Partea Ⅰ Chelatorul de fier, PBT434, modulează traficul transcelular de fier în celulele endoteliale microvasculare ale creierului
Apr 28, 2023
Abstract
Fierul și alte metale de tranziție, cum ar fi cuprul și manganul, sunt esențiale pentru susținerea funcției creierului, dar supraacumularea este citotoxică. Această supraacumulare de metale, în special de fier, este comună mai multor tulburări neurologice; acestea includ boala Alzheimer, boala Parkinson, ataxia lui Friedrich și alte tulburări care prezintă neurodegenerare și acumularea asociată de fier din creier. Gestionarea fluxului de fier de către bariera hemato-encefalică oferă prima linie de apărare împotriva supraacumulării de fier în fiziologia normală și a acestor stări patologice. În acest studiu, am stabilit că chelatorul de fier PBT434, care este în prezent în curs de dezvoltare pentru tratamentul bolii Parkinson și al atrofiei sistemului multiplu, modulează absorbția de fier de către celulele endoteliale microvasculare ale creierului uman (hBMVEC) prin chelarea Fe extracelular.2 plus. Tratamentul hBMVEC cu PBT434 are ca rezultat o creștere a abundenței transcriptelor pentru receptorul transferinei (TfR) și ceruloplasmină (Cp). Analizele Western blot și ELISA relevă și o creștere corespunzătoare a proteinelor. În interiorul celulei, PBT434 crește nivelul detectabil de Fe caritabil și labil2 plus; datele indică faptul că acest Fe2 plusse eliberează din feritină. În plus, PBT434 potențează efluxul de fier probabil datorită creșterii fierului feros citosolic, substratul exportatorului de fier, feroportina. PBT434 se echilibrează rapid și bidirecțional peste o barieră hematoencefalică hBMVEC. Aceste rezultate indică faptul că complexul de fier PBT434-nu este un substrat pentru captarea hBMVEC și, prin urmare, susțin un model în care PBT434 ar chela fierul interstițial și ar inhiba recaptarea fierului de către celulele endoteliale ale barierei hemato-encefalice, așa cum precum și inhiba captarea acestuia de către celelalte celule ale unității neurovasculare. În general, acesta prezintă un mecanism nou și promițător pentru chelarea terapeutică a fierului.
Click aici pentru a obținecare sunt beneficiile Cistanche
Introducere
Terapia de chelare a metalelor (MCT) a fost folosită de mult timp ca tratament pentru otrăvirea cu metale de tranziție și pentru tulburările genetice în metabolismul unui ion de metal esențial care duce la supraacumularea metalului [1-3]. Două exemple ale acestora din urmă sunt hiperacumularea de cupru în boala Wilson [4] și de fier în hemocromatoza ereditară [5]. Atât cuprul, cât și fierul sunt catalizatori ai stresului oxidativ și, prin urmare, sunt citotoxice la concentrații care depășesc capacitatea celulei și a organismului de a „însoți” aceste metale de tranziție redox-active [6, 7]. Acumularea de fier, în special, este în general idiopatică; într-adevăr, o creștere a fierului este un semn distinctiv al unui creier îmbătrânit [8-10]. Din punct de vedere patologic, această acumulare de fier din creier este o caracteristică a mutațiilor în genele care nu au legătură cu metabolismul fierului [11-15], precum și a unei varietăți de alte boli neurodegenerative, dintre care unele le lipsesc o legătură genetică specifică, cum ar fi îmbătrânirea [16], boala Alzheimer [16]. 17], Ataxia lui Friedreich [18] și boala Parkinson [19]. Ca grup, astfel de tulburări pot fi considerate neurodegenerare cu acumulare de fier în creier (NBIA), deși acest acronim a fost în mod obișnuit limitat la cele pentru care a fost identificată o legătură genetică [11, 13, 14].
În cazul supraîncărcării cu fier, obiectivul este „curățarea” organismului de excesul de fier din cauza unui defect în captarea sau efluxul celulelor de fier. Aici obiectivul este de a depăși chelatorii fiziologici de fier cu medicamentul; un compus care are o farmacocinetică bună și o afinitate mare pentru fierul feros este medicamentul țintă. Deoarece corpul este supra-umplut cu metalul esențial, există puține îngrijorări cu privire la inducerea unei deficiențe în cursul tratamentului. Tratarea bolilor cerebrale cu terapia de chelare a fierului necesită o strategie diferită. Aceasta nu este o problemă de supraîncărcare sistemică cu fier, ci de acumulare de fier în zonele de patologie cu sechele dăunătoare din aval. Acumularea de fier asociată cu vârsta în boala Parkinson (PD), de exemplu, poate contribui la deteriorarea celulară legată de stresul oxidativ [20]. Excesul de fier labil promovează plierea greșită a -sinucleinei în neuronii substanței negre. Utilizarea unui chelator cu afinitate ridicată poate duce la o anumită reducere a încărcăturii de fier din creier, dar va induce cu siguranță o deficiență de fier care, cel puțin la populația în vârstă, este contraindicată având în vedere deficitul sistemic de fier comun grupului de vârstă respectiv [21] . Un chelator cu o afinitate optimă are potențialul de a reduce acumularea de fier, precum și stresul oxidativ asociat datorat excesului de fier labil și proceselor bolii subiacente.
