Partea a doua DsbA-L interacționează cu VDAC1 în apoptoza celulelor tubulare mediată mitocondrion și contribuie la progresia bolii acute de rinichi

Rezultate

1. Leziunea ischemică a indus expresia DsbA-L în celulele BUMPT și rinichii șoarecilor și pacienților

Pentru a investiga dacă leziunea ischemică a indus expresia DsbA-L, am epuizat celulele BUMPT de ATP timp de 2 ore și apoi le-am permis să se recupereze pentru o perioadă totală de 4 ore. Rezultatele RT-qPCR și imunoblot au indicat că expresia DsbA-L a fost indusă la I/R 2-0, a atins un vârf la I/R 2-2 și apoi a scăzut treptat la nivelurile observate la I/R 2-0 (Figura 1a, e și i). Colorarea prin imunofluorescență a DsbA-L a confirmat în continuare aceste constatări și a indicat că DsbA-L este exprimat predominant în citoplasma celulelor BUMPT (Figura 1 m și n). Am detectat în continuare expresia DsbA-L la șoarecii C57BL/6 tratați cu ischemie (28 min) și leziuni de reperfuzie (24 ore și 48 ore). Rezultatele RT-PCR și imunoblot au indicat că expresia DsbA-L a fost indusă atât în ​​cortex, cât și în medula exterioară a rinichiului șoarecilor după 24 de ore de reperfuzie și a atins un vârf la 48 de ore după reperfuzie (Figura 1 b, c, f, g). , j și k). Aceste constatări au fost confirmate în continuare de colorarea imunohistochimică a DsbAL (Figura 1 o și p). În cele din urmă, am investigat dacă nivelurile de expresie ale DsbA-L au fost induse la pacienții cu AKI cauzată de ischemie. Aceste rezultate au indicat că nivelurile de ARNm și proteine ​​​​DsbA-L au fost semnificativ crescute la pacienții cu AKI cauzată de ischemie în comparație cu pacienții cu MCD (Figura 1. d, h și l). Aceste rezultate au fost validate în continuare prin colorarea prin imunofluorescență a DsbA-L (Figura 1. q și r).

Figura 1. DsbA-L a fost indus de I/R în celulele BUMPT și rinichii șoarecilor și pacienților. Modelul I/R în celulele BUMPT a fost indus de 10 mM antimicină A și 1,5 mM ionofor de calciu timp de 2 ore și recuperat timp de 0, 2 și 4 ore. Modelul de șoareci I/R a fost indus de ischemie renală bilaterală timp de 28 de minute și reperfuzie timp de 24 și 48 de ore. Au fost colectate probe de biopsie renală de la pacienți cu AKI indusă de I/R și de la pacienți cu boala cu modificări minime (MCD). (ad) Detectarea RT-qPCR a exprimării DsbA-L în celulele BUMPT, țesutul cortical al rinichilor de șoareci și din pacienții medulare și renale cu sau fără afecțiune I/R. (e-h) Analiza imunoblot a DsbA-L și b-tubulinei în celulele BUMPT sub modelul I/R în celulele BUMPT, țesutul cortical, din pacienții medulare și rinichi. (i-l) Analiza densitometrică a expresiei proteinei DsbA-L și b-tubulină. (m, o și q) Imunofluorescența și colorarea imunohistochimică a DsbA-L în celulele BUMPT și rinichii șoarecilor și, respectiv, pacienților cu sau fără afecțiune I/R. (n, p și r) Analiza de cuantificare a colorării DsbA-L. Mărire originală x 400. Scar Bar: 10 µM în m100 µM în o și q. Fiecare experiment (e-h, m, o și q) a fost repetat de 6 ori independent, cu rezultate similare. Testele t Student cu două cozi au fost utilizate pentru comparații cu două grupuri. (a-d, i-l, n, p și r). # p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group.

