PARTEA 1 Glicozidele de feniletanol protejează hipertrofia miocardică indusă de constricția aortică abdominală prin inhibarea demetilării ECE-1 și îmbunătățirea căii PI3K/PKB/eNOS
Mar 06, 2022
Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Qiong-Ling Fan,1 Jia-Wei Wang,1 Shi-Lei Zhang și colab.
Glicozide feniletanoil (CPhG)reprezintă baza materială de bază a activității farmacologice înCistanche tubulosași au o varietate de efecte farmacologice. Cu toate acestea, nu este clar dacă CPhG(Glicozide feniletanoil din cistanche) au un efect ameliorator asupra hipertrofiei miocardice induse de suprasolicitarea presiunii. În acest studiu, șobolanii masculi SD cântărind (200 ± 20) g au fost stabilite modele de hipertrofie cardiacă prin coarctație aortică abdominală (AAC). După operație, șobolanii au fost gavage cu medicamentul corespunzător timp de 6 săptămâni (CPhG(Glicozide feniletanoil din cistanche) 125, 250 și 500 mg/kg/zi și valsartan 8,3 mg/kg/zi). Au fost detectate ecocardiografie, indicele de greutate a inimii (HWI), aria în secțiune transversală a cardiomiocitelor (CSCA), zona de fibroză, endotelina plasmatică 1 (ET-1) și nivelurile de factori proinflamatori. Rezultatele noastre au arătat că diferite CPhG(Glicozide feniletanoil) scăderea dozei grosimii peretelui posterior al ventriculului stâng (LVPWT), diametrul diastolic final al ventriculului stâng (LVED), HWI, CSCA, zona de fibroză, ET-1, factori proinflamatori, peptidă natriuretică arterială (ANP), peptidă natriuretică cerebrală (BNP) ), nivelurile de ARNm ale enzimei de conversie a endotelinei 1 (ECE-1), nivelurile de proteine ciclooxigenazei 2 (COX{-2), grupele cu mobilitate ridicată 1 (HMGB{-1) și nivelurile de proteine ECE{{8} } nivelul de demetilare în timp ce crește fracțiile de ejecție a ventriculului stâng (LVEF), scurtarea fracționată a ventriculului stâng (LVFS), fosfatidilinozitol 3-kinaza fosforilată (p-PI3K), proteinkinaza fosforilată B (p-PKB) și oxidul nitric endotelial fosforilat sintetaza (p-eNOS). -e indicii CPhG(Glicozide feniletanoil din cistanche) Grupul cu 250 și 500 mg/kg a fost semnificativ diferit de grupul AAC; comparativ cu grupul cu valsartan (AV), indicii grupului CPhG 500 mg/kg nu au fost semnificativ diferiți. În concluzie, CPhGs(Glicozide feniletanoil din cistanche) a ameliorat hipertrofia miocardică la șobolani prin AAC, care poate fi legată de inhibarea demetilării ECE- 1 și de îmbunătățirea PI3K/PKB/eNOS.
2. Materiale și metode
2.1.Animale.
70 de șobolani masculi SPF SD cântăriți 200 ± 20 g (10 per grup) au fost furnizați de Centrul pentru animale experimentale al Universității Medicale Xinjiang (Urumqi, China). Numărul licenței de producție animală a fost SYXK(XIN)2016-0003, iar numărul certificatului a fost SCXK(XIN)2016-002. Studiul a fost aprobat de Comitetul de etică a animalelor al primului spital afiliat al Universității Medicale din Xinjiang (numărul de aprobare 20180223-183). -Au fost menținute cu acces liber la apă și hrană în cuști de plastic și ținute într-un ciclu lumină/întuneric de 12 ore la o temperatură de 22 ± 2 grade și umiditate de 45-55 la sută în Centrul nostru pentru animale experimentale.