Cistanche tubulosașiEfectele lui Cistanche
Un chelator aprobat pentru utilizarea în tratarea supraîncărcării cu fier indusă de transfuzii la pacienții cu talasemie este deferiprona (DFP, denumire de marcă Ferriprox) [5, 22]. DFP a fost, de asemenea, utilizat în tratarea ataxiei Friedreich [23] și a bolii Parkinson [24, 25]. Într-o meta-analiză, s-a arătat că DFP oferă reduceri semnificative ale conținutului de fier miocardic, precum și o protecție cardiacă mai mare la pacienții cu talasemie decât deferoxamina, agentul clasic de chelare a fierului [5]. Pe de altă parte, DFP este metabolizat rapid de ficat [26] și cercetări mai recente au arătat că chelează Fe2 plus la locul activ al histon-lizin demetilazelor dependente de fier, activitate care se corelează cu o citotoxicitate nerecunoscută anterior [27]. Această constatare subliniază o limitare cheie în utilizarea terapiei de chelare a fierului, și anume competiția medicamentului pentru fierul esențial din punct de vedere fiziologic, fie într-un depozit de fier, fie într-o proteină care găzduiește o specie protetică de fier. Cu toate acestea, DFP, de exemplu, a demonstrat eficacitatea într-un studiu de fază 2 a tratamentului bolii Parkinson, așa cum este indicat atât de indici analitici (încărcare redusă de fier din creier prin RMN ponderat T2-), cât și de indici comportamentali (funcția cognitivă și a neuronului motor) [ 24, 25].
Afinitatea DFP pentru Fe3 plus rămâne totuși o preocupare. Specia stabilă de DFP-fier este complexul tris, [Fe(DFP)3] 0 [28]. În timp ce neutralitatea acestui complex este ideală pentru mobilizarea fierului din celulă, constanta de stabilitate pentru acesta, ~1037, face din DFP un adevărat captator de fier; în acest context, inhibarea acesteia a unei enzime de fier precum lizin demetilaza este previzibilă [27]. Această preocupare reflectă nevoia de a dezvolta chelatori de fier care au permeabilitatea membranei DFP, dar o afinitate semnificativ mai slabă atât pentru Fe2 plus cât și pentru Fe3 plus. Această ultimă caracteristică limitează eliminarea de droguri a metalului protetic și potențialul termodinamic al agentului de chelare de a cataliza auto-oxidarea fierului feros care are ca rezultat producerea de specii reactive de oxigen. În esență, chelatorii puternici de fier feric catalizează proprietatea pro-oxidantă a Fe2 plus [29]. În acest studiu, raportăm modul în care un astfel de chelator de fier cu afinități moderate de fier feric și feros modulează fluxul de fier în celulele endoteliale microvasculare ale creierului care formează bariera hemato-encefalică (BBB).
Pastile de Cistanche
Acest medicament, PBT434 [5,7-diclor-2-((metilamino)metil)-8-hidroxi-3-metilchinazolin-4 (3H)-ona, Fig 1A] , formează un complex bis-fier cu constante de stabilitate log de ~11 și ~15 pentru Fe2 plusși Fe3 plus, respectiv [30]. PBT434 a prevenit pierderea neuronilor substanței negre pars compacta (SNpc), a scăzut acumularea de sinucleină nigrală, a redus conținutul de fier legat de modelul bolii PD în mijlocul creierului și a salvat performanța motrică la două modele de șoarece de boala Parkinson fără nicio epuizare aparentă a rezervelor sistemice de fier. [30]. PBT434 este, de asemenea, eficient în modelele murine de atrofie a sistemelor multiple (MSA) [30, 31], o tulburare motorie similară ca prezentare cu boala Parkinson, dar care este caracterizată prin plierea greșită a sinucleinei și acumularea ulterioară determinând formarea de incluziuni citoplasmatice gliale care sunt semnul distinctiv. patologia bolii [32]. În mod semnificativ, PBT434 a redus markerii stresului oxidativ în modelele de PD la șoarece [30] indicând faptul că 1) PBT434 a vizat depozitele de fier care altfel erau pregătite să funcționeze ca pro-oxidanți și 2) PBT434 nu a potențat această citotoxicitate în curs de dezvoltare bazată pe oxidare. PBT434 a finalizat în mod satisfăcător un studiu de fază 1 [33].
Lucrarea prezentată aici a fost concepută pentru a interoga impactul pe care PBT434 îl are asupra traficului de fier în celulele de barieră ale creierului, celulele endoteliale microvasculare care împreună cu glia subiacentă formează bariera hemato-encefalică. Aceste studii au folosit o linie de celule endoteliale imortalizate bine validate atât în formate de cultură monostrat cât și transwell [34–37]. Obiectivul principal al acestor studii a fost de a determina cinetica captării și efluxului fierului din aceste celule și modularea lor de către PBT434. Modelul transwell BBB a fost folosit și pentru a demonstra fluxul transcelular bidirecțional PBT434 peste bariera celulelor endoteliale. Modelul a demonstrat în termeni moleculari că PBT434 inhibă absorbția fierului prin chelare în timp ce stimulează efluxul de fier. Studiile de imagistică celulară indică faptul că PBT434 accesează același bazin de fier labil sondat de un Fe clasic2 plusagent de chelare, 2,2’-bipiridină sau bipiridil și o sondă fluorescentă pentru fierul feros. Rezultatele sugerează un posibil mecanism de acțiune pentru PBT434, care include inhibarea captării fierului sistemic la nivelul BBB și sechestrarea ulterioară a fierului din creier în spațiul interstițial.
