AKT activat de precondiționare controlează toleranța neuronală la ischemie prin calea MDM2–p53Ⅰ

Abstract

Unul dintre cele mai importante mecanisme de neuroprotecție mediată de precondiționare este atenuarea apoptozei celulare, inducerea toleranței creierului după ischemia prejudiciabilă ulterioară. În acest context, calea de semnalizare antiapoptotică PI3K/AKT joacă un rol cheie în reglarea diferențierii și supraviețuirii celulelor.

Click pentru cistanche tubulosa pudra pentruneuroprotecție

Se știe că AKT activ crește expresia dublu minute-2 (MDM2), o E3-ubiquitin ligază care destabilizaază p53 pentru a promova supraviețuirea celulelor canceroase. În neuroni, am arătat recent că interacțiunea MDM2-p53 este potențată de precondiționarea farmacologică, bazată pe stimularea subtoxică a receptorului de glutamat NMDA, care previne apoptoza neuronală indusă de ischemie.

Cu toate acestea, nu se știe dacă acest mecanism contribuie la toleranța neuronală în timpul precondiționării ischemice (IPC). Aici, arătăm că IPC a indus fosforilarea mediată de PI3K a AKT la Ser473, care, la rândul său, a fosforilat MDM2 la Ser166. Această fosforilare a declanșat stabilizarea nucleară a MDM2, ducând la destabilizarea p53, prevenind astfel apoptoza neuronală la o insultă ischemică. Inhibarea căii PI3K/AKT cu wortmannin sau prin tăcere AKT a indus acumularea de MDM2 citosolic, abrogând neuroprotecția indusă de IPC.

Astfel, IPC îmbunătățește activarea căii de semnalizare PI3K/AKT și promovează toleranța neuronală prin controlul interacțiunii MDM2-p53. Descoperirile noastre oferă o nouă cale mecanică implicată în neuroprotecția indusă de IPC prin modularea semnalizării AKT, sugerând că AKT este o potențială țintă terapeutică împotriva leziunii ischemice. Cuvinte cheie: AKT; MDM2; p53; PI3K; toleranță ischemică; precondiționare

1. Introducere

La om, existența atacului ischemic tranzitoriu (AIT) a fost dezvăluită ca o stare precondiționată endogenă cu beneficiile rezultatelor funcționale la pacienții cu AVC [1–3]. Neuroprotecția endogenă indusă de un stimul ischemic scurt, subtoxic, cunoscut sub numele de precondiționare ischemică (IPC), este considerată o strategie în domeniul emergent al neuroprotecției împotriva leziunilor ischemice [4-6].

Dovezile arată că neuroprotecția promovată de IPC depinde de mecanismele de transcripție, traducere și post-translaționale, care modifică funcția proteinelor cheie după ischemie [6-11]. Cu toate acestea, mecanismul implicat în toleranța ischemică indusă de IPC (IT) nu a fost pe deplin clarificat în creierul uman [12,13].

Dezvoltarea de noi abordări experimentale pentru înțelegerea neuroprotecției mediată de IPC reprezintă un instrument puternic de descifrare a mecanismelor endogene care stau la baza IT cerebrală [6], care au potențialul de a dezvălui noi ținte terapeutice menite să minimizeze leziunile cerebrale la pacienții cu AVC. În ultimele două decenii, moartea celulelor neuronale apoptotice s-a poziționat ca un mecanism esențial implicat în leziunea ischemică cerebrală [14–16]. În acest sens, protein kinaza B sau AKT, o serină/treonin kinază care necesită activarea unei fosfoinozitid kinază funcțională (PI3K) a fost considerată o țintă esențială pentru terapiile neuroprotectoare după ischemie [17,18].

Recent, am demonstrat că inhibarea căii de semnalizare PI3K/AKT crește susceptibilitatea neuronală la excitotoxicitate [19]. AKT este implicat într-o rețea complexă de semnalizare anti-apoptotică [20], ale cărei componente pot fi prezente în diferite locații subcelulare, în funcție de tipul de țesut [21,22]. În inimă, AKT a fost implicat în cardioprotecția promovată de precondiționare [23].

