de pește zebra pentru a demonstra efectul ACT. A fost observată mișcarea larvelor de pește zebra în ciclurile de lumină/întuneric și au fost înregistrate traseele lor de înot (Figura 1D). Rezultatele au arătat că ACT a crescut efectiv AS și 1S ale peștelui zebra, iar efectul sinergic a crescut odată cu creșterea dozelor (Figura 1E). DRR și RE au descoperit o comparație mai intuitivă a ACT și DPZ (Figura 1F). În consecință, ACT a atenuat diskinezia, prezentând efecte similare cu DPZ. În general, este de acord că sistemul colinergic joacă un rol important în procesele de învățare și memorie. Astfel, activitățile AChE și ChAT au fost utilizate pentru a dezvălui efectul ACT. Expunerea la AlCl3 la peștele zebra a fost redată cu alterarea colinergică a creierului (Figura 1G). A fost semnificativ faptul că tratamentul cu ACT a suprimat activitatea AChE. În plus, activitatea ChAT a prezentat o scădere după tratamentul ACT. Prin urmare, ACT a arătat un impact profund asupra larvelor de pește zebra AD induse de AlCl3-.

ACT a suprimat polarizarea M1 și a promovat polarizarea M2 în celulele BV-2 induse de LPS

Pentru a confirma în continuare rețeaua, efectul antiinflamator al ACT a fost studiat in vitro folosind celule microgliale BV-2. După tratamentul cu LPS timp de 24 de ore, viabilitatea celulelor BV-2 a scăzut semnificativ. Din fericire, ACT a crescut viabilitatea celulară a celulelor BV-2 induse de LPS (Figura 2A). În plus, a fost observată morfologia celulelor BV-2. După 24 de ore de stimulare LPS, a arătat că celulele BV-2 au suferit o stare de polarizare M1. Modificările morfologice au fost prevenite prin co-tratament ACT (Figura 2B).

Mai mult, rezultatele au indicat că, spre deosebire de celulele BV-2 stimulate de LPS, celulele BV-2 co-tratate cu ACT au suprimat semnificativ expresiile TNF-, IL{-1 și NO (Figura 2C) în supernatantul celular. Acestea sunt citokine proinflamatorii clasice ca indicatori ai polarizării microgliei M1. Similar cu rezultatele ELISA, rezultatele qPCR au descoperit că expresiile ARNm TNF-, oxid nitric sintază (iNOS), IL-1 și CD{86 au fost inhibate semnificativ de tratamentul ACT în comparație cu grupul LPS (Figura 2D). În plus, am măsurat nivelul de polarizare a microgliei M2 prin ELISA (Figura 2C) și qPCR (Figura 2E), iar rezultatele au indicat că ACT a crescut semnificativ nivelurile de expresie a markerului M2 legat de microglia (IL-10, CD206, TGF- și Arg-1). Într-un cuvânt, aceste rezultate au arătat astaACTa suprimat polarizarea microgliei M1 și a promovat fenotipul M2.

Polarizare M1/M2 reglementată ACT prin inhibarea căii NF-kB

Analiza transcriptomică a fost efectuată de ARN-seq pentru a explora mecanismul ACT în celulele BV-2 de la un nivel general. PCA a ilustrat că grupurile de control, LPS și ACT ar putea fi bine distinse (Figura 3A). A dezvăluit 899 de gene exprimate diferențial (DEG) între grupul de control și grupul LPS și 49 DEG între grupul LPS și grupul ACT (Figura 3B). În mod constant, analiza de îmbogățire GO (Figura 3C) și KEGG (Figura 3D) a descoperit că efectul ACT a fost implicat în calea NF-κB. Setul de gene asociate cu calea NF-κB a fost confirmat în continuare, iar homeostazia lor a fost cu siguranță afectată de LPS. După cum era de așteptat, ACT le-a afectat în mod semnificativ expresiile (Figura 3E). Calea NF-kB este o cale clasică de reglare a progresiei inflamației, ducând în cele din urmă la eliberarea de factori proinflamatori. Pentru a obține suport mecanicist, proteina cheie a căii NF-kB a fost evaluată prin Western blot. Stimularea LPS a condus la activarea NF-kB, asociată cu promovarea polarizării M1. În conformitate cu analiza ARN-seq, ACT a inhibat fosforilarea NF-kB stimulată de LPS (Figura 3F). Prin urmare, ACT poate ameliora polarizarea M1 indusă de LPS prin calea NF-κB în celulele BV-2.

Biosinteza argininei afectată ACT, precum și biosinteza pantotenatului și CoA

Predicția de rețea a ACT a dezvăluit că era legată de metabolismul argininei (Arg) și prolinei (Figura 1B). ARN seq a demonstrat că căile afectate de ACT au inclus și biosinteza Arg, precum și biosinteza pantotenat și CoA (Figura 3D). S-a sugerat că tulburările de metabolism ale celulelor BV-2 induse de stimularea LPS sunt asociate cu polarizarea M1 (Orihuela et al., 2016). Astfel, un metabolom celular nețintit prin HPLC-Q-TOF-MS a fost utilizat pentru a identifica efectul ACT asupra metabolismului celular. PCA și PLS-DA (Figura 3G) au ilustrat că grupurile de control, LPS și ACT ar putea fi bine distinse pe baza metaboliților intracelulari. Nivelurile diferiților metaboliți din celulele BV-2 induse de LPS au fost modificate după tratamentul ACT (Figura 3H). În comparație cu grupul de control, au existat 11 metaboliți care s-au schimbat semnificativ în grupul LPS (Tabelul suplimentar 2), în timp ce 14 metaboliți au fost modificați distinct după tratamentul ACT (Tabelul suplimentar 3), implicând 11 căi metabolice (Figura 3I). Efectul ACT a constat în principal în reglarea metabolismului aminoacizilor, metabolismului nucleotidelor, metabolismului energetic și metabolismul cofactorilor și vitaminelor. Interesant, căile metabolice obținute de metabolom au fost în concordanță cu predicția rețelei și ARN-seq, inclusiv biosinteza Arg, precum și biosinteza pantotenat și CoA. Cele de mai sus au arătat că ACT ar putea regla biosinteza Arg, precum și biosinteza pantotenatului și CoA în celulele BV- 2 stimulate de LPS.