Rezultate
1. PBT434 nu are efecte citotoxice asupra celulelor endoteliale microvasculare ale creierului
Pentru a determina o gamă adecvată de concentrații de lucru pentru PBT434 în cultura noastră de celule in vitro, am utilizat testul MTT pentru a monitoriza funcția mitocondrială hBMVEC ca răspuns la PBT434. Pe baza rapoartelor anterioare [30], au fost tratați cu o gamă de concentrații de PBT434 până la 100 μM timp de 24 de ore. Nu am observat modificări semnificative ale viabilității hBMVEC cu nicio concentrație testată (Fig 2).
2. PBT434 este rapid preluat și traficat peste bariera hBMVEC
PBT434 este un medicament biodisponibil oral care poate pătrunde cu ușurință în BBB, așa cum se observă în studiile efectuate la șoareci și la oameni [30, 38, 39]. Am monitorizat acumularea de PBT434 în hBMVEC crescut în monostraturi folosind PBT434 marcat cu 14C ca radiotrasor. Datele au indicat că în prima fază, 14C-PBT434 s-a echilibrat rapid între mediul de absorbție și celulă. Această absorbție inițială a fost urmată de o acumulare lentă suplimentară timp de 3 ore, care a prezentat o rată de 30,1 ± 9,8 pmol/mg/h (Fig 3A). În protocolul de absorbție, absorbția este stinsă și celulele sunt spălate la 4 °C înainte de procesare pentru acumularea 14C-PBT434 (Metode). Într-un experiment separat, am examinat efluxul 14C-PBT434 din hBMVEC după o perioadă de încărcare de 30 de minute. În protocolul de eflux, celulele sunt spălate la 25°C. Datele din fig. 3B indică faptul că în spălarea la 25°C, aproximativ 92% din 14C-PBT434 acumulat în celule s-a pierdut (cf 550 pmol 14C-PBT434/mg proteină în 3A la 30 min la 43 pmol 14C-PBT434/mg proteină la t=0 în 3B). A existat o pierdere lentă suplimentară a 14C-PBT434 rămas (Fig 3B). Datele sugerează două aspecte ale acumulării și efluxului de PBT434 de către hBMVEC. Fluxul prin membrana plasmatică atinge rapid ceea ce pare a fi un echilibru, fie în timpul absorbției, fie în timpul efluxului. Cu toate acestea, în ambele procese, apare un alt proces mai lent. Acest lucru sugerează că în interiorul celulei, o anumită fracțiune a celulei PBT434 se află într-o locație/stare care este într-o relație cinetică de echilibru cu fracția în echilibru cu mediul extracelular. Analiza cinetică observată în Fig 3B a estimat că acest grup de PBT434 a fost reprezentat de 27±4 pmol/mg proteină în lizatul celular atunci când celulele au fost tratate cu reactiv 20 μM.
Pentru a examina fluxul transcelular al PBT434, am folosit un model BBB in vitro bine validat, utilizând au crescut pe partea apicală a unei membrane transwell [35, 36, 40, 41]. Proprietățile de barieră ale acestor culturi transwell au fost verificate prin cuantificarea rezistenței lor electrice transendoteliale (TEER) și impermeabilitatea la dextran marcat cu FITC (S1 Fig). Am comparat absorbția 14C-PBT434 la nivelul luminal (sau apical, partea sângelui) (Fig 4A) cu absorbția la nivelul membranei abluminală (sau bazolaterală, partea creierului) (Fig 4C). În același experiment, efluxul corespunzător (fluxul transcelular) a fost cuantificat prin apariția 14C-PBT434 în camera de eflux (Fig 4 panourile B și D). Ratele acestor procese sunt prezentate în Tabelul 1. Datele de masă ilustrate în Fig. 4 (panourile B și D) arată că fluxul net de PBT434 prin acest model de barieră hemato-encefalică a fost același în cele două direcții. Au existat 976 ± 185 pmol 14C-PBT434 acumulați în camera bazală (Fig 4B) și 1033 ± 210 pmol cuantificați în camera bazală (Fig 4D). Această aproape echivalență s-a reflectat și în ratele aproape similare ale efluxului PBT434 la cele două membrane de barieră (Tabelul 1). Cu toate acestea, a existat o absorbție semnificativ mai mare a PBT434 la membrana bazolaterală în acest model de barieră, așa cum este ilustrat de pierderea de compus cu aproximativ 50% mai mare din camera bazală (Fig 4C), care corespundea unei rate de absorbție celulară aparentă cu ~40% mai mare. (Tabelul 1). Se preconizează că o absorbție mai robustă va avea ca rezultat o acumulare mai mare. Analiza celulelor la 3 ore a arătat că au păstrat ~ 6 μM PBT434, indiferent de direcția fluxului. Valorile au fost 8,1± 1,3 μM (apical la bazal) și 4,7±1,2 μM (bazal la apical). După cum s-a menționat mai sus, această analiză urmează spălarea celulelor înainte de liză și cuantificarea proteinei celulare totale și 14C-PBT434. În plus, mediul din camera apicală conținea RPMI plus 10% FBS și 10% NuSerum, în timp ce camera bazală, „creierului”, conținea doar RPMI (Metode). O concluzie rezonabilă a fost că „absorbția” mai mare la nivelul membranei bazale a reflectat o adsorbție de suprafață celulară a PBT434 care a fost limitată în camera apicală de prezența componentelor proteice în ser. La spălarea celulelor pentru acumularea de PBT434, acest material adsorbit (care a fost înregistrat ca „absorbție”) a fost îndepărtat. Repetarea acestui experiment de flux, dar cu ser în camera bazală a demonstrat că, într-adevăr, serul a suprimat această probabilă adsorbție a PBT434 la suprafața celulară (S2 Fig).
