Partea Ⅱ Deficiența Smad3 îmbunătățește terapia bazată pe insuliță pentru diabet și leziuni renale diabetice prin promovarea proliferării celulare prin mecanismul dependent de E2F3-
May 25, 2023
Metode
1. Animale
Șoarecii Smad3-null (Smad3KO) sunt un cadou bun de la Prof. Chuxia Deng și menținuți în heterozigoți (Smad3 plus /- ) în fundal C57BL/6 [20]. Șoarecii Smad3KO au fost generați prin încrucișarea șoarecilor Smad3 plus/-. Șoarecii db/db cu mutația Lepr (receptor de leptină) în fundal C57BLKS au fost achiziționați de la Centrul Experimental Animal al Universității Chineze din Hong Kong (CUHK). Toate animalele au fost menținute într-o unitate specifică fără agenți patogeni (SPF) cu acces liber la hrană și apă la un ciclu zi/noapte de 12/12 ore. Toate manipulările animalelor din acest studiu au fost efectuate urmând reglementările și aprobate de Comitetul de etică al experimentelor pe animale al CUHK cu Ref. Nu. 18-177-MIS.
2. Model de șoarece diabetic indus de streptozocină (STZ).
Șoarecii masculi C57BL/6 la vârsta de 8-10 săptămâni au fost injectați intraperitoneal cu 50 mg/kg/zi STZ zilnic timp de 5 zile continue. La 5 zile după injecția finală STZ, șoarecii cu o glicemie stabilă aleatorie de mai mult de 16 mM timp de 2 zile consecutive au fost considerați ca stabilirea cu succes a diabetului și utilizați ca șoareci primitori pentru transplantul de insuliță.
3. Izolarea insulelor, transplantul și evaluarea fenotipului diabetic
Insulele au fost izolate de la șoareci masculi sau femele Smad3 knockout (KO) sau de tip sălbatic (WT) la vârsta de 8-10 săptămâni, așa cum a fost descris anterior [21]. Pentru a efectua transplantul de insuliță, a indicat că mai multe insulițe au fost transplantate sub capsula renală a șoarecilor masculi db/db la vârsta de săptămâna 4 sau șoareci diabetici induși de STZ în ziua 7 după injecția finală STZ, urmând protocolul descris de Szot și colab. 22]. Pe scurt, șoarecele destinatar a fost anesteziat prin anestezie Combo (1,5% ketamina și 0,15% xilazină, 6 μL/g greutate corporală). După pierderea cunoștinței s-a făcut o incizie de 1 cm pe pielea care acoperă rinichiul stâng. Scoateți ușor rinichiul și mențineți-l umed cu soluție salină sterilă în timpul intervenției chirurgicale. Cu un ac de 25G, faceți o mică zgârietură pe capsulă pentru a crea o tăietură. Numărul indicat de insulițe au fost introduse în capsula renală printr-un tub PE50. La urma urmei, insulele au fost transplantate, sigilați poreca prin cauterizare cu căldură scăzută. Înlocuiți rinichiul și închideți peritoneul cu suturi. Sigilați pielea cu capse. 100 μL soluție de penicilină-streptomicină (Gibco, cat # 15140122, SUA) a fost injectată intraperitoneal pentru a preveni infecția. 100 μL Tegmic a fost injectat intramuscular pentru a calma durerea. Animalul a fost plasat într-un mediu cald până la recuperarea completă. Aceeași procedură de operare a fost efectuată și la șoarecii de control simulat, dar fără infuzie de insuliță. Atât nivelurile aleatoare de glucoză din sânge, cât și cele de 6 ore (RBG și FBG) ale sângelui din vârful cozii au fost verificate săptămânal cu un glucometru portabil (Roche, ACCU-CHEK® Performa). Testul de rezistență la insulină (IPITT), testul de toleranță la glucoză (IPGTT), nivelurile de HbA1c și insulină serică au fost măsurate așa cum a fost descris anterior [9].
