Partea Ⅰ Deficiența Smad3 îmbunătățește terapia bazată pe insuliță pentru diabet și leziuni renale diabetice prin promovarea proliferării celulare prin mecanismul dependent de E2F3-
May 25, 2023
Abstract
1. Motivație
Proliferarea slabă a celulelor este unul dintre factorii nocivi care împiedică terapia de înlocuire a celulelor insulare pentru pacienții cu diabet. Smad3 este un factor transcripțional important al semnalizării TGF și s-a demonstrat că promovează diabetul prin inhibarea proliferării celulare. Prin urmare, emitem ipoteza că insulele cu deficit de Smad3-ar putea fi o terapie nouă de înlocuire a celulelor pentru diabet.
2. Metode
Am examinat această ipoteză la șoareci cu diabet zaharat de tip-1 indus de streptozocină și șoareci cu diabet zaharat de tip-2 db/db prin transplantarea insulelor Smad3 knockout (KO) și, respectiv, de tip sălbatic (WT) sub capsula renală. Au fost examinate efectele terapiei de înlocuire a insulelor Smad3KO față de WT asupra diabetului zaharat și a leziunii renale diabetice. În plus, ARN-seq a fost aplicat pentru a identifica gena țintă din aval care stă la baza proliferării celulare reglate Smad3-în insulele de șoarece Smad3KO-db/db față de Smad3WT-db/db.
3. Rezultate
În comparație cu terapia cu insulițe Smad3WT, tratamentul cu insulițe Smad3KO a produs un efect terapeutic mult mai bun asupra diabetului de tip-1 și tip{-2 prin scăderea semnificativă a nivelului seric de glucoză din sânge și HbA1c și protejarea împotriva leziunilor renale diabetice prin prevenirea o creștere a creatininei serice și dezvoltarea proteinuriei, extinderea matricei mezangiale și fibroză. Acestea au fost asociate cu o creștere semnificativă a proliferării celulelor grefate și a nivelului de insulină din sânge, rezultând o intoleranță îmbunătățită la glucoză. Din punct de vedere mecanic, ARN-seq a dezvăluit că, în comparație cu insulele de șoarece Smad3WT-db/db, ștergerea Smad3 din insulele de șoarece db/db a reglat în mod semnificativ E2F3, un regulator esențial al intrării ciclului celular G1/S. Studii ulterioare au descoperit că Smad3 s-ar putea lega de promotorul E2F3 și, astfel, ar putea inhiba proliferarea celulară printr-un mecanism dependent de E2F3-, deoarece tăcere E2F3 a abrogat efectul proliferativ asupra celulelor Smad3KO.
4. Concluzie
Terapia de înlocuire a insulelor cu deficit de smad3-poate îmbunătăți semnificativ atât diabetul de tip-1, cât și diabetul de-2 tip și poate proteja împotriva leziunilor renale diabetice, care este mediată de un nou mecanism dependent de E2F3- proliferarea celulară.
Cuvinte cheie
Smad3, transplant de insuliță, diabet, E2F3, ciclu celular.
Click aici pentru a obțineBeneficii Cistanche
Introducere
diabet zaharat de tip-1 și 2 (DM1 și DZ2). transplantul de celule sau insuliță este o terapie atractivă și a fost aplicată cu succes la pacienții cu DZ1. Insulele sau celulele utilizate pentru transplant sunt de obicei de la donatorul cadaveric sau celulele stem pluripotente induse (iPSC) [1, 2]. Peste 1500 de cazuri de transplant clinic de insuliță au fost finalizate la pacienții cu DZ1 în urma protocolului Edmonton bine stabilit [1]. Deși aproximativ 50% dintre pacienți dețin independență de insulină timp de 5 ani după transplant, eșecul grefei este o preocupare comună din punct de vedere clinic. Unul dintre factorii care împiedică transplantul insulelor este rata proliferativă extrem de scăzută a celulelor insulelor grefate [3]. În plus, stimulii periculoși din micromediul grefei, cum ar fi inflamația, respingerea alogrefei imune și stresul metabolic, pot determina celulele transplantate să sufere apoptoză și necroză, ducând la pierderea progresivă a grefei [1]. Prin urmare, îmbunătățirea proliferării celulelor transplantate este esențială pentru succesul tratamentului pe bază de transplant de insuliță pentru diabet.