3. PBT434, spre deosebire de bipiridil, nu limitează disponibilitatea intracelulară a fierului labil
Deoarece PBT434 are o afinitate mai moderată pentru fier în comparație cu chelatorii de fier clasici, cum ar fi deferiprona sau bipiridilul, am examinat modul în care această diferență s-a reflectat în efectul PBT434 asupra bazinului de fier celular labil (LIP) al hBMVEC. Pentru a face acest lucru, am profitat de permeabilul, Fe2 plus-colorant fluorescent specific FerroOrange, care reactioneaza cu fierul citoplasmatic caritabil. Am observat o ablație semnificativă a fluorescenței în celule atunci când au fost tratate cu bipiridil, în concordanță cu chelarea LIP de către acest chelator de fier feros de mare afinitate și blocând astfel acțiunea indicatorului de fier fluorescent (Fig 5A). În schimb, PBT434 nu a concurat cu FerroOrange pentru Fe2 plus, un comportament în concordanță cu afinitatea sa mai moderată [30]. Rezultatele au arătat că PBT434, dar nu PBT434-întâlnit derivatul inactiv, a indus o creștere de 34 ± 9% a Fe accesibil cu FerroOrange.2 plussugerând că acest agent de chelare a mobilizat fierul în interiorul celulei fără toxicitate concomitentă. Datele prezentate mai jos sugerează că acest fier provine din feritină.
Sa demonstrat anterior că PBT434 restabilește expresia proteinei feroportinei epuizate la șoarecii tratați cu MPTP la un nivel similar cu cel al șoarecilor nelezionați [30]. Acest rezultat, împreună cu creșterea colorării intracelulare cu fier feros ca răspuns la PBT434, a sugerat un efect potențial asupra sistemului de răspuns celular al fierului și a funcției proteinelor legate de fier din aval. Pentru a evalua acest lucru, am efectuat mai întâi o analiză PCR cantitativă (qPCR) a efectului PBT434 asupra abundenței transcriptelor pentru mai multe proteine de manipulare a fierului (Fig 6). În timp ce transcrierile pentru proteina de eflux de fier, feroportina (Fpn) și cele două chaperone citoplasmatice de fier, PCBP1 și 2 au fost neafectate, abundența ARNm pentru receptorul transferinei (TfR) și feroxidaza, ceruloplasmina (Cp), nu a fost afectată. Schimbare. Transcrierile TfR și Cp au crescut de 2,8 și, respectiv, de 3,{13}}ori. Expresia receptorului transferinei (TfR) este legată de sistemul elementului sensibil la fier (IRE)/proteina reglatoare a fierului (IRP) [42-44]. Creșterea ARNm TfR sugerează că PBT434 concurează cu livrarea de fier dependentă de PCBP1-pentru asamblarea clusterului Fe, S care convertește IREBP reglator dintr-o proteină care leagă ARN-ul în aconitază citosolică [45]. Astfel, PBT434 schimbă această modulație de reglare către legarea ARN și inhibarea corespunzătoare a degradării ARNm TfR. În deficitul de fier celular, expresia Cp este, parțial, reglementată de HIF-1 [46]. O creștere a funcției HIF-1 rezultă din scăderea hidroxilării sale de către activitatea prolil hidroxilazei într-o reacție dependentă de fier [47]. Ca și în cazul IREBP, PBT434 pare să diminueze rezervorul de fier care servește ca co-factor în hidroxilarea și degradarea HIF-1. În acest model, creșterea nivelului de echilibru al acestui activator transcripțional crește transcripția Cp.
Folosind o combinație de analiză ELISA și western blotting, am testat expresia proteinelor de manipulare a fierului în PBT434 sau hBMVEC tratat cu PBT434-met; exemple de analize WB sunt date în Fig 7A. Datele au arătat că abundența monomerului și dimerului TfR a crescut semnificativ cu 24 de ore, la fel ca Cp (Fig 7B și 7C). Ambele creșteri au fost paralele cu creșterea dependentă de PBT434-a transcrierilor respective (Fig 6). În schimb, expresia proteinei de eflux de fier, Fpn, a fost insensibilă la tratamentul cu PBT434 (Fig 7D).