Click aici pentru a obținebeneficiile Cistanche
4. Proteine urinare totale și creatinina serică
Urina de 24 de ore a fost colectată într-o cușcă metabolică. Proteina urinară totală de 24 de ore a fost calculată prin înmulțirea volumului de urină și a concentrației de proteină urinară, care a fost cuantificată cu Quick Start Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, cat # 5000201, SUA). Creatinina serică a fost determinată cu trusa de cuantificare a creatininei (Stanbio Laboratory, cat# 0430-120, SUA).
5. Histopatologie
Modificările histopatologice renale au fost examinate în secțiuni fixate cu paraformaldehidă, încorporate în parafină (4 µm) cu reactiv Periodic Acid-Schiff (PAS) așa cum a fost descris anterior [23]. Expansiunea matricei mezangiale a fost marcată utilizând programul de imagine cantitativă (Image-Pro Plus 7.0, Media Cybernetics), așa cum a fost descris anterior [23].
6. Imunohistochimie
Rinichiul sau pancreasul care poartă insulițe au fost fixați în paraformaldehidă 4%, încorporați în parafină și secționați la 4 μm. După rehidratare, secțiunile au fost tratate cu recuperarea antigenului mediată de microunde în 0.{01 M citrat (pH 6.{0) timp de 10 minute și blocare în 5% BSA timp de 1 oră . Incubarea anticorpilor primari a fost efectuată peste noapte la 4 grade. Pentru colorarea fluorescentă, un anticorp secundar fluorescent a fost aplicat la temperatura camerei (RT) timp de 1 oră. Pentru termogeneza mediată de DAB, a fost inclusă o etapă suplimentară de blocare a H2O2 de 3% timp de 15 minute înainte de extragerea antigenului. După incubarea anticorpului primar, sa adăugat polimer conjugat cu HRP (Envision plus System, Dako, SUA). Pentru colorarea E2F3, extragerea antigenului a fost efectuată în soluție EDTA-Tris (pH 9,0). Anticorpii utilizați în imunohistochimie au fost detaliați în Tabelul S2. Zona pozitivă pentru colorare a fost cuantificată cu software-ul Image J (v1.47, NIH, SUA).
Extract de Cistanche
7. Măsurarea masei celulare grefate în rinichiul purtător de insulițe
Un indice al suprafeței medii a celulei pe secțiune a fost utilizat pentru a cuantifica semi-cantitativ masa celulară din grefa de insuliță. Pe scurt, rinichiul purtător de insulițe (inclus în parafină) a fost secționat succesiv la 4 μm de-a lungul axei sagitale. Secțiunile continue la intervale de 160 μm au fost colorate imuno fluorescent pentru insulină. Cel puțin 6 secțiuni cu colorare pozitivă pentru insulină au fost utilizate pentru calcularea ariei celulare pe secțiune la fiecare șoarece. Suprafața celulelor pozitive pentru insulină din fiecare secțiune a fost cuantificată cu software-ul Image J (v1.47, NIH, SUA). Indicele suprafeței medii de celule pe secțiune la fiecare șoarece a fost calculat prin împărțirea suprafeței totale pentru insulină pozitivă în toate secțiunile la numărul de secțiuni pozitive pentru insulină.
8. Cultura primară de celule insulare
Insulele izolate au fost disociate în celule unice și însămânțate în 96-placa de godeuri în 200 μL de RPMI 1640 (Gibco, SUA) plus 10% FBS (Gibco, SUA) plus 1% penicilină-streptomicina (Gibco, SUA) suplimentat cu glucoză 20 mM. Celulele insulare au fost cultivate pentru timpul indicat într-un incubator setat la 37 de grade, 5% CO2 și 100% umiditate. Pentru distrugerea E2F3 mediată de adenovirus, celulele insulare disociate au fost cultivate într-un mediu care conține adenovirus care supraexprimă ARN scurt în ac de păr (shRNA) care vizează șoarecele E2F3 (shE2F3) sau shRNA nespecific de control (prezentat) la un titru de 10 pfu per celulă timp de 2 zile urmate de înlocuire medie. Secvența tulpină a duplexului shE2F3 a fost 5'-CATCCATGCTCTATTCTGT-3'. Celulele dispersate din 50 de insulițe au fost însămânțate per godeu pentru imunocolorare și RT-PCR și 100 de insule pe godeu pentru Western blot, care au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [9].
