Partea Ⅰ: AKT1 mitocondrial tubular este activat în timpul leziunii de reperfuzie ischemică și are un rol critic în predispoziția la boli renale cronice.
Apr 03, 2023
Abstract
Disfuncția tubulară renală poate duce la leziuni renale acute și transformarea în boală cronică de rinichi. Deși mitocondriile tubulare sunt asociate cu patofiziologia insuficienței renale, mecanismul este neclar. Aici, demonstrăm că leziunea ischemiei-reperfuzie induce translocarea acută și activarea proteinei kinazei B mitocondriale (cunoscută și ca AKT1) în tubii renali. Am emis ipoteza că semnalizarea mitocondrială AKT1 ar putea preveni dezvoltarea leziunii renale acute și a bolii renale cronice ulterioare. Pentru a testa această predicție, am folosit strategia Cre-Lox pentru a genera două noi tulpini de șoarece transgenice specifice tubului renal care au indus expresia fie a AKT1 dominant-negativ țintit mitocondriilor, fie a AKT1 activ constitutiv. la șoarecii AKT1-negativi dominanti vizați de mitocondrii, inhibarea AKT1 mitocondrială a exacerbat negativ azotemia, leziunea tubulară, fibroza renală, glomeruloscleroza și supraviețuirea după leziunea ischemiei-reperfuzie. În schimb, la șoarecii AKT1 constitutiv activi vizați de mitocondrii, semnalizarea AKT1 mitocondrială tubulară îmbunătățită a atenuat prejudiciul renal, a protejat funcția renală și a îmbunătățit semnificativ supraviețuirea după leziuni de ischemie-reperfuzie (76,9% față de 20,8%, respectiv). Când AKT1 mitocondrial a fost inhibat, s-a constatat o creștere a respirației mitocondriale necuplate și a stresului oxidativ în tubii renali, susținând rolul disfuncției mitocondriale în patofiziologia insuficienței renale. Astfel, studiul nostru sugerează că calea de semnalizare mitocondrială tubulară AKT1 poate fi o țintă nouă pentru dezvoltarea de noi strategii pentru a preveni și trata mai bine leziunile renale.
Declarație translativă
Leziunea renală acută (IRA) și dezvoltarea ulterioară a bolii renale cronice (IRC) sunt probleme majore de sănătate. Am dezvoltat un model de șoarece transgenic și am determinat rolul activării AKT a mitocondriilor tubulare renale proximale în AKI și CKD. Acest mecanism de salvare al protecției renale poate fi o țintă nouă pentru dezvoltarea de noi strategii pentru a preveni și trata mai bine AKI și CKD. Studiile viitoare ar trebui să confirme implicarea căii de semnalizare AKT mitocondrială în leziunile renale umane și să exploreze țintele medicamentoase ale căii AKT1 mitocondriale.
Cuvinte cheie
Akt1 mitocondrial; Leziune prin refuzie ischemie; Leziuni renale acute; Boală cronică de rinichi;Extract de Cistanche.
Click aici pentru a obțineCistanche beneficii pentru rinichi
Introducere
Leziunea renală acută (IRA) și dezvoltarea ulterioară a bolii renale cronice (IRC) sunt probleme majore de sănătate. În prezent, tratamentele medicale specifice pentru aceste stări de boală sunt limitate, în parte din cauza lipsei de înțelegere a mecanismelor moleculare care stau la baza leziunii renale. Rinichiul este unul dintre organele cele mai solicitante de energie din organism, iar mitocondriile, care sunt necesare pentru a facilita transportul activ, pentru a menține gradienții electrochimici corespunzători și pentru a regla homeostazia fluidelor, sunt sursa primară de producție celulară de ATP prin fosforilarea oxidativă. tulburările în producția de ATP și disfuncția mitocondrială pot duce la creșterea producției de specii reactive de oxigen (ROS), care, la rândul său, afectează funcția celulelor renale și induce moartea celulei. Deși au fost raportate leziuni și disfuncții mitocondriale la pacienții cu boală renală și modele animale de leziune renală acută și cronică, cunoștințele despre rolul fiziopatologic al mitocondriilor în afectarea rinichilor rămân incomplete.