Am folosit ELISA ca metodă suplimentară pentru a cuantifica modificările de pliere indicate de datele Western blot. Astfel, hBMVEC au fost tratate cu PBT434 timp de 24 de ore și lizatele celulare au fost testate prin ELISA pentru TfR (Fig 8A). Creșterea de ori a TfR ca răspuns la tratamentul cu PBT434 cuantificat prin ELISA a fost echivalentă cu cea furnizată de analiza Western blot (Fig 7B). ELISA a fost folosit și pentru a evalua abundența proteinei Cp secretate și legate de GPI, folosind celule HepG2 ca martor pozitiv. În ceea ce privește Cp secretat în mediul de creștere, această abordare a fost limitată prin faptul că abundența sCp atât în mediul condiționat HepG2, cât și în hBMVEC a fost la sau sub limita inferioară de sensibilitate a acestui test (S3 Fig). Cu toate acestea, a permis evaluarea abundenței GPI-Cp. În această metodă, celulele au fost tratate cu fosfolipază C specifică fosfatidilinozitolului (PI-PLC), care scindează ancora GPI; mediul astfel condiționat a fost concentrat și analizat prin Cp-ELISA. În timp ce această abordare a demonstrat că PBT434 a crescut cantitatea de GPI-Cp în celulele HepG2, din nou nu a reușit să detecteze niciun Cp eliberat de PI-PLC (Fig 8B). ELISA a oferit, de asemenea, o metodă directă pentru cuantificarea feritinei. Pentru a face acest lucru, hBMVEC au fost încărcate cu 1 uM Fe-citrat timp de 24 de ore, urmate de tratament în absența sau prezența PBT434 pentru încă 1 oră. Lizatele de celule rezultate au fost supuse analizei ELISA pentru feritina (Fig 8C). Spre deosebire de creșterea TfR, tratamentul cu PBT434 a doborât proteina feritină (Ft) cu ~18%. Într-adevăr, această pierdere a proteinei Ft a fost evidentă după numai 1 oră de tratament cu reactiv. Natura temporală a acestui rezultat poate fi corelată cu creșterea Fe2 caritabil plus menționată mai sus după un tratament de 30 de minute cu PBT434. După cum s-a discutat mai târziu, scăderea feritinei a fost demonstrată în urma tratamentului cu alți Fe2 permeabil în celule plus agenți de chelare [48].
4. 55F2 pluscaptarea este inhibată prin complexarea cu PBT434
Având în vedere echilibrarea rapidă a PBT434 în hBMVEC în 30 de minute, în comparație cu absorbția lentă, bifazică și echilibrarea Fe2 plus peste 24 de ore [49], am emis ipoteza că PBT434 și Fe2 plus nu împărtășesc același mecanism de absorbție. Pentru a testa acest lucru, monostraturile au fost incubate cu 55Fe2 plus radiomarcat în absența sau prezența PBT434 sau PBT{10}}met și a fost monitorizată absorbția 55Fe2 plus timp de 3 ore (Fig 9A). PBT434 a scăzut semnificativ rata de absorbție a 55Fe2 plus, precum și a scăzut acumularea globală de 55Fe2 plus în lizatele celulare (Fig 9C). Acest efect nu a fost observat cu PBT434-întâlnit. Comparația ratelor de absorbție a PBT434 cu 55Fe indică faptul că PBT434 și Fe2 plus sunt preluate de căi de transport separate. În plus, inhibarea captării 55Fe în prezența PBT434, dar nu a PBT434-met, sugerează că un complex de fier PBT{434-extracelular nu este un ligand pentru transportatorii de fier feros din hBMVEC, și anume ZIP8 și ZIP14.
Suplimente de Cistanche
Pentru a examina în continuare rolul PBT434 în acumularea de fier, am testat efectul pe care l-a avut preexpunerea acestuia asupra absorbției de 55Fe2 plus. Celulele pre-tratate cu PBT434 care au fost, după spălare, expuse la 55Fe2 plus au prezentat o creștere a ratei de absorbție și acumulare de 55Fe2 plus după 3 ore (Fig 9, panourile B și D). Această acumulare crescută a fost menținută timp de cel puțin 24 de ore. Aceste date sugerează că pre-expunerea celulelor la PBT434 potențează tranzitoriu absorbția de fier. În mod neașteptat, PBT434-întâlnit pretratamentul a arătat, de asemenea, o creștere atât a absorbției, cât și a acumulării (Fig 9B), dar acest efect nu a fost la fel de semnificativ sau persistent ca cel arătat de PBT434.
Am arătat că captarea fierului din 59Fe-transferină este susținută de ferri-reducerea și fero-permearea la membrana plasmatică a have [50, 51]. Un rezultat experimental în sprijinul acestui model de captare a fierului TBI a fost reducerea acestei absorbții prin inhibarea activității ferireductazei extra-citoplasmatice; un alt rezultat a fost o inhibare cu 60% a captării fierului TBI de către ferozină, un agent puternic de chelare a fierului feros [50]. Această ultimă strategie a fost utilizată pentru a demonstra că PBT434, dar nu și PBT434-întâlnit, a inhibat și absorbția de fier TBI (Fig 10).