9. Etichetarea BrdU in vivo și in vitro
Pentru a efectua marcarea BrdU in vivo, șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu 50 mg/kg/zi BrdU (în PBS) timp de 7 zile din a 2-a zi după transplantul de insuliță și sacrificați la 2 ore după ultima injecție. Pentru marcarea BrdU in vitro, celulele insulare dispersate au fost cultivate timp de 48 de ore, urmate de înlocuire cu mediu proaspăt care conține 10 μM BrdU și cultivate pentru încă 24 de ore. Imunocolorarea fluorescentă împotriva BrdU în țesuturi și celulele cultivate a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [9].
Pudra de Cistanche
10. ARN-Seq
Insulele au fost izolate de la șoareci Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT-db/m și Smad3KO-db/m. Pentru fiecare genotip, insulițele de la mai mult de 5 șoareci au fost reunite pentru izolarea ARN. ARN a fost preparat cu miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Germania). ARN-seq și analiza datelor din aval au fost descrise anterior [9]. Nivelul de expresie al unei anumite gene a fost prezentat ca fragmente pe kilobază de transcriere per milion de citiri mapate (FPKM). Gena exprimată diferențial (DEG) a fost definită ca o variație mai mare sau egală cu 2 ori a FPKM între două grupuri. DEG-urile reglate în sus și în jos au fost combinate și utilizate pentru analiza de îmbogățire a căilor de Ontologia genelor (GO) și Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) cu resursele online de bioinformatică DAVID (v6.8) cu setări implicite. Subcategoria GOTERM_BP{_DIRECT a fost utilizată pentru analiza GO.
11. Imunoprecipitații
Pentru a efectua imunoprecipitarea în insulițele de șoarece, aproximativ 500 de insulițe proaspăt izolate au fost lizate în 500 mL de tampon RIPA. Un anticorp de iepure anti-Smad3 (2 ug) sau izotipul IgG de iepure a fost adăugat și incubat la 4 grade peste noapte cu rotație ușoară. Apoi, s-au adăugat 20 μL de perle de agaroză de proteină A (Beyotime, cat # P2051, China) și s-au incubat timp de 2 ore la 4 grade. După spălarea puternică cu tampon RIPA proaspăt, proteina legată a fost eliberată prin denaturare în tampon de încărcare 1xSDS și supusă analizei Western blot. Pentru a evita influența lanțului greu al IgG, a fost utilizată o IgG anti-iepure de șoarece specifică lanțului ușor (conjugat cu HRP, Abmart, cat # M21006, China) pentru a recunoaște proteina Smad3 precipitată.
12. Imunoprecipitarea cromatinei-ChIP
Pentru a efectua ChIP în insulițele de șoarece, aproximativ 2000 de insulițe au fost colectate de la șoareci C57BL/6 de 8-10 săptămâni și utilizate ca un singur preparat ChIP. Insulele proaspăt izolate au fost stimulate cu 10 ng/mL TGF- 1 (Gibco, SUA) timp de 15 minute în RPMI 1640 plus 1% FBS plus 1% Penicilină-streptomicina. ChIP a fost efectuat cu Kitul IP SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin (CST, SUA) urmând instrucțiunile recomandate. Anticorpii și primerii utilizați în testul ChIP sunt detaliați în Tabelul S1 și S2.