Funcția mitocondrială îmbunătățită poate preveni afectarea ischemiei-reperfuzie (IRI). În timpul fazei ischemice a IRI, epuizarea oxigenului inhibă transferul de electroni în lanțul respirator mitocondrial și reduce producția de ATP. Afluxul ulterior de ioni de sodiu și efluxul de protoni ajută la restabilirea pH-ului normal și poate promova supraviețuirea celulară prin restabilirea volumului intracelular În timpul reperfuziei, restabilirea fluxului sanguin este asociată cu creșterea speciilor reactive de oxigen (ROS), Ca2 plus fluxul către mitocondrii, pierderea Gradienții electrochimici transmembranari mitocondriali și activarea căilor apoptotice Aceste modificări intracelulare pot fi dăunătoare celulelor care supraviețuiesc după leziuni ischemice inițiale.
AKI este mai frecventă la pacienții spitalizați și poate accelera apariția unei noi CKD, exacerba CKD existente și poate duce la moarte renală. Mecanismele care stau la baza tranziției de la AKI la CKD sunt neclare. Studii recente pe animale sugerează că disfuncția tubulară renală joacă un rol important în progresia AKI la CKD, reflectând tranziția de la AKI la CKD la om. Înțelegerea căilor de semnalizare care reglează leziunea renală ne va permite să identificăm noi ținte terapeutice pentru a atenua leziunile renale și pentru a preveni progresia AKI la CKD.
Legătura dintre căile de semnalizare citoplasmatică și funcția mitocondrială în timpul leziunii renale este în mare măsură necunoscută. Funcția mitocondrială este strâns legată de semnalizarea citoplasmatică, alte organite și căi nucleare Laboratorul nostru a identificat activarea și translocarea AKT1 în mitocondrii ca un pas cheie în protejarea cardiomiocitelor de leziunile IRI prin reglarea complexelor de fosforilare oxidativă, creșterea eficienței fosforilării oxidative și reducerea ROS. Cu toate acestea, nu se cunoaște dacă IRI poate declanșa translocarea AKT1 activat din citoplasmă în mitocondriile din tubii renali. Dacă AKT1 mitocondrial poate fi activat în tubii renali ca răspuns la leziunea renală, ar fi important să se evalueze rolul fiziopatologic al AKT1 mitocondrial în dezvoltarea leziunii renale acute (AKI) și a bolii renale cronice (CKD). Aici, am folosit două modele de șoarece transgenic inductibile specifice tubului renal care modulează semnalizarea AKT1 mitocondrială in vivo și au demonstrat rolul protector al activării AKT1 mitocondriale tubulare renale în timpul IRI împotriva AKI și a dezvoltării ulterioare a CKD.
Suplimente de Cistanche
Rezultate
Activarea AKT1 mitocondrială în tubii renali după IRI
Am investigat mai întâi dacă IRI activează AKT1 în mitocondriile renale. În acest scop, am stabilit un model IRI renal prin ligatura arterei renale stângi timp de 30 de minute, urmată de nefrectomie contralaterală (Nx). Ligarea arterei renale stângi a fost inversată pentru a termina faza ischemică, s-a efectuat reperfuzia, iar rinichiul stâng a fost recoltat la intervalul de timp indicat.
Cortexul renal îmbogățit în tubuli renali a fost izolat și mitocondriile au fost preparate prin subfracționare. La reperfuzie, abundența pAKT1 și AKT1 mitocondrială a fost crescută, sugerând translocarea AKT1 activat în mitocondrii (Figura 1A). Acest lucru este similar cu ceea ce am observat în miocard în comparație cu controalele operate simulat sau controalele renale rezecate, unde AKT1 mitocondrial a fost semnificativ crescut 30-60 minute după reperfuzie (Figura 1A și B) (n= 11-15). PAKT1 mitocondrial a fost de asemenea crescut. Aceste rezultate sugerează că activarea și translocarea AKT1 induse de IRI în mitocondriile renale. Colorația iHC a confirmat fosforilarea AKT1 în tubii renali după IRI (Figura 1C). Colorarea de fond pentru pAKT1 a fost minimă în tubii renali ai controalelor operate simulat, în timp ce pAKT1 a fost dramatic crescut în tubii renali după IRI (Figurile 1C și 1D). Nu s-a observat pAKT1 în nicio regiune renală, cu excepția tubilor. pentru a confirma localizarea subcelulară a pAKT1 în tubuli, pAKT1 a fost colorat în combinație cu markeri mitocondriali. Co-localizarea semnificativă a pAKT1 și a mitocondriilor a fost observată în celulele tubulare renale la IRI (Figura 1E). Împreună, aceste rezultate sugerează translocarea IRI și activarea AKT1 în mitocondrii.