5. PBT434 stimulează 55Fe2 dependent de Fpn plus efluxul
PBT434 are aproximativ 20% din capacitatea deferipronei de a produce o stimulare aparentă a Fe2 plus eflux din celulele neuronale [30]. Am evaluat efluxul de 55Fe2 plus din hBMVEC în absența sau prezența PBT434 în celulele martor sau celulele tratate cu o mini-hepcidină, PR73. Hepcidina este un hormon peptidic găsit atât sistemic, cât și în interstițiul cerebral care se leagă de Fpn și țintește transportorul pentru degradare. Efectele hepcidinei asupra funcției de export de fier a Fpn au fost studiate pe larg [52–54]. Am arătat anterior că efluxul de Fe2 plus din hBMVEC este dependent de Fpn [35, 49]. PR73 are o EC50 de ~4 nM pentru degradarea Fpn într-un test reporter GFP [55]. hBMVEC în monostraturi au fost încărcate cu 55Fe2 plus timp de 24 de ore în absența sau prezența PR73. Efluxul 55Fe a fost apoi cuantificat pe o perioadă de 5 ore în absența sau prezența continuă a PR73 în combinație cu absența și prezența PBT434 (Fig 11). În timp ce PR73 a doborât efluxul de 55Fe atât din culturile de control, cât și din culturile tratate cu PBT434-, PBT434 a suprimat parțial inhibarea din cauza mini-hepcidinei. În absența PBT434, efluxul de fier din culturile tratate cu PR73-a fost redus cu ~ 75 la sută, în timp ce distrugerea în culturile tratate cu PBT434- a fost de numai ~ 50 la sută (Figura 11 și Tabelul 2). Din aceste rezultate se pot deduce două concluzii. În primul rând, distrugerea Fpn de către PR73 reglează în jos 55Fe-eflux în prezența, precum și în absența PBT434. În al doilea rând, în oricare dintre condiții, PBT434 susține o stimulare semnificativă, deși mică, a efluxului de fier.
Referințe
1. Hatcher HC, Singh RN, Torti FM, Torti SV. Chelatori de fier sintetici și naturali: potențial terapeutic și utilizare clinică. Viitorul Med Chim. 2009; 1(9):1643–70.
2 . Nuñez MT, Chana-Cuevas P. Noi perspective în terapia de chelare a fierului pentru tratamentul bolilor neurodegenerative. Produse farmaceutice (Basel). 2018; 11(4):109.
3. Tosato M, Di Marco V. Terapia de chelare a metalelor și boala Parkinson: O revizuire critică asupra termodinamicii formării complexe între ionii metalici relevanți și medicamentele promițătoare sau stabilite. Biomolecule. 2019; 9(7).
4. Hedera P. Actualizare privind managementul clinic al bolii Wilson. Appl Clin Genet. 2017; 10:9–19.
5. Xia S, Zhang W, Huang L, Jiang H. Eficacitatea și siguranța comparativă a deferoxaminei, deferipronei și deferasiroxului asupra talasemiei severe: o meta-analiză a 16 studii randomizate controlate. Plus unu. 2013; 8(12):e82662.
6. Buettner GR, Jurkiewicz BA. Metale catalitice, ascorbat și radicali liberi: combinații de evitat. Radiat Res. 1996; 145(5):532–41. PMID: 8619018
7. Singh A, Kukreti R, Saso L, Kukreti S. Stresul oxidativ: un modulator cheie în bolile neurodegenerative. Molecule. 2019; 24(8).
8. Ashraf A, Clark M, So PW. Îmbătrânirea lui Iron Man. Front Aging Neurosci. 2018; 10:65.
9. Ghadery C, Pirpamer L, Hofer E, Langkammer C, Petrovic K, Loitfelder M, et al. Maparea R2* pentru fierul creierului: asocieri cu cogniția în îmbătrânirea normală. Neurobiol Îmbătrânire. 2015; 36(2):925–32.
10. Zecca L, Youdim MBH, Riederer P, Connor JR, Crichton RR. Fier, îmbătrânire a creierului și tulburări neurodegenerative. Nat Rev Neurosci. 2004; 5(11):863–73.
11. Di Meo I, Tiranti V. Clasificarea și patogeneza moleculară a sindroamelor NBIA. Eur J Pediatr Neurol. 2018; 22(2):272–84.
12. Levi S, Finazzi D. Neurodegeneration with brain iron accumulation: update on pathogenic mecanismes. Front Pharmacol. 2014; 5:99–.
13. Levi S, Tiranti V. Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation Disorders: Valuable Models Aid to Understanding the Patogenesis of Iron Deposition. Produse farmaceutice (Basel). 2019; 12(1).
14. Meyer E, Kurian MA, Hayflick SJ. Neurodegenerarea cu acumularea de fier din creier: diversitate genetică și mecanisme patofiziologice. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015; 16:257–79.
15. Tonekaboni SH, Mollamohammadi M. Neurodegenerare cu acumulare de fier din creier: o privire de ansamblu. Iran J Child Neurol. 2014; 8(4):1–8. PMID: 25657764
16. Cozzi A, Orellana DI, Santambrogio P, Rubio A, Cancellieri C, Giannelli S, et al. Modelarea celulelor stem a neuroferitinopatiei relevă fierul ca determinant al senescenței și ferroptozei în timpul îmbătrânirii neuronale. Rapoarte de celule stem. 2019; 13(5):832–46.