Dovezile arată, de asemenea, că AKT fosforilat promovează supraviețuirea neuronală la debutul ischemiei cerebrale [24]. Deși activarea AKT poate contribui la inducerea IT în creier [25], mecanismul exact care implică activarea acestuia mediată de IPC rămâne evaziv. În celulele tumorale, activarea căii de semnalizare PI3K/AKT duce la fosforilarea MDM2 la Ser166/186, care promovează translocarea nucleară a MDM2 [26,27] și sporește activitatea sa de ubiquitinare [28].

În nucleu, MDM2 se leagă de p53 și promovează ubiquitinarea acestuia și degradarea proteazomală ulterioară, care inhibă funcția p53 [29]. În condiții de stres, p53 ar putea declanșa, de asemenea, supraexprimarea MDM2, care, invers, suprimă activarea p53 într-o buclă de feedback negativ [30]. Inhibarea PI3K previne activarea AKT [31] și fosforilarea MDM2 în inima precondiționată [32].

În acest context, am constatat anterior că precondiționarea creierului in vivo a redus volumul infarctului după ocluzia tranzitorie a arterei cerebrale medii (tMCAO) prin creșterea expresiei nivelului proteinei MDM2. În consecință, complexul MDM2-p53 a atenuat activarea indusă de ischemie a căii de semnalizare p53/PUMA/caspaze-3 în neuronii corticali primari [33].

Aici, cercetăm rolul căii de semnalizare PI3K/AKT în toleranța neuronală mediată de IPC împotriva unei leziuni ischemice ulterioare, precum și mecanismul de bază și ne concentrăm în principal pe legătura potențială dintre activarea AKT și complexul MDM2-p53. .

2. Rezultate

2.1. Neuroprotecție promovată de IPC

Este mediată de fosforilarea AKT la Ser473, fosforilarea MDM2 la Ser166 și destabilizarea p53 Am descris anterior impactul interacțiunii MDM2-p53 asupra susceptibilității neuronale la ischemie [34] și IT [33]. Aici, am explorat rolul potențial al AKT asupra neuroprotecției mediată de IPC ca candidat pentru a fi implicat în calea MDM2-p53.

În primul rând, am confirmat că ischemia a promovat activarea AKT în neuroni, așa cum este demonstrat de fosforilarea AKT la Ser473. După cum se arată în Figura 1A, OGD scurtă (20 min) a indus în mod semnificativ expresia p(Ser473)AKT și MDM2, în timp ce nivelurile de proteină AKT au rămas nealterate (Figura S1A). Cu toate acestea, fosforilarea AKT nu a fost observată atunci când neuronii au fost supuși la OGD prelungit (90 min). Mai mult, nivelurile de proteină MDM2 au fost mai scăzute, ceea ce este în concordanță cu expresia mai mare a proteinei p53 așa cum se arată în Figura 1A.

Reglarea în funcție de timp a expresiei Mdm2 după OGD (Figura 1B) confirmă faptul că ischemia subacută poate fi importantă pentru a induce mecanisme care împiedică stabilizarea p53 după OGD, așa cum a fost descris anterior [33]. Am folosit OGD scurtă (20 min) urmată de 2 ore de reoxigenare ca model de IPC (Figura S1B) [33]; astfel, am analizat extracte neuronale colectate la 4 ore de reoxigenare după OGD (OGD/R) sau după OGD precedate de protocolul IPC (IPC plus OGD/R). În paralel, neuronii au fost incubați în setări de normoxie (Nx) sau de precondiționare (IPC) (Figura S1B).

Așa cum se arată în Figura 1C și Figura S1C, IPC a indus activarea timpurie a AKT, așa cum a fost relevat de fosforilarea la Ser473 [35], urmată de stabilizarea proteinei MDM2 și fosforilarea la Ser166. IPC a prevenit, de asemenea, stabilizarea p53 indusă de OGD/R (Figura 1C). Interesant, imaginile de imunofluorescență prezentate în Figura 1D au arătat că IPC a promovat fosforilarea AKT la Ser473 în neuroni, care s-au acumulat predominant în nucleu și a scăzut stabilizarea p53 după OGD/R (IPC plus OGD/R) în comparație cu neuronii neprecondiționați (OGD). /R).