Faceți clic aici pentru a afla beneficiile Cistanche

2. Leziunea renală indusă de IR, apoptoza celulelor tubulare și deteriorarea mitocondrială au fost atenuate la șoarecii PT-DsbA-LKO

Colegii de pui ai șoarecilor PT-DsbA-L-WT și PT-DsbA-L-KO au fost tratați cu sau fără ischemie (28 min) și leziuni de reperfuzie (24 ore și 48 ore). În urma acestui tratament, am obținut probe de sânge și mostre de țesut renal pentru o examinare ulterioară. Din punct de vedere funcțional, deteriorarea funcției renale indusă de I/R a fost caracterizată prin creșterea nivelurilor de azot ureic din sânge (BUN) și creatinină la șoarecii PT-DsbA-L-WT; acest efect a fost atenuat semnificativ la șoarecii PT-DsbA-L-KO (Figura 2a și b). Analizele histologice și TUNEL au verificat, de asemenea, că I/R a indus leziuni tisulare notabile și apoptoză la șoarecii PT-DsbA-L-WT, deși acest lucru a fost ameliorat la șoarecii PT-DsbA-L-KO (Figura 2c, d, f, și g). În mod interesant, analizele de microscopie electronică (EM) au indicat că șoarecii PT-DsbA-L-KO au prezentat o atenuare marcată a leziunilor mitocondriale induse de I/R (Figura 2 e și h). Imunoblotting a verificat în continuare că șoarecii PT-DsbA-LKO au exprimat, de asemenea, niveluri mai scăzute de caspază scindată-3, rate mai scăzute de acumulare de Bax în mitocondrii și niveluri reduse de eliberare a citocromului c (Cyt-c) în citosol (Figura 2) I-o). Rezultatele analizei RT-qPCR au demonstrat că PT-DsbA-L-KO a inversat reducerea NRF1 și PCG-1a cauzată de I/R (Figura 2 p și q), ceea ce a fost confirmat în continuare de analiza imunoblotării ( Figura 2 r- t). Aceste date au arătat că DsbA-L a jucat un rol esențial în AKI indusă de I/R.

Figura 2. Atenuarea leziunii renale induse de IR, apoptoza celulelor tubulare, deteriorarea mitocondriilor și expresia Bax, Cytc și a caspazei clivate la șoarecii PT-DsbA-L-KO. Arterele renale bilaterale ale șoarecilor littermate PT-DsbA-L-KO și PT-DsbA-L-WT au fost prinse timp de 28 de minute și apoi eliberate timp de 48 de ore pentru a stabili un model IR. (a) BUN (b) Creatinină serică (c) Colorare cu hematoxilină și eozină. (d) Secțiuni reprezentative ale celulelor pozitive TUNEL. (e) Detectarea cu microscopul electronic a morfologiei mitocondriilor. (f) Scorul de deteriorare tubulară. (g) Numărul de celule TUNEL-pozitive. (h) Scorul leziunilor mitocondriale. (i) Analiza imunoblot a expresiei caspazei clivate3 și DsbA-L și expresia BAX și Cyt-c în fracțiile mitocondriale și citosolice. b-tubulina și GAPDH au fost utilizate ca control al încărcării întregului lizat sau, respectiv, citosolic. COX IV a fost folosit ca control al încărcării mitocondriilor. (j- o) Analiza imaginii în tonuri de gri dintre ele. (p și q) Detectarea RT-qPCR a expresiei NRF1 și PCG-1a. (r) Analiza imunoblot a expresiei NRF1 și PCG-1a. (s și t) Analiza imaginii în tonuri de gri dintre ele. Mărire originală x 400 sau x 6000. Scar Bar: 100 uM în c&d 20 uM în e. Fiecare experiment (ce, I și r) a fost repetat de 6 ori independent, cu rezultate similare. ANOVA unidirecțională a fost utilizată pentru comparațiile cu grupuri multiple. (a, b, f- h, jo, pq&s- t). # p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-DsbA-L-WT with IR group.