Cistanche standardizate
13. Testul dual-luciferaze reporter
Promotorul E2F3 de șoarece (-1000 la plus 451 bp) a fost donat în vectorul de bază pGL{3-(pGL3-E2F3.Pro). Concomitent, a fost efectuată mutația punctuală a site-ului de legare Smad3 pentru a genera pGL3- E2F3.Pro. Mut. Pentru a efectua testul de raportare cu luciferază duală, celulele HEK293T au fost însămânțate în placa de godeuri 24-la o densitate de 5 x 104 celule/godeu. A doua zi, celulele au fost transfectate cu 500 ng pGL3-Basic sau pGL3-E2F3.pro sau pGL{3-E2F3.pro.mut combinat cu pcDNA3.1-Smad3, care supraexprimă Smad3 de șoarece sau nu (după cum este indicat în Figura 10F) prin metoda fosfatului de calciu. Vectorul pEGFP-C1 a fost suplimentat pentru a echilibra doza de transfecție în fiecare tratament. 10 ng de vector pGL4.73.huc/SV40 care exprimă renilla luciferaza au fost incluse în fiecare tratament pentru a normaliza eficiența transfecției. 6 ore după transfecție, mediul a fost schimbat urmat de incubare pentru încă 48 de ore. Celulele au fost lizate, iar activitatea luciferazei a fost determinată cu Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, SUA) și cuantificată într-un luminometru (VICTORTM X4 2030 Multilabel Reader, PerkinElmer, SUA). Activitatea transcripțională a promotorului E2F3 donat a fost prezentată ca raportul valoric al luciferazei de licurici la luciferaza renilla. Fiecare tratament a fost efectuat în trei exemplare.
14. Statistici
Datele au fost prezentate ca medie ± SD și analizate cu software-ul SPSS (16.0). Normalitatea datelor a fost verificată prin testul One-Sample Kolmogorov-Smirnov. Omogenitatea variațiilor între grupuri a fost testată prin statistica Levene. Pentru compararea între cele două grupuri, a fost folosit testul t Student. Pentru compararea între mai multe grupuri, a fost utilizată ANOVA unidirecțională cu un test LSD dacă s-a presupus o varianță egală. Pentru o varianță egală care nu a fost presupusă, a fost utilizată o statistică alternativă a testului Welch, urmată de comparații multiple cu testul T2 al lui Tamhane. P < 0.05 a fost considerat semnificativ statistic.
Suplimente de Cistanche
Concluzii
Deficiența Smad3 îmbunătățește în mare măsură terapia de înlocuire a insulelor atât pentru T1DM, cât și pentru T2DM și protejează împotriva leziunilor renale diabetice. Proliferarea celulară îmbunătățită dependentă de E2F3-poate fi un mecanism cheie al terapiei cu insulițe Smad3KO atât în T1DM, cât și în T2DM. Astfel, terapia de înlocuire a celulelor Smad3KO poate fi o strategie terapeutică mai bună pentru diabet din punct de vedere clinic.
Referințe
1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nat Rev Endocrinol. 2017; 13: 268-77.
2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Diferențierea celulelor stem pluripotente umane la celulele pancreatice funcționale pentru terapiile diabetului: inovații, provocări și direcții viitoare. J Biol Ing. 2017; 11:21.
3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S și colab. Evaluarea histologică a grefei după transplantul clinic de insulă. Transplantul. 2009; 88: 1286-93.
4. Lan HY. Roluri diverse ale TGF-beta/Smads în fibroza renală și inflamație. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.
5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. Semnalizarea TGF-beta/Smad în fibroza renală. Front Physiol. 2015; 6:82.
6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K și colab. O rețea de semnalizare smad reglează proliferarea celulelor insulare. Diabet. 2014; 63: 224-36.
7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. Inhibarea semnalizării TGF-beta promovează replicarea celulelor beta-beta pancreatice umane. Diabet. 2016; 65: 1208-18.
8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V, et al. Inhibarea combinată a căilor DYRK1A, SMAD și Tritorax se sinergizează pentru a induce replicarea robustă în celulele beta umane adulte. Cell Metab. 2019; 29: 638-52 e5.