Figura 1. Translocarea acută indusă de reperfuzie de ischemie și activarea AKT1 în mitocondriile renale.
Generarea de șoareci transgenici cu expresie inductibilă specifică tubului renal a unui AKT negativ dominant în mitocondrii
Pentru a testa ipoteza că activarea AKT1 mitocondrială tubulară renală în timpul IRI protejează rinichiul de AKI și dezvoltarea ulterioară a CKD, am generat un model de șoarece transgenic care permite exprimarea indusă de tamoxifen (TAM) a țintirii mitocondriale specifice tubulare a AKT1 dominant-negativ. AKT1 negativ dominant (mdnAKT) și secvențele de țintire mitocondriale au fost adăugate la capătul N-terminal. Expresia condiționată a tamoxifenului transgenelor AKT1 a fost mediată folosind pCALNL (vezi Materiale și Metode). Pentru a exclude efectele de confuzie asociate cu integrarea aleatorie a rețelelor de transgene în genom, o singură copie a transgenei a fost introdusă prin recombinare omoloagă în celule ES cu transgene țintite la Gt(ROSA) 26 sau locusul de pe un cromozom. Șoarecii cu două gene (KMDAKT) au fost obținuți prin încrucișarea șoarecilor mdnAKT induși de tam cu șoareci KSP-CreERT2 hemizigoți, în care activitatea Cre indusă de tam a fost condusă de promotorii calmodulinei 16 specifici celulei tubulare renale. Injecția de tam a indus activitatea Cre, mitocondriile izolate și proteinele mitocondriale separate prin SDS-PAGE pentru imunoblot. Rezultatele au arătat că TAM a indus cu succes expresia mutantului AKT1. Proteina mutantă a fost nedetectabilă la șoarecii KMDAKT, șoarecii KSPCreERT2 și șoarecii de tip sălbatic (injecție cu ulei de porumb).
Pentru a verifica expresia specifică rinichilor, proteinele mitocondriale au fost extrase din diferite țesuturi după injectarea TAM. mutantul AKT1 marcat cu el a fost exprimat numai în rinichi. Secțiunile de rinichi au fost colorate cu anticorpi anti-his-tag și Mitotracker mitocondrial pentru imagistica prin imunofluorescență. Rezultatele au arătat că toți mutanții AKT1 au fost colorați cu anticorp His-tag și localizați în mitocondrii. Nu au fost detectate mutații AKT1 în glomeruli. Activitatea enzimatică a AKT1 mitocondrial a fost analizată folosind GSK3 recombinant pentru a confirma un rol negativ major în mitocondriile tubilor KMDAKT tratați cu tam. Deoarece AKT1 mitocondrial tubular renal este activat de IRI, am comparat activitatea enzimatică a AKT1 în mitocondriile izolate de la șoareci tratați cu tam și șoareci tratați cu ulei de porumb după IRI. Rezultatele au arătat că activitatea AKT1 mitocondrială renală a fost inhibată semnificativ la șoarecii KMDAKT tratați cu TAM. Prin urmare, această linie de șoarece transgenic este un model bun pentru studierea rolului AKT1 în mitocondriile tubulare.