17. Liu JL, Fan YG, Yang ZS, Wang ZY, Guo C. Iron and Alzheimer's Disease: From Patogenesis to Therapeutic Implications. Neurosci frontali. 2018; 12:632.
18. Llorens JV, Soriano S, Calap-Quintana P, Gonzalez-Cabo P, Molto MD. Rolul fierului în ataxia lui Friedreich: perspective din studiile în țesuturi umane și modele celulare și animale. Neurosci frontali. 2019; 13:75.
19. Puschmann A. Noi gene care cauzează boala Parkinson ereditară sau parkinsonismul. Curr Neurol Neurosci Rep. 2017; 17(9):66.
20. Crielaard BJ, Lammers T, Rivella S. Targeting iron metabolism in drug discovery and delivery. Nat Rev Drug Discov. 2017; 16(6):400–23.
21. Guralnik JM, Eisenstaedt RS, Ferrucci L, Klein HG, Woodman RC. Prevalența anemiei la persoanele de 65 de ani și peste în Statele Unite: dovezi pentru o rată ridicată a anemiei inexplicabile. Sânge. 2004; 104 (8):2263–8.
22. Pepe A, Meloni A, Capra M, Cianciulli P, Prossomariti L, Malaventura C, et al. Tratamentul cu deferasirox, deferipronă și deferioxamină la pacienții majori cu talasemie: fierul cardiac și compararea funcției determinate prin imagistica prin rezonanță magnetică cantitativă. hematologică. 2011; 96(1):41–7.
23. Pandolfo M, Arpa J, Delatycki MB, Le Quan Sang KH, Mariotti C, Munnich A, et al. Deferiprona în ataxia Friedreich: un studiu controlat randomizat de 6-lună. Ann Neurol. 2014; 76(4):509–21.
24. Martin-Bastida A, Ward RJ, Newbould R, Piccini P, Sharp D, Kabba C și colab. Chelarea fierului cerebral de către deferipronă în faza 2, dublu-orb, randomizat, controlat cu placebo, în boala Parkinson. Sci Rep. 2017; 7(1):1398.
25. Devos D, Moreau C, Devedjian JC, Kluza J, Petrault M, Laloux C, et al. Vizarea fierului chelat ca modalitate terapeutică în boala Parkinson. Semnal antioxid Redox. 2014; 21(2):195–210. https://doi. org/10.1089/ars.2013.5593 PMID: 24251381
26. Singh S, Epemolu RO, Dobbin PS, Tilbrook GS, Ellis BL, Damani LA, et al. Profilele metabolice urinare la oameni și șobolani ale 1,2-dimetil- și 1,2-dietil-substituite 3-hidroxipiridin-4-one. Metabolismul și eliminarea medicamentelor. 1992; 20(2):256. PMID: 1352218
27. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, Xu Y, Ho PY, Bridges A, et al. Deferiprona: Studiu de relație cu activitatea de inhibare a activității și a activității structurii histonelor lizinei demetilazei pan-selective. Sci Rep. 2019; 9(1):4802.
28. Hider R. Evoluții recente s-au concentrat pe chelatorii de fier activi pe cale orală. Rapoarte de talasemie. 2014; 4 (2).
29. Kosman DJ. Metabolismul fierului în aerobi: gestionarea hidrolizei fierului feric și a autooxidării fierului feros. Coord Chem Rev. 2013; 257(1):210–7.
30. Finkelstein DI, Billings JL, Adlard PA, Ayton S, Sedjahtera A, Masters CL, et al. Noul compus PBT434 previne neurodegenerarea mediată de fier și toxicitatea alfa-sinucleinei în mai multe modele de boala Parkinson. Acta Neupathol Commun. 2017; 5(1):53.
31. Heras-Garvin A, Refolo V, Schmidt C, Bradbury M, Stamler D, Stefanova N, editori. PBT434 Păstrează neuronii dopaminergici, reduce oligomerizarea alfa-sinucleinei și îmbunătățește funcția motorie într-un model de atrofie a sistemului multiplu murin transgenic. Analele Neurologiei; 2020: Wiley 111 River St, Hoboken 07030–5774, NJ SUA.
32. Heras-Garvin A, Stefanova N. MSA: De la mecanismele de bază la terapiile experimentale. Parkinsonism Relat Disorder. 2020; 73:94–104.
33. Dawson VL, Dawson TM. Terapii promițătoare de modificare a bolii pentru boala Parkinson. Medicină translațională a științei. 2019; 11(520):eaba1659.
34. Eigenmann DE, Xue G, Kim KS, Moses AV, Hamburger M, Oufir M. Studiu comparativ a patru linii de celule endoteliale capilare ale creierului uman imortalizate, hCMEC/D3, hBMEC, TY10 și BB19 și optimizarea condițiilor de cultură, pentru un model in vitro de barieră hematoencefalică pentru studiile de permeabilitate a medicamentelor. Fluide și bariere ale SNC. 2013; 10(1):33.
35. McCarthy RC, Kosman DJ. Ceruloplasmina cu celule gliale și hepcidina reglează diferențial efluxul de fier din celulele endoteliale microvasculare ale creierului. Plus unu. 2014; 9(2):e89003.