Semnalizarea factorului de creștere transformator-beta (TGF-) joacă roluri pleiotrope în multe procese biologice. Transducția semnalului inițiază prin legarea ligandului TGF la receptorul său de tip 2 TGFBR2. Acesta din urmă recrutează și activează receptorul de tip 1 TGFBR1 prin fosforilare. TGFBR1 activat fosforilează în continuare proteinele Smad reglate de receptor (R-Smads), Smad2 și Smad3. R-Smads formează un complex cu Smad4, care se translocă în nucleu pentru a regla transcripțional genele țintă [4, 5]. Se raportează că insula pancreatică menține semnalizarea TGF activată universal, așa cum este relevat de un nivel relativ ridicat de Smad2/3 fosforilat în condițiile fiziologice. Cu toate acestea, ca răspuns la cererea de insulină, activitatea de semnalizare a TGF este scăzută, însoțită de creșterea proliferării celulare [6]. În plus, inhibarea farmacologică a semnalizării TGF promovează proliferarea celulară in vitro și in vivo [7, 8]. Mai important, ștergerea Smad3 are ca rezultat o proliferare celulară mai robustă în comparație cu ștergerea Smad2 la șoarecii cu pancreatectomie parțială, ceea ce indică faptul că Smad3, dar nu Smad2, este efectorul primar în aval de semnalizarea TGF pentru a regla proliferarea celulară [6]. Studiile ulterioare arată că Smad3 suprimă proliferarea celulară prin inducerea expresiei inhibitorilor kinazei dependenți de ciclină (CDKI), inclusiv p16, p21 și p57 [7, 8].
Lucrările noastre recente au constatat, de asemenea, că ștergerea Smad3 la șoarecii db/db (Smad3KO-db/db) previne apariția diabetului zaharat fără obezitate, hiperglicemie, rezistență la insulină și intoleranță la glucoză. Interesant este că șoarecii Smad3KO-db/db prezintă hiperplazie a insulelor cu proliferare celulară crescută semnificativ și hiperinsulinemie persistentă [9]. Acest lucru implică faptul că Smad3 este patogen în diabet și țintirea Smad3 în celule poate reprezenta o nouă terapie de înlocuire a celulelor sau a insulelor pentru diabet. Acest lucru a fost examinat în prezentul studiu prin utilizarea transplantului de insuliță Smad3 knockout (Smad3KO) la șoareci cu diabet zaharat de tip-1 indus de streptozocină (STZ) și la șoareci cu diabet zaharat de tip-2 db/db.
Suplimente de Cistanche
Rezultate
1. Transplantul de insuliță Smad3KO a produs un efect terapeutic mai bun asupra diabetului de tip-1 indus de STZ
Pentru a compara eficacitatea terapeutică a insulei Smad3KO față de Smad3WT pe diabet, am efectuat mai întâi transplantul de insuliță singeneică sub capsula renală a șoarecilor diabetici induși de STZ, unde hiperglicemia este cauzată de deficiența celulară. Șoarecii diabetici în ziua 7 după injectarea STZ au fost transplantați cu 3 doze de insulițe (50, 100 și 200 de insulițe per șoarece) care au fost proaspăt izolați de la șoareci Smad3WT sau Smad3KO. Atât nivelurile aleatoare ale glicemiei (RBG) cât și ale glicemiei a jeun (FBG) au fost monitorizate săptămânal timp de 16 săptămâni. Dozele de transplant au fost selectate pe baza constatărilor anterioare conform cărora transplantul a 300 de insulițe este suficient pentru a restabili rapid euglicemia la șoarecii sărăciți de celule [10]. După cum se arată în figurile 1A la D, șoarecii diabetici cu operație simulată au dezvoltat hiperglicemie persistentă timp de 16 săptămâni. Transplantul cu o doză mică (50 de insulițe) de insulițe Smad3KO sau WT nu a reușit să reducă atât nivelurile de RBG, cât și de FBG. Cu toate acestea, șoarecii diabetici care au primit 100 de insulițe Smad3KO, dar nu aceeași doză de insulițe Smad3WT, au recuperat treptat RBG și FBG normale similare celor care au primit 200 de insulițe Smad3KO sau WT. De asemenea, am constatat că efectul de scădere a glucozei din sânge este atribuit exclusiv insulelor transplantate, deoarece hiperglicemia a recidivat imediat odată ce rinichiul purtător de insuliță a fost îndepărtat începând cu 16 săptămâni (săgeata, Figura 1A).