Cistanche tubulosa

3. Apoptoza indusă de I/R mediată de DsbA-L în celulele BUMPT

Pentru a investiga în continuare dacă DsbA-L mediază apoptoza în celulele BUMPT induse de I/R, am transfectat celulele BUMPT cu siARN DsbA-L și apoi am epuizat aceste celule din ATP timp de 2 ore; celulele au fost apoi lăsate să se recupereze timp de 2 ore. Analizele FCM au constatat că siRNA DsbA-L a atenuat semnificativ apoptoza indusă de I/R în celulele BUMPT (Figura 3a). Analizele de imunoblotting au confirmat în continuare că ARNsi DsbA-L a suprimat în mod semnificativ creșterea indusă de I/R a expresiei caspazei scindate-3, acumularea crescută de Bax în mitocondrii și eliberarea crescută de Cyt-c în citosol (Figura 3 b-h). Rezultatele analizei RT-qPCR au arătat că I/R a suprimat expresia NRF1 și PCG-1a, care a fost inversată de ARNsi DsbA-L (Figura 3 i și j). Rezultatele imunoblotării au fost în concordanță cu constatările RT-qPCR (Figura 3 km). În schimb, plasmida DsbA-L a îmbunătățit apoptoza indusă de I/R în celulele BUMPT, a crescut expresia caspazei scindate-3, a crescut acumularea de Bax și a crescut eliberarea Cyt-c în citosol (Figura 3 o- u). Rezultatele analizei RT-qPCR au indicat că I/R a suprimat expresia NRF1 și PCG-1a, care a fost îmbunătățită de plasmida DsbA-L (Figura 3 v și w). Rezultatele imunoblotării au confirmat în continuare constatările RT-qPCR (Figura 3 x-z). Aceste date au confirmat în continuare că DsbA-L a mediat procesul de apoptoză, precum și disfuncția mitocondrială în timpul leziunii ischemice.

Figura 3. DsbA-L a mediat expresia indusă de IR a caspazei3, BAX și Cyt-c scindate în celulele BUMPT. Plasmida și ARNsi de DsbA-L au fost transfectate în celule BUMPT și apoi expuse la epuizarea ATP timp de 2 ore și recuperare timp de 2 ore. (a&n) Analiza citometriei în flux a apoptozei celulelor BUMPT. (b&o) Imunobloturile au analizat expresia caspazei clivate3 și DsbA-L și expresia BAX și Cyt-c în fracțiile mitocondriale și citosolice. b-tubulina și GAPDH au fost utilizate ca control al încărcării întregului lizat sau, respectiv, citosolic. COX IV a fost folosit ca control al încărcării mitocondriilor. (c- h și q- u) Analiza imaginii în tonuri de gri dintre ele. (i,j și v, w) RT-qPCR detectează expresia NRF1 și PCG-1a. (k și x) Analiza imunoblot a expresiei NRF1 și PCG-1a. (l, m și y,z) Analiza imaginii în tonuri de gri dintre ele. Fiecare experiment (a, b, k, n, o și x) a fost repetat de 6 ori independent, cu rezultate similare. ANOVA unidirecțională a fost utilizată pentru comparațiile cu grupuri multiple. (c- j, c- m, p- w & y, z). # p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus scramble with the saline group. * P<0.05 versus scramble with IR group.

Supliment Cistanche

4. DsbA-L a interacționat cu VDAC1 în celulele BUMPT care au fost supuse epuizării ATP, precum și în rinichii șoarecilor și pacienților cu AKI

Rezultatele anterioare au sugerat că canalul anionic dependent de tensiune-1 (VDAC1), o proteină importantă a membranei mitocondriale exterioare, este implicată în apoptoza celulară36 Studiul nostru recent a raportat că DsbA-L este exprimat și în mitocondrii. Prin urmare, am emis ipoteza că DsbA-L a interacționat cu VDAC1 pentru a regla progresia AKI. Rezultatele imunoprecipitării (IP) au demonstrat că anticorpul anti-VDAC1 a tras în jos atât proteinele VDAC1, cât și DsbA-L, în timp ce anti-DsbA-L a precipitat atât DsbA-L, cât și VDAC1 în lizate întregi de control și grupuri I/R de celule BUMPT și rinichii de șoareci și rinichii pacienților (Figura 4a). În plus, lizatele mitocondriale ale celulelor BUMPT rinichii de șoareci și rinichii pacienților au fost, de asemenea, utilizate pentru co-IP de DsbA-L și VDAC1; constatările au fost în concordanță cu cele pentru întregul lizat (Figura 4b). Structura DsbA-L conține un domeniu de legare a nucleotidelor/domeniu ATPază (aminoacizi 1-51), un domeniu amino-terminal (NTD), o regiune elicoidală pentru dimerizare (aminoacizi 56-178) și un domeniu carboxil-terminal (CTD; aminoacizi 185-216) (Figura 4c). Pe baza structurii VDAC1, predicția software-ului a indicat că domeniul N-terminal (aminoacizii 1 până la 25) al VDAC1 poate interacționa cu DsbA-L (Figura 4d). Pentru a clarifica ce domenii ale VDAC1 pot interacționa cu DsbA-L, am construit trei plasmide pentru HA-VDAC1 cu aminoacizi 1- 75, aminoacizi 76-1098 și gena completă (Fig 4e). Anticorpul anti-HA a precipitat DsbA-L în grupuri care prezintă VDAC1 cu aminoacizi 1-75 și gena completă, dar nu cu VDAC1 și plasmida care conține aminoacizi 76-1098. Acest lucru a indicat că DsbA-L a interacționat cu regiunea VDAC1 care conține aminoacizi 1-75 (Figura 4f). Pentru a investiga în continuare ce regiuni specifice ale VDAC1 au interacționat cu DsbA-L, am transfectat celulele BUMPT cu HA-Tag al plasmidelor VDAC1 cu D9-13, 22-27, D39-45, {{59 }}, D9-13, 22-27, 39-45, 55-57. Rezultatele IP au demonstrat că anticorpul anti-HA a precipitat DsbA-L numai cu plasmidele D39-45 și 55-57, și nu cu plasmidele D{{9-13 și {22-27 (vezi Figura 4g ). Acest lucru a demonstrat în continuare că DsbA-L a interacționat cu aminoacizii 9-13 și 22-27 ai VDAC1. Figura 4g prezintă un model care arată modul în care DsbA-L interacționează cu aminoacizii 9-13 și 22-27 ai VDAC1 (Figura 4g). În mod colectiv, aceste date indică faptul că DsbA-L interacționează cu aminoacizii 9-13 și 22-27 ai VDAC1.