36. Steimle BL, Smith FM, Kosman DJ. Purtătorii de soluți ZIP8 și ZIP14 reglează acumularea de mangan în celulele endoteliale microvasculare ale creierului și controlează nivelurile de mangan din creier. J Biol Chem. 2019; 294(50):19197–208.
37. Stins MF, Badger J, Sik Kim K. Invazia bacteriană și transcitoza în celulele endoteliale microvasculare ale creierului uman transfectate. Microb Pathog. 2001; 30(1):19–28.
38. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. A First in Human Study of PBT434, a Novel Small Molecule Inhibitor of -Synuclein Aggregation (S4.001). Neurologie. 2019; 92(15 Supliment):S4.001.
39. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. A Phase 1 Study of PBT434, a Novel Small Molecule Inhibitor of -Synuclein Aggregation, in Adult and Older Adult Volunteers (4871). Neurologie. 2020; 94(15 Supliment):4871.
40. McCarthy RC, Kosman DJ. Activarea expresiei ceruloplasminei celulelor de glioblastom C6 de către interleukine derivate din endotelia umană învecinată într-un sistem model de barieră hemato-encefalică in vitro. Comunicare și semnalizare celulară: CCS. 2014; 12:65.
41. McCarthy RC, Park YH, Kosman DJ. sAPP modulează efluxul de fier din celulele endoteliale microvasculare ale creierului prin stabilizarea feroportinei exportatoare de fier feros. Rapoarte EMBO. 2014; 15(7):809–15. https://doi. org/10.15252/embr.201338064 PMID: 24867889
42. Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, Camaschella C. Two to Tango: Regulation of Mammalian Iron Metabolism. Celulă. 2010; 142(1):24–38. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.06.028 PMID: 20603012
43. Zhou ZD, Tan EK. Calea de semnalizare a proteinei de reglare a fierului (IRP)-element sensibil la fier (IRE) în bolile neurodegenerative umane. Neurodegenerarea moleculară. 2017; 12(1):75. https://doi.org/10. 1186/s13024-017-0218-4 PMID: 29061112
44. Crichton RR, Dexter DT, Ward RJ. Metabolismul fierului cerebral și perturbarea acestuia în bolile neurologice. J Transm. Neural. 2011; 118(3):301–14. https://doi.org/10.1007/s00702-010-0470-z PMID: 20809066
45. Patel SJ, Frey AG, Palenchar DJ, Achar S, Bullough KZ, Vashisht A, et al. Un complex de însoțitori PCBP1-BolA2 furnizează fier pentru ansamblul clusterului citosolic [2Fe{-2S]. Nat Chem Biol. 2019; 15(9):872–81. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0330-6 PMID: 31406370
46. Mukhopadhyay CK, Mazumder B, Fox PL. Rolul factorului inductibil de hipoxie-1 în activarea transcripțională a ceruloplasminei prin deficit de fier. J Biol Chem. 2000; 275(28):21048–54.
47. Strowitzki MJ, Cummins EP, Taylor CT. Hidroxilarea proteinelor prin hidroxilaze cu factor inductibil de hipoxie (HIF): unică sau omniprezentă? Celulele. 2019; 8(5).
48. De Domenico I, Vaughn MB, Li L, Bagley D, Musci G, Ward DM, et al. Mobilizarea feritinei mediată de ferroportină precede degradarea feritinei de către proteazom. Embo j. 2006; 25(22):5396–404.
49. McCarthy RC, Kosman DJ. Ferroportina și activitatea feroxidazei exocitoplasmatice sunt necesare pentru efluxul de fier al celulelor endoteliale microvasculare cerebrale. Jurnalul de chimie biologică. 2013; 288(24):17932– 40.
50. McCarthy RC, Kosman DJ. Analiza mecanică a acumulării de fier de către celulele endoteliale ale BBB. Biometale. 2012; 25(4):665–75.
51. Kosman DJ. Telos de metalo-reducere și metalo-oxidare în traficul eucariote de fier și cupru. Metalomica. 2018; 10(3):370–7. https://doi.org/10.1039/c8mt00015h PMID: 29484341
52. Aschemeyer S, Qiao B, Stefanova D, Valore EV, Sek AC, Ruwe TA, et al. Analiza structură-funcție a feroportinei definește locul de legare și un mecanism alternativ de acțiune al hepcidinei. Sânge. 2018; 131(8):899–910.
53. Ganz T, Nemeth E. Hepcidin și homeostazia fierului. Biochim Biophys Acta. 2012; 1823(9):1434–43.
54. Qiao B, Sugianto P, Fung E, Del-Castillo-Rueda A, Moran-Jimenez MJ, Ganz T, et al. Endocitoza feroportinei indusă de hepcidină este dependentă de ubiquitinarea feroportinei. Cell Metab. 2012; 15(6):918–24.
55. Fung E, Chua K, Ganz T, Nemeth E, Ruchala P. Minihepcidinele derivate de tiol păstrează activitatea biologică. Bioorg Med Chem Lett. 2015; 25(4):763–6.
Danielle K. BaileyID% 2c Whitney Clark% 2c Daniel J. Kosman
Departamentul de Biochimie, Școala Jacobs de Medicină și Științe Biomedicale, Universitatea de Stat din New York din Buffalo, Buffalo, NY, Statele Unite ale Americii