Beneficii Cistanche
Inhibarea AKT mitocondrială a tubului renal a agravat IRI in vivo
IRI a fost indusă în ischemia renală unilaterală. În ultima serie de experimente, AKT1 fosforilat a fost abia detectabil în mitocondriile tubilor renali proximali. Nu au fost observate diferențe semnificative în histologia renală, azotul ureic din sânge (BUN) și creatinina serică (Cr) la șoarecii KMDAKT injectați cu ulei de porumb și injectați cu tam, ceea ce sugerează că semnalizarea AKT1 mitocondrială nu are un rol semnificativ în structura și funcția renală la momentul inițial. înainte de inducerea IRI. Pentru a investiga dacă AKT1 mitocondrial joacă un rol protector în timpul IRI, IRI unilateral a fost utilizat pentru a induce AKI la șoarecii cu ulei de porumb sau la șoarecii TAM-KMDAKT. nu au existat diferențe în nivelurile BUN sau Cr obținute imediat după inducerea IRI, dar la șoarecii TAM-KMDAKT, atât nivelurile BUN cât și Cr au fost semnificativ crescute după 45 de zile. Aceste rezultate sugerează că activarea blocată a AKT1 mitocondrial în tubii renali în timpul IRI a exacerbat dezvoltarea tardivă a disfuncției renale. analiza histologică a secțiunilor renale colorate cu H&E a arătat că leziunea renală a fost exacerbată la șoarecii TAM-KMDAKT. Scorul Jablonski al leziunii tubulare renale a fost mai mare cu pierderea marginii periei tubulare, liză tubulară și mai multe resturi în lumenul tubular (p=0.018). Pentru a exclude efectul recombinazei TAM sau Cre, am analizat și șoarecii KSP/CreERT2 injectați cu TAM, iar scorurile Jablonski au fost similare la șoarecii cu ulei de porumb KMdakt și TAM-KSP/CreERT2 în ziua 7 după IRI (Figura 3D) (p{{{ 19}}.7613). Aceste date sugerează că descoperirile noastre nu au fost confundate de efectele recombinazei TAM sau Cre. La șoarecii TAM-KMDAKT după IRI, colorația cu tricrom Masson a arătat o zonă fibrotică mai mare (la sută) (p<0,001), însoțită de structuri tubulare dezordonate cu turnuri intra-luminale și resturi. Expresia col1a a fost crescută, în concordanță cu colorarea tricrom Masson. Expresia tGF nu a fost crescută, ceea ce sugerează că AKT1 mitocondrial nu a reglat răspunsul inflamator. După IRI, expresia markerului de leziune tubulară - KIM -1 a fost crescută în grupul TAM-KMDAKT, confirmând creșterea leziunii renale în grupul TAM-KMDAKT (p=0.002).
Colorația TUNEL a fost utilizată pentru a evalua apoptoza celulelor renale. Numărul de celule apoptotice a crescut semnificativ în tubulii (p{{0}}.{0054) și glomeruli (p<0,001) ai șoarecilor TAM-KMDAKT în comparație cu grupul de control. Se sugerează că inhibarea AKT1 mitocondrială tubulară în timpul IRI exacerbează moartea celulelor tubulare și leziunea glomerulară. În concordanță cu aceasta, activarea atât a caspazei 9 (promotorul) cât și a caspazei 3 (executorul) a fost crescută semnificativ în celulele epiteliale tubulare renale TAM-KMDAKT. Pentru a explora în continuare modificările glomerulare cronice, a fost efectuată o analiză periodică de colorare a acidului Schiff (PAS) pe secțiuni de rinichi pentru a cuantifica glomeruloscleroza. Deși nu a fost observată nicio diferență în glomeruloscleroză la 7 zile după IRI (p=0.2634), la șoarecii TAM-KMDAKT s-a găsit mai multă glomeruloscleroză la 45 de zile după IRI (p<0,001). Această descoperire sugerează că calea de semnalizare AKT mitocondrială tubulară renală poate regla formarea cicatricilor glomerulare în timpul dezvoltării CKD. Analiza de supraviețuire Kaplan-Meier a arătat efectul inhibării AKT mitocondriale tubulare asupra rezultatului IRI. Supraviețuirea a fost redusă după IRI la șoarecii TAM-KMDAKT în comparație cu martori (p=0.0013).
Rata de supraviețuire a șoarecilor TAM-KMDAKT a fost semnificativ mai mică decât cea a martorilor în 7 zile după IRI, dar nivelurile BUN/Cr ale șoarecilor TAM- și ulei de porumb-KMDAKT au fost similare în această perioadă. Modificările raportate BUN/Cr la șoarecii tratați cu TAM pot fi subestimate din cauza indisponibilității datelor BUN/Cr de la șoarecii morți. În plus, mortalitatea mai mare la șoarecii TAM-KMDAKT poate fi cauzată de disfuncția organului distal (plămân, inimă, creier) și nu doar modificări ale BUN/Cr.
Rolul AKT1 mitocondrial tubular a fost, de asemenea, evaluat la șoarecii femele KMDAKT. BUN/Cr seric și histologia renală au fost relativ mai mari la șoarecii femele TAM-KMDAKT la 45 de zile după IRI. Nu a fost observat nici un efect sexual semnificativ.
Cistanche din plante
REFERINȚE
1. Yang JY, Deng W, Chen Y, și colab. Deteriorarea translocației și activarea mitocondriale Akt1 a atenuat activitatea complexului V de fosforilare oxidativă mitocondrială în miocardul diabetic. J Mol Cell Cardiol. 2013;59:167–175.