Toleranța afectată la glucoză a fost dezvoltată și la șoarecii diabetici operați de simulare, care a fost ameliorată semnificativ prin transplantarea dozei mari (200) de insulițe Smad3KO sau WT și a 100 de insulițe Smad3KO, dar nu prin doza mică de 50 de insulițe Smad3KO sau WT și 100. Insulițe Smad3WT (Figura 1E și G). După cum era de așteptat, șoarecii diabetici induși de STZ nu au dezvoltat rezistență la insulină.
În schimb, răspunsul prelungit la insulină a fost observat la șoarecii hiperglicemici cu operație simulată sau terapie ineficientă cu 50 de insulițe Smad3WT sau KO și 100 de insulițe Smad3WT (Figura 1F și H). În conformitate cu euglicemia recuperată și intoleranța îmbunătățită la glucoză, șoarecii diabetici cărora li s-au administrat 200 de insulițe Smad3KO sau WT și 100 de insulițe Smad3KO sau WT, dar nu 50 de insulițe Smad3KO sau WT și 100 de insulițe Smad3WT, au prezentat o scădere a nivelului de HbA1c în sânge însoțită de creșterea nivelului de HbA1c în sânge. și J). În plus, diabetul indus de STZ a cauzat întârzierea creșterii, care a fost parțial recuperată la șoarecii transplantați cu 200 de insulițe Smad3KO sau WT și 100 de insulițe Smad3KO (Figura S1). În plus, șoarecii diabetici induși de STZ au dezvoltat, de asemenea, nefropatie diabetică la 16 săptămâni, așa cum s-a demonstrat prin expansiunea mezangială, fibroză interstițială, proteinurie și creatinina serică crescută (Figura 2). În mod intrigant, tratamentul cu 100 de insulițe Smad3KO, dar nu 100 de insulițe Smad3WT, a dus la protecție împotriva dezvoltării bolii renale diabetice, deși acest lucru a fost notabil și la șoarecii diabetici tratați cu doza mare de 200 de insulițe Smad3KO sau WT (Figura 2). Aceste descoperiri demonstrează o eficacitate terapeutică mai bună a insulițelor Smad3KO pe diabetul indus de STZ și sugerează o reducere cu aproximativ 50% a insulelor necesare pentru a obține un control glicemic competent și o protecție împotriva leziunilor renale diabetice prin utilizarea terapiei de înlocuire a insulelor cu deficit de Smad3- Diabet.
2. Transplantul de insuliță Smad3KO a produs un efect terapeutic mai bun asupra diabetului de tip-2 la șoarecii db/db
S-a raportat că transplantul de insuliță îmbunătățește T2DM într-un model de șoarece alimentat cu dietă bogată în grăsimi provocat cu o doză mică de STZ [11]. Apoi am investigat dacă transplantul de insulițe Smad3KO produce, de asemenea, un efect terapeutic mai bun asupra T2DM prin tratarea șoarecilor db/db cu 250 de insulițe Smad3KO sau WT de la vârsta pre-diabetică din săptămâna 4 până la săptămâna 12. Am descoperit că transplantul fie cu Smad3KO, fie cu WT. insulele nu au influențat creșterea șoarecilor receptori db/db (Figura S2). Deși șoarecii db/db care au primit transplant de insuliță Smad3WT au arătat o tendință de scădere a RBG și FBG în comparație cu șoarecii db/db operați de simulare, șoarecii db/db transplantați cu doza echivalentă de insulițe Smad3KO au prezentat o scădere semnificativă a RBG și FBG (Figura 3A și B). Intoleranța la glucoză dezvoltată la șoarecii db/db a fost îmbunătățită semnificativ prin transplantul de insuliță Smad3KO, dar nu și Smad3WT, deși rezistența la insulină nu a fost modificată (Figura 3C-F). În mod constant, în comparație cu transplantul de insuliță Smad3WT sau operația simulată, șoarecii db/db tratați cu transplant de insuliță Smad3KO au prezentat, de asemenea, o scădere semnificativă a nivelurilor de HbA1c din sânge, care a fost însoțită de o creștere notabilă a nivelurilor de insulină din sânge (Figura 3G și H). În plus, tratamentul cu 250 de insulițe Smad3KO a atenuat semnificativ expansiunea mezangială glomerulară (Figura 4). Cu toate acestea, deoarece nu au fost evidențiate modificări semnificative ale creatininei serice, proteinuriei și fibrozei renale la șoarecii db/db la vârsta de 12 săptămâni, nu s-au găsit modificări evidente ale acestor parametri la șoarecii db/db tratați cu insulițe Smad3KO sau WT (Figura 4). Colectiv, aceste date indică din nou că transplantul de insulițe Smad3KO produce un tratament mai bun față de insulițele Smad3WT la șoarecii cu diabet de tip-2 db/db.