2.2. Materiale.
CPhG-uri(Glicozide feniletanoil din cistanche) , al cărui conținut de echinaceea a fost mai mare de 40 la sută și actozidă a fost de peste 16 la sută , a fost achiziționat de la Hetian Di Chen Medical Biotechnology Co., Ltd. Valsartanul a fost achiziționat de la Beijing Novartis Pharma Co., Ltd. Carboximetilceluloză de sodiu (CMC-Na) a fost furnizat de Xian Zhengtian Pharmaceutical Accessories Co., Ltd. Și CPhG-urile au fost dizolvate în 0,5% CMC-Na.
Glicozide feniletanoil din cistanche
2.3. Coarctație aortică abdominală (AAC).
După ce au fost anesteziați cu 2,5% pentobarbital de sodiu (2,5 ml/kg) (Merck, Darmstadt City, Hessen, Germania), șobolanii au fost bărbieriți și ținuți la cald pe perne de încălzire. -en cavitatea abdominală a șobolanului a fost deschisă timp de 2 cm în mijlocul abdomenului într-un mediu steril, viscerele abdominale au fost împinse în partea dreaptă, iar aorta abdominală a fost complet expusă la 0,5 cm. deasupra arterei renale drepte. Acul numărul 8 a fost ligat cu firul numărul 2 în paralel cu cavitatea abdominală suturată [18]. Aortele abdominale ale șobolanilor din grupul simulat au fost separate fără ligatură și nu a existat un grup de control pentru intervenție chirurgicală. -e zi după operație, AC 125 mg/kg, AC 250 mg/kg și AC 500 mg/kg au fost hrăniți cu CPhG(Glicozide feniletanoil din cistanche)prin gavaj; Grupul AV a fost hrănit cu valsartan prin gavaj; și grupul de control, grupul AAC și grupul simulat nu au fost hrăniți cu CPhG sau valsartan, o dată pe zi, timp de 42 de zile consecutive. Doza de medicament a fost stabilită pe baza referințelor anterioare și a experimentelor preliminare [8].
2.4. Ecocardiografie.
La șase săptămâni după AAC, șobolanii au fost anesteziați cu 2,5% pentobarbital sodiu și au efectuat ecocardiografia (Philips HD11 XE, Amsterdam, Țările de Jos). LVPWT, LVED, LVEF și LVFS au fost măsurate de patru ori pentru a calcula mediile ca indicatori finali.
2.5. Indexul Greutății Inimii (HWI).
După ecocardiografie, șobolanii au fost executați prin recoltarea sângelui din aorta abdominală. -e inimi de șobolani au fost îndepărtate din piept și cântărite după ce au fost spălate cu soluție salină normală (4 grade) de 3 ori și s-au scurs cu hârtie de filtru curată. -e HWI a fost calculat prin următoarea formulă: HWI � greutatea inimii greutatea corporală. (1)
2.6. Colorare cu hematoxilină-eozină și Masson.
- Miocardul din ventriculul stâng a fost fixat cu paraformaldehidă 4 procente încorporată în parafină, tăiat transversal cu grosimea secțiunii de 4 μm, uscat în cuptor la 60 de grade timp de 2 ore și apoi colorat cu hematoxilin-eozină sau Masson (Solaibio, Beijing, China). -e structura miocardului a fost observată cu un microscop cu contrast de fază inversat (Leica, Frankfurt, Germania). Software-ul Image J a fost folosit pentru a calcula CSAC și zona de fibroză.
2.7. Testul de absorbție imună legată de enzime (ELISA).
Sângele aortei abdominale a fost extras de la șobolani și plasat într-un tub de anticoagulare timp de 2 ore la temperatura camerei și apoi centrifugat la viteza de 3000 r/min. -e supernatantul a fost absorbit cu pipete (Eppendorf, Hamburg, Germania) și depozitat la 80 de grade pentru testare. ET-1 plasmatic, interleukina 1 (IL{-1 ), interleukina 6 (IL{{-6), factor de necroză tumorală Medicină alternativă și complementară bazată pe dovezi
Nivelurile de (TNF-) (Bioss, Beijing, China) și ciclooxigenază 1 (COX-1) (Cusabio, Wuhan, China) au fost detectate în conformitate cu instrucțiunile kit-ului ELISA.