2. Wang Z, Ying Z, Bosy-Westphal A, et al. Ratele metabolice specifice ale organelor și țesuturilor majore de-a lungul vârstei adulte: evaluarea prin modelul mecanicist al consumului de energie în repaus. Am J Clin Nutr. 2010;92(6):1369–77.
3. Li SY, Susztak K. Rolul receptorului activat de proliferarea peroxizomului Gamma Coactivator 1alpha (PGC-1alfa) în boala renală. Semin Nefrol. 2018;38(2):121–6.
4. Portilla D, Dai G, McClure T, et al. Modificări ale PPARalpha și ale coactivatorului său PGC-1 în insuficiența renală acută indusă de cisplatină. Rinichi Int. 2002;62(4):1208–18.
5. Forbes JM. Mitocondriile – Jucători puternici în funcția rinichilor? Tendințe Endocrinol Metab. 2016;27(7):441–4425.
6. Szeto HH, Liu S, Soong Y, et al. Îmbunătățirea bioenergeticii mitocondriale în condiții ischemice crește toleranța la ischemie caldă în rinichi. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308(1):F11– F21.6.
7. Kalogeris T, Baines CP, Krenz M, et al. Biologia celulară a leziunilor de ischemie/reperfuzie. Int Rev Cell Mol Biol. 2012;298:229–317.
8. Gracia-Sancho J, Casillas-Ramirez A, Peralta C. Căile moleculare în protejarea ficatului de leziuni de ischemie/reperfuzie: o actualizare din 2015. Clin Sci (Londra). 2015;129(4):345–62.
9. Vezi EJ, Jayasinghe K, Glassford N, et al. Riscul pe termen lung de rezultate adverse după leziunea acută a rinichilor: o revizuire sistematică și meta-analiză a studiilor de cohortă folosind definiții consensuale ale expunerii. Rinichi Int. 2019;95(1):160–72.
10. Szeto HH, Liu S, Soong Y, et al. Protecția mitocondriilor după ischemia acută previne reglarea prelungită a IL-1beta și IL{-18 și oprește CKD. J Am Soc Nephrol. 2017;28(5):1437–49.
11. Tran MT, Zsengeller ZK, Berg AH și colab. PGC1alpha conduce biosinteza NAD, legând metabolismul oxidativ de protecția renală. Natură. 2016;531(7595):528–32.
12. Tait SW, Green DR. Mitocondriile și semnalizarea celulară. J Cell Sci. 2012;125(Pt 4):807–815.
13. Deng W, Leu HB, Chen Y, et al. Protein kinaza B (PKB/AKT1) a format complexe de semnalizare cu proteinele mitocondriale și a prevenit disfuncția energiei glicolitice în cardiomiocitele cultivate în timpul leziunii de ischemie-reperfuzie. Endocrinologie. 2014;155(5):1618–28.
14. Kanegae Y, Lee G, Sato Y, et al. Activarea eficientă a genei în celulele de mamifere prin utilizarea adenovirusului recombinant care exprimă recombinaza Cre specifică locului. Acizi nucleici Res. 1995;23(19):3816–21.
15. Matsuda T, Cepko CL. Expresia controlată a transgenelor introduse prin electroporare in vivo. Proc Natl Acad Sci US A. 2007 1 16;104(3):1027–32.
16. Lee SA, Cozzi M, Bush EL, et al. Disfuncție de organ la distanță în leziunea renală acută: o revizuire. Am J Rinichi Dis. 2018;72(6):846–856.
Hugo YH Lin1,2,3,4, Yummy Chen1, Yu-Han Chen1, Albert P. Ta1,2, Hsiao-Chen Lee1,5, Grant R. MacGregor6, Nosratola D. Vaziri1,2, Ping H. Wang1,2,7
1. Centrul de Diabet UC Irvine și Departamentul de Medicină, Universitatea din California, Irvine, California
2. Departamentul de Fiziologie și Biofizică, Universitatea din California, Irvine, California
3. Departamentul de Medicină, Universitatea Medicală Kaohsiung, Kaohsiung, Taiwan
4. Departamentul de Medicină Internă, Spitalul Municipal Kaohsiung Ta-Tung, Taiwan
5. Departamentul de Chirurgie Plastică, Universitatea Medicală Kaohsiung, Kaohsiung, Taiwan
6. Departamentul de dezvoltare și biologie celulară, Universitatea din California, Irvine, California
7. Departamentul de Diabet, Endocrinologie și Metabolism, Centrul Medical Național City of Hope, Duarte, California