3. Deficiența Smad3 promovează proliferarea celulară în insulele grefate atât la șoarecii diabetici induși de STZ, cât și la șoarecii db/db.
Apoi am investigat mecanismele potențiale prin care transplantul de insulițe Smad3KO produce un efect terapeutic mai bun atât asupra T1DM, cât și asupra T2DM. Am examinat mai întâi masa celulară din insulele grefate prin imunocolorare cu insulină. În diabetul indus de STZ, nu am reușit să detectăm existența celulelor pozitive pentru insulină sub capsula renală la șoarecii grefați cu 50 de insulițe Smad3KO sau WT în săptămâna 16 după transplant, indicând pierderea celulelor. În mod neașteptat, șoarecii diabetici care au primit 100 de insulițe Smad3WT au prezentat doar câteva grupuri de celule producătoare de insulină dispersate, dar acest lucru a fost în mare măsură crescut la șoarecii diabetici tratați cu 100 de insulițe Smad3KO, ducând la o creștere de aproape 17-ori a masei celulare (Figura 5A și B). Interesant, șoarecii diabetici cărora li sa administrat o doză mare de 200 de insulițe Smad3KO sau WT au prezentat o masă celulară similară (Figurile 5A și B). Aceste constatări au fost în concordanță cu efectul dependent de doză al transplantului de insuliță asupra hiperglicemiei, așa cum se arată în figurile 1A și B.
Apoi am investigat dacă creșterea masei celulare în grefele de insuliță Smad3KO este asociată cu proliferarea celulară îmbunătățită. Imunofluorescența în două culori a arătat că în săptămâna 16 după transplantul de insuliță, șoarecii tratați cu 100 de insulițe Smad3WT au prezentat PCNA nedetectabile sau rare, plus insulină plus celule, care a fost crescută în principal la cei care au primit 100 de insulițe Smad3KO sau o doză mare de 200 de Smad3KO sau Smad. insulițe (Figura 5C și D). Apoi am investigat dacă Smad3 controlează proliferarea celulară timpurie în insulele grefate în condiții de diabet zaharat progresiv prin etichetarea BrdU în ziua 7 post-transplant de insuliță, când nivelurile de glucoză din sânge au rămas ridicate. Etichetarea BrdU a evidențiat o creștere de 3-ori a BrdU plus insulină plus celule la 100 de grefe de insuliță Smad3KO în comparație cu aceeași doză de grefe de insuliță Smad3WT (Figura 5E și F). Această constatare indică faptul că deficitul de Smad3 promovează în mare măsură proliferarea celulară prin ciclul celular în faza S în condiții de hiperglicemie, contribuind la o creștere de 17-ori a masei celulare, așa cum s-a observat în săptămâna 16 după transplantul insulei (Figura 5A și B) . Luate împreună, toate aceste descoperiri sugerează că deficitul de Smad3 promovează în mare măsură proliferarea celulară, restabilind astfel euglicemia în diabetul de tip-1 indus de STZ.
În mod similar, au fost detectate activități de proliferare celulară ridicată și în grefele de insuliță Smad3KO la șoarecii db/db diabetici de tip-2, așa cum se arată printr-o creștere de 5-ori a masei celulare în comparație cu cei cu grefe de insuliță Smad3WT la nivelul vârsta de 12 săptămâni după transplantul de insuliță (Figura 6A și B), care a fost asociat cu o creștere de 2,5-ori a insulinei plus PCNA plus celule (Figura 6C și D). Folosind marcarea cu BrdU, am detectat, de asemenea, o creștere de 3-ori a insulinei plus celulele BrdU plus în grefele de insuliță Smad3KO în ziua 7 după transplant la șoareci db/db de 12-săptămâni (Figura 6E și F). Această descoperire confirmă din nou că celulele lipsite de Smad3 sunt rezistente la hiperglicemie și rămân foarte proliferative pentru a menține masa celulară pentru a îmbunătăți T2DM.