ACTDisfuncție mitocondrială BV-2 indusă de LPS atenuată

Mitocondriile sunt în centrul căilor metabolice. Dovezile în evoluție arată că mitocondriile sunt un jucător cheie în polarizarea microglială M1/M2. O prezentare generală a stării mitocondriilor în morfologie și distribuție celulară a fost judecată de TEM. După stimularea LPS, cromatina celulelor BV-2 a fost condensată, iar citoplasma și mitocondriile au fost scăzute (Figura 4A). În plus, cristele mitocondriale ale grupului LPS au fost dezordonate sau chiar au dispărut, prezentând cristoliză parțială, reducerea dimensiunii și morfologie în formă rotundă. Interesant, tratamentul ACT ar putea atenua modificările morfologice induse de LPS în mitocondrii. Pe rând, am examinat funcția mitocondriilor celulelor BV-2 tratate cu LPS, inclusiv producția de MMP și ATP. Producția de MMP (Figura 4B) și ATP în mitocondrii (Figura 4C) au fost îmbunătățite semnificativ în grupul ACT, comparativ cu cei din grupul LPS. Disfuncția mitocondrială poate fi legată de nivelul crescut de ROS în celulă. Analiza citometriei în flux a arătat că conținutul de ROS a fost supraîncărcat în grupul LPS (Figura 4D). Din fericire, ACT a eliminat ROS excesiv. Acesta sugerează că ACT poate restabili funcția mitocondriilor prin curățarea ROS.

ACT a restaurat funcția mitocondriilor prin reglarea PGC-1 și UCP-2

Coactivatorul receptorului activat proliferativ de peroxizom-1 (PGC-1) joacă un rol important în biogeneza mitocondrială (Bi et al., 2019). Stimularea LPS a scăzut expresia PGC-1, prezentând disfuncția mitocondriilor. În mod remarcabil, ARNm-ul genei PGC-1 și expresia proteinei au fost inversate semnificativ prin tratamentul ACT în celulele BV-2 tratate cu LPS (Figura 4E).

Proteina de decuplare mitocondrială-2 (UCP-2) era, de asemenea, cunoscută că reglează funcția mitocondrială. Ca proteină în aval a PGC-1, poate controla depolarizarea MMP indusă de LPS și producția de ROS. Rapoarte recente indică faptul că este esențial pentru procesul de activare microglială, cu reglarea opusă a polarizării M1 și M2 (De Simone și colab., 2015). Rezultatele Western blot au arătat că nivelul proteinei UCP-2 a scăzut după stimularea LPS. Tratamentul concomitent cu LPS și ACT ar putea supraregla expresia UCP-2 în comparație cu tratamentul cu LPS. Nivelul de expresie ARNm al UCP-2 a arătat, de asemenea, modificări similare (Figura 4F). Pentru a rezuma, ACT a restabilit funcția mitocondriilor prin reglarea în sus a PGC-1 și UCP-2.

ACT Microglia reprimată M1

Polarizare prin activare AMPK

Ca senzor cheie de energie celulară, protein kinaza activată de AMP (AMPK) joacă un rol important în menținerea echilibrului metabolismului celular. În același timp, PGC-1 este o proteină în aval de AMPK. După cum se arată în analiza modelului de rețea,ACTar putea regla calea AMPK (Figura 1B). Rezultatele au descoperit că LPS a inhibat activarea AMPK, rezultând tulburări ale metabolismului celular și disfuncție mitocondrială. Este de remarcat faptul că ACT ar putea crește în funcție de doză expresia proteinei p-AMPK (Figura 5A). Se sugerează că ACT ar putea crește expresia PGC-1 și poate restabili funcția mitocondrială prin activarea căii de semnalizare AMPK. În acest studiu, pentru a investiga dacă activarea AMPK a contribuit la efectul de reglare alACTla polarizarea M1/M2, compusul C (CC) a fost folosit pentru a inhiba efectul AMPK. Spre deosebire de nivelul redus de NO din grupul de tratament cu ACT, CC a blocat parțial efectul ACT asupra nivelului de NO (Figura 5B). Pe baza acestor rezultate, ACT ar putea regla polarizarea M1/M2 a celulelor BV-2 prin activarea AMPK.

ACTSe leagă de și NF-kB inhibat, precum și AMPK activat

S-a aplicat andocarea moleculară pentru a confirma dacă ACT se leagă de proteinele NF-kB și AMPK. Constatările au demonstrat că energia de legare aACTiar NF-kB a fost de -8.4 kcal/mol, în timp ce cel deACTiar AMPK a fost de -10,8 kcal/mol. Afinități semnificative au verificat că ACT este legat direct de NF-kB și AMPK (Figurile 5C, D, F, G). Ulterior, posibilele moduri de legare și interacțiuni din buzunarele de aminoacizi au fost explorate în continuare, inclusiv 11 resturi de aminoacizi ale NF-kB (Figura 5E), precum și 12 resturi de aminoacizi ale AMPK (Figura 5H). Aceste rezultate au indicat că ACT ar putea afecta direct NF-kB și AMPK pentru a atenua polarizarea microglia BV-2 M1 și pentru a promova fenotipul M2.