9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH și colab. Deficiența Smad3 promovează proliferarea și funcționarea celulelor beta la șoarecii db/db prin restabilirea expresiei Pax6. Teranostice. 2021; 11: 2845-59.
10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. O metodă pentru izolarea insulelor murine și transplantul de rinichi subcapsular. J Vis Exp. 2011.
11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH și colab. Transplantul de izogrefă insulară îmbunătățește sensibilitatea la insulină într-un model murin de diabet de tip 2. Endocrin. 2021; 72: 660-71.
12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. Inducerea p16ink4a și p19ARF de către TGFbeta1 contribuie la stoparea creșterii și răspunsul la senescență în keratinocitele de șoarece. Mol Carcinog. 2009; 48: 181-6.
13. Dyer MA, Cepko CL. Reglarea proliferării în timpul dezvoltării retinei. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.
14. Dyson N. Reglarea E2F de către proteinele din familia pRB. Genes Dev. 1998; 12: 2245-62.
15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Suprimarea tranzitorie a semnalizării receptorului TGFbeta facilitează transplantul de insulă umană. Endocrinologie. 2016; 157: 1348-56.
16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Perturbarea SMAD2 în celulele beta pancreatice de șoarece duce la hiperplazia insulelor și secreția de insulină afectată datorită atenuării activității canalului K plus sensibil la ATP. Diabetologia. 2014; 57: 157-66.
17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P și colab. Supraexprimarea E2F3 promovează proliferarea celulelor beta umane funcționale fără inducerea apoptozei. Ciclul celulei. 2013; 12: 2691-702.
18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. Semnalizarea familiei TGF-beta în controlul proliferării și supraviețuirii celulare. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9.
19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Diabetul zaharat--progresează și provoacă în proliferarea celulelor beta umane. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11: 201-12.
20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H și colab. Întreruperea țintită a SMAD3 are ca rezultat afectarea imunității mucoasei și reducerea răspunsului celulelor T la TGF-beta. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.
21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Un protocol pentru izolarea insulelor din pancreasul de șoarece. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.
22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Transplantul de insulițe pancreatice în capsula renală a șoarecilor diabetici. J Vis Exp. 2007: 404.
23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q și colab. Eliminarea Smad3 previne fibroza renală și inflamația în nefropatia diabetică de tip 2. Metabolism. 2020; 103: 154013.
Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 și Hui-Yao Lan2,7
1 Centrul de Cercetare pentru Medicină Integrată și Departamentul de Nefrologie, Spitalul Afiliat de Medicină Tradițională Chineză din Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, China.
2. Departamentul de Medicină și Terapeutică și Institutul de Științe ale Sănătății Li Ka Shing, Universitatea Chineză din Hong Kong, Hong Kong, 999077, China.
3. Laboratorul comun Guangdong-Hong Kong pentru bolile imunologice și genetice ale rinichilor, Spitalul Popular Provincial Guangdong, Academia de Științe Medicale din Guangdong, Guangzhou, Guangdong, 510080, China.
4. Laboratorul cheie de bioelectronică de stat, Laboratorul cheie pentru biomateriale și dispozitive Jiangsu, Școala de Științe Biologice și Inginerie Medicală, Universitatea de Sud-Est, Nanjing, China.
5. Laboratorul cheie de prevenire și management al bolii cronice de rinichi din orașul Zhanjiang, Institutul de Nefrologie, Spitalul afiliat al Universității Medicale Guangdong, Zhanjiang, Guangdong, 524001, China.
6. Baza Națională de Cercetare Clinică de Medicină Tradițională Chineză, Spitalul afiliat de Medicină Tradițională Chineză din Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, China.
7. CUHK-Guangdong Provincial People's Hospital Laboratorul comun de cercetare privind bolile imunologice și genetice ale rinichilor, Universitatea Chineză din Hong Kong, Hong Kong, 999077, China.