4. Deficiența de Smad3 promovează proliferarea celulară in vitro
S-a raportat că inhibarea farmacologică a TGFBR1 promovează proliferarea celulară in vitro [7, 8]. Prin urmare, am investigat dacă ștergerea genetică a Smad3 promovează și proliferarea celulară prin cultivarea celulelor insulare Smad3KO și WT, urmată de etichetarea BrdU. Imunofluorescența dublă a arătat că celulele insulare lipsite de Smad3 au prezentat un nivel semnificativ mai mare de celule BrdU-pozitive (5,7 la sută) în comparație cu celulele insulare Smad3WT (2,4 la sută) (Figura 7A și B). Proliferarea crescută a celulelor Smad3KO a fost demonstrată, de asemenea, prin exprimarea crescută a PCNA, așa cum a evidențiat analiza Western blot (Figura 7C), confirmând rolul cheie de reglementare al Smad3 în proliferarea celulară.
5. ARN-seq identifică E2F3 ca o genă țintă Smad3 care reglează proliferarea celulară
Pentru a descoperi mecanismul din aval al Smad3 în reglarea proliferării celulare, am efectuat ARN-seq în insulițe izolate de la șoareci db/m sau db/db cu sau fără ștergerea genei Smad3, inclusiv Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT -db/m și șoarecii Smad3KO-db/m așa cum a fost descris anterior [9]. Analiza de îmbogățire a căilor a fost efectuată între genele exprimate diferențial (DEG) între insulele Smad3WT și Smad3KO în fundal db/m sau db/db. În fundalul genetic al db/db, Smad3KO a dus la modificări substanțiale ale genelor sau căilor legate de ciclul celular, așa cum au arătat analiza GO și KEGG (Figura 8A și Figura S3). Având în vedere genele individuale, analiza ARN-seq a dezvăluit o creștere a expresiei genelor care implică ciclina, kinazele dependente de ciclină (CDK) și familia de proteine ciclului de diviziune celulară (CDC) în insulele Smad3KO-db/db, comparativ cu Smad3WT-db. insulițe /db, care a fost validată în continuare în celulele de insuliță Smad3KO cultivate prin RT-PCR (Figura S4 A și C). În schimb, în fundalul genetic al db/m, Smad3KO nu a cauzat nicio influență remarcabilă asupra genelor sau căilor legate de ciclul celular (Figura S3B și C). Se raportează că semnalizarea TGF-/Smad3 reglează negativ ciclul celular prin inducerea genelor inhibitoare a kinazei dependente de ciclină (CDKI) [7, 8, 12]. În mod surprinzător, nicio expresie a acestor gene CDKI nu a fost suprimată în insulițele Smad3KO-db/db in vivo și în celulele de insuliță Smad3KO cultivate, așa cum a fost relevat de ARN-seq și, respectiv, RT-PCR (Figura S4B și C). În schimb, nivelurile de expresie ale mai multor gene CDKI, cum ar fi p16, p18 și p57, au fost chiar suprareglate în celulele de insulă Smad3KO cultivate (Figura S4C). Aceasta implică faptul că există un mecanism alternativ în proliferarea celulară reglată3-Smad.
Astfel, am analizat potențialul de legare Smad3 pentru secvențele promotoare ale celor 224 DEG în termenul GO al ciclului celular cu software-ul browser ECR (Figura 8A). Printre acestea, o genă numită E2F3 ne-a atras atenția, deoarece este un executor cheie și terminal care reglează intrarea G1/S în ciclul celular [13, 14]. Am găsit un site potențial de legare Smad3 în promotorul locusului E2F3 de șoarece, care este conservat și la om (Figura 8B).
Cistanche tubulosa
Pentru a investiga dacă E2F3 este esențial pentru proliferarea celulară reglată Smad3-, am examinat asocierea dintre E2F3 și Smad3 în insulițe. În conformitate cu ARN-seq, imunohistochimia a detectat că expresia E2F3 a fost redusă în mare măsură în insulele șoarecilor Smad3WT-db/db, dar a crescut foarte mult la șoarecii Smad3KO-db/db (Figura 8C). Mai mult, s-a observat o expresie crescută a E2F3 în celulele de insuliță Smad3KO cultivate atât la nivel de ARN, cât și de proteine (Figura 8 DF). În schimb, tăcerea E2F3 mediată de adenovirus a abrogat activitatea proliferativă a celulelor (insulinala care se adaugaBrdUla care se adauga) în celulele insulare Smad3KO (Figura 9), dezvăluind un rol esențial pentru E2F3 în proliferarea celulară reglată Smad3-.