În consecință, IPC a prevenit apoptoza neuronală și activarea caspazei-3 cauzate de OGD/R, măsurate prin citometrie în flux (Figura S1D) și, respectiv, prin teste de fluorimetrie (Figura S1E). Pentru a confirma rolul p53 în neuroprotecția mediată de IPC, am folosit neuroni care exprimă (tip sălbatic; greutate) sau nu (knockout; ko) proteina p53. Rezultatele noastre arată că neuronii cărora le lipsește p53 (Figura S1F) au fost mai rezistenți la apoptoza indusă de OGD decât neuronii p53 wt.

Mai mult, nivelurile de apoptoză în neuronii p53KO au fost similare cu cele observate în neuronii wt precondiționați (IPC plus OGD/R) (Figura S1G), confirmând astfel rolul cheie al destabilizarii p53 în neuroprotecția mediată de IPC [33]. Rezultatele noastre arată că IPC a indus neuroprotecția împotriva unei insulte ischemice printr-un mecanism care implică fosforilarea AKT la Ser473, stabilizarea MDM2 și fosforilarea la Ser166 și destabilizarea p53.

2.2. IPC declanșează fosforilarea MDM2 la Ser166 prin calea PI3K/AKT

Calea de semnalizare PI3K/AKT este implicată în IT neuronală atât in vitro [36], cât și in vivo [37]. Cu toate acestea, rolul activării mediate de IPC a căii PI3K/AKT în reglarea complexului MDM2-p53 rămâne neexplorat. Pentru a clarifica acest lucru, neuronii au fost incubați cu inhibitorul ireversibil și specific al căii PI3K/AKT, wortmannin [19].

După cum se arată în Figura 2A, wortmannina a abrogat fosforilarea AKT (Ser473) AKT îmbunătățită cu IPC și destabilizarea p53, așa cum se arată în Figura 1D. Aceste rezultate sugerează o legătură directă între activarea AKT și inhibarea apoptozei neuronale mediate de p53-(Figura S1D) și activarea caspazei-3 (Figura S1E) indusă după OGD/R. Principalul regulator al stabilizării p53, MDM2, este o țintă a AKT [26], care fosforilează MDM2 la Ser166 și Ser186 [26]. Inhibarea PI3K cu wortmannin a prevenit fosforilarea ambelor (Ser473)AKT și (Ser166)MDM2 induse de IPC (Figura 2B).

Fosforilarea specifică mediată de Akt a MDM2 la Ser166 indusă de IPC a fost confirmată prin utilizarea unui mic ARN interferent (siRNA) special conceput împotriva proteinei AKT1 (siAkt), foarte exprimată în neuronii corticali și a cărui activitate este esențială pentru supraviețuirea neuronală după ischemie. 38]. După cum se arată în Figura 3, siAkt a redus nivelurile totale de proteine ​​​​AKT și p(Ser473)AKT în ziua 3 după transfecție, atât în ​​celulele HEK-293T (Figura 3A), cât și în neuronii corticali (Figura 3B).

Mai mult, declanșarea AKT (siAkt) a prevenit fosforilarea (Ser166) MDM2 (Figura 3B). Aceste rezultate demonstrează că calea de semnalizare PI3K/AKT activată de IPC promovează fosforilarea MDM2 la Ser166, care poate fi responsabilă pentru stabilizarea MDM2 și destabilizarea consecventă a p53 după leziunea ischemică.

2.3. AKT activat de IPC declanșează stabilizarea proteinei MDM2 nucleare după ischemie

Activarea AKT a fost implicată în translocarea nucleară a MDM2 în celulele tumorale [26]. Având în vedere relevanța stabilizării nucleare a MDM2 pentru supraviețuirea neuronală după ischemie [34] și, mai precis, rolul său neuroprotector în IPC [33], am decis să investigăm în continuare relevanța căii de semnalizare PI3K/AKT în reglarea localizării subcelulare a MDM2. proteină.