2.8. PCR specifică metilării.
ADN-ul a fost extras din țesutul miocardic ventricular stâng al șobolanilor prin trusa de extracție ADN (Tiangen Biotech, Beijing, China). -e valoarea de absorbție (valoarea A) a fost egală cu OD260/OD28{0 (1,8 ~ 1,9). 20 ul de ADN genomic (500 pg{-1 ug) a fost modificat cu acid sulfuros prin Methylation-Gold Kit (ZYMO, Orange County, CA, SUA). -e Sistemul de reacție MSP a fost de 25 μL, inclusiv 3,0 μL de șablon ADN modificat cu sulfit, 2,5 μL de 10 × tampon, 2,5 μL de 2,5 mm dNTPs, 1,0 μL de primer de 10 μm, 0,1 μL de Hotstar Taq DNA Polymera Biosenology (TAK) și 14,9 μL de ddH2O. - au fost 45 de cicluri în total: denaturare la 95 de grade, recoacere la 55 de grade și extensie la 72 de grade timp de 30 de secunde. După PCR, 5 μL de produs a fost separat prin electroforeză pe gel de agaroză 2%. -e ADN-ul a fost tratat de M. Sssl metiltransferaza (New England Biolabs, Ipswich, MA, SUA) a fost folosit ca control pozitiv al metilarii, iar ADN-ul grupului de control normal a fost folosit ca control pozitiv al demetilării. În cele din urmă, gelul de agaroză a fost fotografiat și analizat printr-un sistem de imagistică pe gel Bio-Rad. -e nivelul de demetilare a fost calculat prin următoarea formulă:
Toți primerii proiectați în Methprimer (Applied Biosystems, MA, SUA) și sintetizați de Sangon Biotech (Shanghai, China) sunt enumerați în Tabelul 1.
2.10. Western Blot.
Proteinele au fost extrase din miocardul ventricularului stâng cu Ripa Buffffer (științific) și s-a adăugat inhibitor de protează. Concentrația de proteine a fost determinată prin metoda BCA (Solarbio, Beijing, China). Proteinele au fost luate la 50 ug și denaturate la 100 grade C timp de 5 minute. Proteinele au fost separate prin electroforeză pe gel de dodecil sulfat-poliacrilamidă de sodiu (SDS-PAGE, Beyotime, Shanghai, China) și apoi transferate pe o membrană de fluorură de poliviniliden (PVDF) cu un echipament electroforetic (Bio-Rad, CA, SUA). După ce au fost blocate cu 3% BSA timp de 2 ore la temperatura camerei, membranele au fost incubate cu anticorp anti-PI3K, anticorp antifosfo-PI3K, anticorp anti eNOS, anti-fosfo-eNOS (1:1000, Bioss, Beijing, China), anticorp anti-COX-2, anticorp anti-HMGB-1 (1: 1000, Proteintech, Chicago, IL, SUA) și anticorp anti-ECE{-1 (1: 2000, Signalway Antibody , College Park, MD, SUA), anticorpi primari peste noapte la 4 grade . A doua zi, după ce au fost spălate cu TBST de 3 ori, membranele au fost incubate cu IgG anti-iepure de capră marcate cu HRP (1: 25000, 1 oră, Zhongshanjinqiao, Shanghai, China) la temperatura camerei. După ce au fost spălate cu TBST de 3 ori, membranele au fost vizualizate cu ajutorul substratului de Western Blotting Pierce™ ECL și au fost fotografiate folosind sistemul de imagistică FluorChem E (Protein Simple, SUA), care au fost normalizate la actină ca control intern.