Pentru a confirma în continuare legarea prezisă a Smad3 în promotorul E2F3, am efectuat imunoprecipitarea cromatinei (ChIP) în insulițe izolate de șoarece (Figura 10A). Specificitatea anticorpului Smad3 utilizat pentru ChIP a fost inițial validată prin imunoprecipitare în insulele de șoarece (Figura 10B). PCR ChIP a confirmat legarea Smad3 la promotorul E2F3 ca anticorp anti-Smad3, dar niciun izotip IgG nespecific nu a precipitat cu succes fragmentul de cromatina corespunzător promotorului E2F3 (Figura 10C). RT-PCR cantitativ a evidențiat o îmbogățire de 6-ori a secvenței promotorului E2F3 în testul ChIP cu anticorpul Smad3 în comparație cu izotipul IgG (Figura 10D), demonstrând că Smad3 se poate lega de regiunea promotor a locusului genomic E2F3 .
Pentru a valida semnificația funcțională a legării Smad3 pe promotorul E2F3, am construit un vector reporter luciferază condus de un promotor E2F3 de șoarece care adăpostește site-ul de legare Smad3 sau forma sa mutantă (Figura 10E). Testul dual-luciferazei în celulele HEK293T a relevat o transcriere robustă a luciferazei condusă de promotorul E2F3 clonat, care a fost inhibată semnificativ prin supraexprimarea Smad3. Cu toate acestea, mutația site-ului de legare Smad3 a abrogat efectul inhibitor al Smad3 (Figura 10F). Aceste constatări au furnizat dovezi directe pentru rolul supresor al Smad3 în transcripția E2F3 prin legarea la promotorul său.
În acest studiu, am demonstrat că transplantul de insulițe cu deficit de Smad3-a produs un efect terapeutic mai bun asupra diabetului zaharat și a leziunii renale diabetice la șoarecii diabetici induși de STZ și șoarecii db/db. În diabetul indus de STZ, transplantul a 100 de insulițe Smad3KO, dar nu a 100 de insulițe Smad3WT a dus la o creștere de 17-ori a masei celulare, care a fost asociată cu o creștere semnificativă a nivelului de insulină din sânge și, astfel, a îmbunătățit intoleranța la glucoză și a recuperat euglicemia, rezultând in protectia impotriva leziunilor renale diabetice.
Rezultate similare au fost găsite și la T2DM la șoarecii db/db la care transplantul cu 250 de insulițe Smad3KO, dar nu aceeași doză de insulițe Smad3WT, a crescut de asemenea o masă celulară de 5-ori și a produs un control glicemic mai bun. Aceste descoperiri sugerează că deficiența Smad3 este rezistentă la micromediile diabetice și promovează în mare măsură expansiunea celulelor insulare grefate și producția de insulină pentru a prezenta un control glicemic mai bun. Interesant, am constatat, de asemenea, că tratamentul cu 100 de insulițe Smad3KO ar putea produce un control glicemic egal ca utilizarea a 200 de insulițe Smad3WT sau KO în diabetul indus de STZ. Această observație sugerează că deficiența Smad3 poate fi capabilă să reducă în mare măsură (cel puțin 50 la sută) numărul de insulițe necesare pentru stabilirea cu succes a independenței insulinei în terapia de înlocuire a celulelor insulare pentru T1DM. Aceste constatări sunt în concordanță cu raportul anterior conform căruia pretratarea insulelor cu SB-431542, un inhibitor al TGFBR1, promovează proliferarea și funcția celulelor după transplant [15]. Cu toate acestea, deoarece Smad2 joacă, de asemenea, un rol esențial în eliberarea stimulată de glucoză a insulinei în celule [16], țintirea Smad3, dar nu a TGFBR1 în amonte în insulițe (celule) poate fi mai favorabilă pentru tratamentul de înlocuire celulară a diabetului. Astfel, transplantul de insuliță cu deficit de Smad3-poate reprezenta o terapie nouă atât pentru T1DM, cât și pentru T2DM. În plus, tratamentul cu insulițe Smad3KO ar putea proteja, de asemenea, împotriva leziunilor renale diabetice la 16 săptămâni de T1DM, deși acest lucru nu este profund în T2DM datorită leziunii renale diabetice minime care apar la șoarecii db/db la vârsta de 12 săptămâni.