Figura 4. Interacțiunea dintre DsbA-L și VDAC1 în celulele BUMPT cu sau fără depleție de ATP și rinichii șoarecilor I/R renali și pacienților. (a&b n=3 per grup) Lizatul integral sau mitocondrial a fost extras pentru coimunoprecipitarea reciprocă a DsbA-L și VDAC1 în celulele BUMPT tratate cu epuizare și recuperare ATP și rinichii șoarecilor și pacienților AKI induși de I/R. (cn=3 per grup) Domeniile funcționale și structura DsbA-L. (dn=3 per grup) Modelul de predicție al interacțiunii DsbA-L și VDAC1. (e-gn=3 per grup) Imunoprecipitatele anti-HA au fost analizate pentru HA și apoi detectate pentru DsbA-L folosind imunoblot.

Herba Cistanche

5. Co-localizarea DsbA-L sau VDAC1 în mitocondrii și co-localizarea DsbA-L și VDAC1 în (i) celulele BUMPT epuizate de ATP și (ii) rinichii șoarecilor și pacienților

Pentru a confirma rezultatele noastre IP, am efectuat un test de co-localizare. Microscopia confocală cu imunofluorescență a demonstrat că DsbA-L sau VDAC1 s-au localizat în mitocondriile celulelor BUMPT și în rinichii atât ai șoarecilor simulați, cât și ai pacienților cu MCD și că acest efect a fost îmbunătățit în continuare în celulele BUMPT care au fost epuizate de ATP și în rinichii șoarecilor. și pacienții cu AKI (Figura 5 a, b, d, e, g și h). Interesant, microscopia confocală cu imunofluorescență a verificat că semnalul de co-localizare al DsbA-L și VDAC1 în celulele BUMPT și rinichii șoarecilor simulați și ai pacienților cu MCD a fost relativ slab. Cu toate acestea, semnalul de co-localizare a fost crescut semnificativ în celulele BUMPT care au fost epuizate de ATP și în rinichii șoarecilor și pacienților cu AKI (Figura 5 c, f și i). Colectiv, aceste date oferă dovezi suplimentare pentru a susține interacțiunea dintre DsbA-L și VDAC1 în mitocondrii.

Figura 5. Colocalizarea DsbA-L și VDAC1 în mitocondriile celulelor BUMPT și rinichii șoarecilor și pacienților AKI. (a, d&g n=4 pe grup) Localizarea DsbA-L în mitocondrii în celulele BUMPT cu sau fără epuizare și recuperare ATP, rinichii șoarecilor modelează în grupurile simulate și I/R, precum și MCD și pacienți I/R. (b, e&h n=4 pe grup) Localizarea VDAC1 în mitocondrii în celulele BUMPT cu sau fără epuizare și recuperare ATP, rinichii șoarecilor modelează în grupurile simulate și I/R, precum și MCD și I/ R. (c, f&i n=4 pe grup) Co-localizarea DsbA-L și VDAC1 în mitocondrii în celulele BUMPT cu sau fără epuizare și recuperare ATP, modelul rinichilor de șoareci în grupurile simulate și I/R precum și pacienții cu MCD și I/R.