Beneficiul glicozidelor de feniletanoil din cistanche
cistanche beneficiu
3. Rezultate
3.1. CPhG-uri(Glicozide feniletanoil din cistanche) Funcția cardiacă îmbunătățită la șobolani după AAC.
-e șobolani au primit gavaj din ziua după AAC. -e grupului martor pozitiv (AV) i s-a administrat gavage cu valsartan 8,3 mg/kg/zi, iar grupului CPhGs (AC) i s-a administrat gavage cu CPhG 125, 250 și, respectiv, 500 mg/kg/zi. După șase săptămâni de dozare continuă, șobolanii au efectuat ecocardiografie sub anestezie cu pentobarbital de sodiu cu 2,5%. Doi șobolani au murit după AAC: unul din grupul model a murit în a treia zi după AAC din cauza edemului pulmonar; un altul în AC 500 mg/kg a murit a doua zi după intervenția chirurgicală suspectată a fi cauzată de stresul chirurgical. După cum se arată în Figura 2, în comparație cu grupul simulat, LVED, LVEF și LVFS în grupul AAC au scăzut semnificativ, dar LVPWT în grupul AAC a crescut semnificativ. Comparativ cu grupul AAC, LVED, LVEF și LVFS au fost crescute și LVPWT a scăzut în grade diferite în fiecare grup de doză AC; pentru LVPWT, o schimbare semnificativă nu a fost găsită în grupul AC 125 mg/kg, dar a fost găsită în grupurile AC 250 și 500 mg/kg. În comparație cu grupul AV, LVPWT și LVED în grupul AC 125 mg/kg au fost observate o diferență semnificativă, în timp ce LVPWT, LVED, LVFS și LVFS în grupurile AC 250 și 500 mg/kg nu au fost.
3.2. CPhG-uri(Glicozide feniletanoil din cistanche) Scăderea zonei HWI, CSAC și fibroză la șobolani după AAC.
-en am cântărit inima fiecărui șobolan pentru a calcula HWI și am luat țesutul miocardic pentru colorarea HE și Masson pentru a observa modificările ariei de secțiune transversală (CSAC) și ale zonei de fibroză în cardiomiocite. După cum se arată în figurile 3(a), 3(d) și 3(e), în comparație cu grupul simulat, greutatea inimii (HW) și HWI în grupul AAC au fost reduse semnificativ; comparativ cu grupul AAC, HW și HWI în grupurile AC250 și 500 mg/kg au fost reduse semnificativ; comparativ cu grupul AV, HW și HWI au crescut semnificativ în grupul AC 125 mg/kg, dar nu au fost în grupurile AC 250 și 500 mg/kg. În figurile 3(b) și 3(f), în comparație cu grupul simulat, rezultatele colorării Masson au arătat că zona de fibroză din grupul AAC a fost crescută semnificativ. Pentru zona de fibroză, s-a constatat o scădere semnificativă la grupurile cu AC 125, 250 și 500 mg/kg în comparație cu grupul AAC, în timp ce o creștere semnificativă a grupurilor AC 125 și 250 mg/kg și o scădere semnificativă a AC 500 mg/ kg au fost găsite în comparație cu grupul AV. În figurile 3(c) și 3(g), rezultatele colorării HE au arătat că CSAC în grupul AAC a fost crescut semnificativ în comparație cu cel din grupul simulat; comparativ cu grupul AAC, CSAC în grupurile AC 250 și 500 mg/kg a fost redus semnificativ; comparativ cu grupul AV, totuși, CSAC a crescut semnificativ în grupurile cu AC 125 și 250 mg/kg și nu s-a găsit nicio diferență semnificativă în grupul AC 500 mg/kg
3.3. CPhG-uri(Glicozide feniletanoil din cistanche) Niveluri reduse de ARNm ale genelor de hipertrofie miocardică în țesutul miocardic al șobolanilor după AAC.
ANP, BNP și lanțul greu de miozină (-MHC) sunt factori importanți de hipertrofie cardiacă [19, 20]. Am detectat nivelurile relative de expresie ale acestor trei gene de hipertrofie cardiacă în țesuturile miocardice. După cum se arată în Figura 4, în comparație cu grupul simulat, nivelurile relative de expresie ale ARNm de ANP, BNP și -MHC în grupul AAC au crescut semnificativ; totuși, în comparație cu grupul AAC, nivelurile relative de expresie ale celor trei gene de hipertrofie miocardică în AC 250 Medicina complementară și alternativă bazată pe dovezi 5.