Din punct de vedere mecanic, am descoperit că Smad3 funcționează prin suprimarea E2F3 pentru a inhiba proliferarea celulară. Acest lucru este susținut de dovezile că promotorul E2F3 conține un situs funcțional de legare a Smad3, așa cum este confirmat de testul ChIP și reporter al luciferazei. Celulele insulare lipsite de Smad3 au prezentat o proliferare sporită într-un mecanism dependent de E2F3-, deoarece distrugerea E2F3 a abolit această activitate pro-proliferativă. E2F3 aparține familiei E2F și este o componentă critică a mașinilor Rb-E2F care guvernează intrarea în ciclul celular G1/S [13]. E2F sunt factorii transcripționali și executorii finali care reglează genele care orchestrează progresul ciclului celular [14]. S-a dovedit că supraexprimarea E2F3 promovează proliferarea celulară în insulițe de la rozătoare și oameni [17]. Descoperirile conform cărora Smad3 vizează transcripțional E2F3 pentru a reprima ciclul celular în celule oferă un nou mecanism de reglementare pentru proliferarea celulară. Astfel, întreruperea Smad3 în celulele insulare promovează proliferarea celulară dependentă de E2F3-, așa cum este demonstrat de o creștere marcată a celulelor PCNA plus sau BrdU plus producătoare de insulină, sugerând că tratamentul cu o doză subterapeutică de insulițe Smad3KO este suficient pentru a extinde celulele. masă și inhibă atât T1DM la șoarecii induși de STZ, cât și T2DM la șoarecii db/db.
Herba CistancheșiExtract de Cistanche
Se raportează că semnalizarea TGF joacă un rol critic în dezvoltarea și funcționarea celulelor insulare pancreatice, oprește ciclul celular și provoacă apoptoza celulară prin inducerea CDKIs [7, 8, 18]. Spre surprinderea noastră, atât experimentele in vivo, cât și in vitro au dezvăluit că transcripția CDKI-urilor nu a fost modificată sau chiar reglată în sus în insulele Smad3KO (Figura S4). Această discrepanță poate fi atribuită diferitelor condiții experimentale. Rezultatele studiului actual au fost derivate de la șoareci Smad3KO (insulițe). Cu toate acestea, studiile anterioare se bazează pe inhibarea farmacologică a TGFBR1, care va influența întreaga semnalizare TGF [7, 8]. În plus, am folosit mostre de insulițe de la șoareci adulți tineri (vârsta de 8-10 săptămâni), în timp ce insulițe de la animale relativ bătrâne sau donatori cadaveri de oameni în vârstă au fost utilizate în studiile anterioare [7, 8]. Deoarece celulele insulare arată acumularea de CDKI asociată vârstei [19], CDKI-urile din celulele îmbătrânite pot fi mai sensibile la inhibarea semnalizării TGF.
Au existat mai multe limitări în studiul de față. În primul rând, eficacitatea transplantului de insuliță este investigată în modelul de șoarece diabetic indus de STZ fără reacție autoimună. Prin urmare, avantajul Smad3KO față de terapia insulară Smad3WT pentru diabet ar trebui verificat și într-un model autentic T1DM în viitor. În al doilea rând, concluziile acestui studiu se bazează pe întreaga insulă, dar nu pe terapia celulară Smad3KO specifică celulei. Nu este clar dacă tipurile de celule, altele decât celulele din insuliță, ar îndeplini un rol dependent de Smad3-pentru a modula proliferarea celulară prin căi de diafonie intercelulară. Astfel, sunt justificate studii suplimentare cu Smad3KO specific celulei. În plus, concluziile acestui studiu trebuie verificate în probele de insuliță umane pentru a dovedi semnificația lor clinică.
Referințe
1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nat Rev Endocrinol. 2017; 13: 268-77.
2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Diferențierea celulelor stem pluripotente umane la celulele pancreatice funcționale pentru terapiile diabetului: inovații, provocări și direcții viitoare. J Biol Ing. 2017; 11:21.
3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S și colab. Evaluarea histologică a grefei după transplantul clinic de insulă. Transplantul. 2009; 88: 1286-93.
4. Lan HY. Roluri diverse ale TGF-beta/Smads în fibroza renală și inflamație. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.
5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. Semnalizarea TGF-beta/Smad în fibroza renală. Front Physiol. 2015; 6:82.