6. Apoptoza celulelor BUMPT mediată de VDAC1-, cauzată de ischemie-reperfuzie

Apoi, am încercat să determinăm dacă VDAC1 a fost implicat în procesul de apoptoză indusă de I/R în celulele BUMPT. Rezultatele imunoblotting au indicat că expresia VDAC1 a fost indusă la I/R 2-0 și a atins un vârf la I/R 2-2, înainte de a se reduce treptat la nivelurile observate la I/R 2-0 ( Figura 6 a și b). Analiza FCM a arătat că I/R a indus apoptoza în celulele BUMPT; acest efect a fost atenuat prin aplicarea siRNA VDAC1 (Figura 6c). Rezultatele imunoblotting au verificat în continuare că ARNsi VDAC1 a ameliorat semnificativ creșterea indusă de I/R a expresiei caspazei scindate-3, acumularea crescută de Bax în mitocondrii și eliberarea crescută de Cyt-c în citosol (Figura 6d- k). Prin contrast, modificările de mai sus au fost îmbunătățite de supraexprimarea plasmidei VDAC1 (Figura 6 l-s). Împreună, aceste date au demonstrat că VDAC1-a mediat apoptoza indusă de I/R în celulele BUMPT.

Figura 6. Expresia indusă de IR a caspazei clivate3, BAX și Cyt-c în celulele BUMPT a fost mediată de VDAC1. SiARN sau plasmida VDAC1 a fost transfectată în celule BUMPT și apoi expus la epuizarea ATP timp de 2 ore și recuperare timp de 2 ore. (a) Analiza imunoblot a VDAC1 și b-tubulinei în celulele BUMPT. (b) Analiza imaginii în tonuri de gri dintre ele (c) Analiza citometriei în flux a apoptozei celulelor BUMPT. (d) Imunobloturile au analizat expresia caspazei clivate3, VDAC1 și DsbA-L și expresia BAX și Cyt-c în fracțiile mitocondriale și citosolice. b-tubulina și GAPDH au fost utilizate ca control al încărcării întregului lizat sau, respectiv, citosolic. COX IV a fost folosit ca control al încărcării mitocondriilor. (ek) Analiza imaginii în tonuri de gri dintre ele. (i) Analiza citometriei în flux a apoptozei celulelor BUMPT. (m) Imunobloturile analizează expresia caspazei clivate3, VDAC1 și DsbAL și expresia BAX și Cyt-c în fracțiile mitocondriale și citosolice. b-tubulina și GAPDH au fost utilizate ca control al încărcării întregului lizat sau, respectiv, citosolic. COX IV a fost folosit ca control al încărcării mitocondriilor. (ns) Analiza imaginii în tonuri de gri dintre ele. Fiecare experiment (a, c, d, l & m) a fost repetat de 6 ori independent cu rezultate similare. Testele t Student cu două cozi au fost utilizate pentru comparații cu două grupuri. (b), ANOVA unidirecțională a fost utilizată pentru comparațiile cu grupuri multiple. (e- k și n- s). # p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group.# P<0.05 versus scramble with the saline group. * P<0.05 versus scramble with IR group.

Extract de Cistanche

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h și Dongshan Zhang a,b *

un Departament de Medicină de Urgență, Republica Populară Chineză

b Institutul de Medicină de Urgență și Boli Dificile, Spitalul II Xiangya, Universitatea Central South, Changsha, Hunan 410011, Republica Populară Chineză

c Departamentul de Oftalmologie, Republica Populară Chineză

d Departamentul de Chirurgie Urinară, Republica Populară Chineză

e Departamentul de Chirurgie toracică, Republica Populară Chineză

f Departamentul de Chirurgie Generală, Spitalul II Xiangya, Republica Populară Chineză

g Departamentul de Sănătate Publică, Universitatea Central South, Changsha, Hunan, Republica Populară Chineză

h Departamentul de Endocrinologie, Spitalul Popular din Shenzhen, Cel de-al doilea colegiu medical clinic al Universității Jinan, Primul Spital afiliat al Universității de Știință și Tehnologie de Sud, Shenzhen, Republica Populară Chineză

1 Xiaozhou Li și Jian Pan au contribuit în mod egal la acest studiu