Astfel, neuronii sau celulele HEK-293T au fost transfectate cu proteină etichetată MDM2-(MDM2-GFP) umană. Petele reprezentative ale celulelor HEK-293T transfectate și imaginile de la neuroni care exprimă ectopic proteina MDM2 umană după patru condiții experimentale diferite (Nx, IPC, OGD/R și IPC plus OGD/R) sunt prezentate în Figura 4A și Figura S1H. , respectiv.

Expresia ectopică a MDM2- GFP a confirmat faptul că IPC promovează acumularea nucleară MDM2 în comparație cu neuronii ischemici neprecondiționați (OGD/R) sau normoxici (Nx) (Figura 4A, B), așa cum este relevat de cuantificarea raportului de fluorescență nucleară/citosolică (Figura S2B) și intensitatea fluorescenței nucleare a MDM 2-GFP (Figura S2C).

2.4. IPC promovează interacțiunea p(Ser473)AKT și MDM2, ceea ce îmbunătățește stabilizarea MDM2 în nucleu și reduce apoptoza neuronală indusă la ischemie

După demonstrarea rolului activării îmbunătățite de IPC a căii PI3K/AKT în stabilizarea nucleară a MDM2, am investigat în continuare dacă p(Ser473)AKT și MDM2 au interacționat în nucleu (Figura 6A). Imunoprecipitarea MDM2 din extracte de proteine ​​nucleare, urmată de imunoblot împotriva MDM2 și p(Ser473)AKT, a arătat că IPC a promovat interacțiunea dintre p(Ser473)AKT și MDM2, după OGD/R, prevenind astfel stabilizarea p53 nucleară indusă de OGD/R, așa cum se arată în intrarea nucleului (Figura 6A).

În cele din urmă, am studiat efectul dăunător al perturbării căii PI3K/AKT asupra apoptozei neuronale (Figura 6B). Inhibarea AKT a contracarat efectul protector al IPC înainte de OGD, ceea ce confirmă rolul neuroprotector al AKT-MDM2 în contextul IT. Rezultatele noastre, astfel, demonstrează că IPC induce fosforilarea și activarea AKT, care promovează fosforilarea MDM2 la Ser166 și translocarea nucleară, unde interacționează cu p(Ser473)AKT. Acest mecanism poate contribui la stabilizarea nucleară îmbunătățită a MDM2, care joacă un rol esențial în toleranța ischemică indusă de IPC.

Cum protejează Cistanche neuronii?

Există unele dovezi care sugerează că Cistanche poate proteja neuronii prin reducerea apoptozei (moartea celulară programată) și promovarea supraviețuirii neuronale. Apoptoza este un proces natural care are loc în organism pentru a îndepărta celulele deteriorate sau nedorite, dar poate fi dăunătoare atunci când are loc în mod excesiv sau inadecvat. S-a descoperit că Cistanche inhibă apoptoza în studiile de laborator și acest efect poate ajuta la protejarea neuronilor de deteriorare.

În plus, Cistanche conține o serie de compuși bioactivi care s-au dovedit a avea efecte neuroprotectoare. De exemplu, conține echinacozidă, despre care s-a demonstrat că protejează neuronii de stresul oxidativ și inflamație. De asemenea, conține acteozidă, care s-a dovedit a avea proprietăți antiinflamatorii și antioxidante.

Va urma...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1 , Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1 , Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Angeles Almeida 1, 2,3 și Maria Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Institutul de Biologie Funcțională și Genomică, Universitatea din Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Spania; eibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); irene_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Institutul de Cercetări Biomedicale din Salamanca, Spitalul Universitar din Salamanca, Universitatea din Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Spania

3 Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Universitatea din Salamanca, 37007 Salamanca, Spania 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Spania * Corespondență: mdesteban@usal.es ; Tel.: plus 34-923-29-4908