6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K și colab. O rețea de semnalizare smad reglează proliferarea celulelor insulare. Diabet. 2014; 63: 224-36.
7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. Inhibarea semnalizării TGF-beta promovează replicarea celulelor beta-beta pancreatice umane. Diabet. 2016; 65: 1208-18.
8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V, et al. Inhibarea combinată a căilor DYRK1A, SMAD și Tritorax se sinergizează pentru a induce replicarea robustă în celulele beta umane adulte. Cell Metab. 2019; 29: 638-52 e5.
9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH și colab. Deficiența Smad3 promovează proliferarea și funcționarea celulelor beta la șoarecii db/db prin restabilirea expresiei Pax6. Teranostice. 2021; 11: 2845-59.
10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. O metodă pentru izolarea insulelor murine și transplantul de rinichi subcapsular. J Vis Exp. 2011.
11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH și colab. Transplantul de izogrefă insulară îmbunătățește sensibilitatea la insulină într-un model murin de diabet de tip 2. Endocrin. 2021; 72: 660-71.
12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. Inducerea p16ink4a și p19ARF de către TGFbeta1 contribuie la stoparea creșterii și răspunsul la senescență în keratinocitele de șoarece. Mol Carcinog. 2009; 48: 181-6.
13. Dyer MA, Cepko CL. Reglarea proliferării în timpul dezvoltării retinei. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.
14. Dyson N. Reglarea E2F de către proteinele din familia pRB. Genes Dev. 1998; 12: 2245-62.
15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Suprimarea tranzitorie a semnalizării receptorului TGFbeta facilitează transplantul de insulă umană. Endocrinologie. 2016; 157: 1348-56.
16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Perturbarea SMAD2 în celulele beta pancreatice de șoarece duce la hiperplazia insulelor și secreția de insulină afectată datorită atenuării activității canalului K plus sensibil la ATP. Diabetologia. 2014; 57: 157-66.
17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P și colab. Supraexprimarea E2F3 promovează proliferarea celulelor beta umane funcționale fără inducerea apoptozei. Ciclul celulei. 2013; 12: 2691-702.
18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. Semnalizarea familiei TGF-beta în controlul proliferării și supraviețuirii celulare. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9.
19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Diabetul zaharat--progresează și provoacă în proliferarea celulelor beta umane. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11: 201-12.
20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H și colab. Întreruperea țintită a SMAD3 are ca rezultat afectarea imunității mucoasei și reducerea răspunsului celulelor T la TGF-beta. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.
21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Un protocol pentru izolarea insulelor din pancreasul de șoarece. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.
22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Transplantul de insulițe pancreatice în capsula renală a șoarecilor diabetici. J Vis Exp. 2007: 404.
23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q și colab. Eliminarea Smad3 previne fibroza renală și inflamația în nefropatia diabetică de tip 2. Metabolism. 2020; 103: 154013.
Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 și Hui-Yao Lan2,7
1 Centrul de Cercetare pentru Medicină Integrată și Departamentul de Nefrologie, Spitalul Afiliat de Medicină Tradițională Chineză din Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, China.
2. Departamentul de Medicină și Terapeutică și Institutul de Științe ale Sănătății Li Ka Shing, Universitatea Chineză din Hong Kong, Hong Kong, 999077, China.
3. Laboratorul comun Guangdong-Hong Kong pentru bolile imunologice și genetice ale rinichilor, Spitalul Popular Provincial Guangdong, Academia de Științe Medicale din Guangdong, Guangzhou, Guangdong, 510080, China.
4. Laboratorul cheie de bioelectronică de stat, Laboratorul cheie pentru biomateriale și dispozitive Jiangsu, Școala de Științe Biologice și Inginerie Medicală, Universitatea de Sud-Est, Nanjing, China.
5. Laboratorul cheie de prevenire și management al bolii cronice de rinichi din orașul Zhanjiang, Institutul de Nefrologie, Spitalul afiliat al Universității Medicale Guangdong, Zhanjiang, Guangdong, 524001, China.
6. Baza Națională de Cercetare Clinică de Medicină Tradițională Chineză, Spitalul afiliat de Medicină Tradițională Chineză din Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, China.
7. CUHK-Guangdong Provincial People's Hospital Laboratorul comun de cercetare privind bolile imunologice și genetice ale rinichilor, Universitatea Chineză din Hong Kong, Hong Kong, 999077, China.
