Partea 1: O abordare nouă pentru a îmbunătăți potențialul de regenerare al celulelor progenitoare endoteliale circulante la pacienții cu boală renală în stadiu terminal

Pentru mai multe informatii. a lua legaturatina.xiang@wecistanche.com

Abstract: Celulele progenitoare endoteliale (EPC) circulante derivate din măduva osoasă facilitează repararea vasculară în mai multe organe, inclusiv rinichii, dar sunt diminuate progresiv în stadiul terminalboală de rinichi(ESKD), care se corelează cu rezultatele cardiovasculare și mortalitatea asociată. Astfel, am determinat dacă îmbunătățirea efectelor de reparare a țesuturilor ale celulelor stromale mezenchimale (BM-MSC) derivate din măduva osoasă umană cu efectele vasculogenice ale relaxinei umane recombinate (RLX) ar putea promova proliferarea și funcționarea EPC. CD34 plus EPC au fost izolate din sângele pacienților sănătoși și ESKD, cultivate până la formarea tardivă a EPC-urilor, apoi stimulate cu mediu de condiție derivat din BM-MSC (CM; 25 la sută o), RLX (1 sau 10ng/mL) sau ambele tratamente combinate. În timp ce RLX singur a stimulat proliferarea EPC, formarea tubului capilar și vindecarea rănilor in vitro, aceste măsuri au fost îmbunătățite mai rapid și semnificativ de efectele combinate ale CM și RLX derivate din BM-MSC în EPC derivate atât de la pacienți sănătoși, cât și de la ESKD. Aceste descoperiri au implicații clinice importante, identificând o nouă terapie combinată care poate restabili și îmbunătăți numărul și funcționarea EPC la pacienții cu ESKD.

Cuvinte cheie: celule progenitoare endoteliale; boală de rinichi în stadiu terminal; celule stem mezenchimale derivate din măduva osoasă; relaxină; vindecarea ranilor; angiogeneza; regenerare

Faceți clic aici pentru a afla mai multe despre cistanche de vânzare

1. Introducere

Boala cronică de rinichi(CKD) este o problemă de sănătate globală, definită ca o reducere a ratei de filtrare glomerulară (RFG) mai mică sau egală cu 60 ml/min/1,73 m², care duce adesea la stadiul terminal (stadiul V) de boală renală (ESKD; definită ca GFR mai mic sau egal cu 15 mL/min/1,73 m2)[2]. Caracteristicile patologice ale CKD includ atrofia tubulară asociată cu reduceri ale capilarelor renale și podocitelor, distrugerea celulelor endoteliale renale și dezvoltareafibroza renala[3,4]. Endoteliul renal este compromis în timpul acestor procese, ducând la afectarea angiogenezei și a funcției renale [5]. Ca urmare aafectarea rinichilor, celulele progenitoare endoteliale (EPC) derivate din măduva osoasă sunt recrutate în locurile de leziune pentru a facilita repararea țesuturilor [6]. EPC joacă roluri esențiale în maturarea și proliferarea celulelor endoteliale renale, integritatea vasculară și repararea endoteliului deteriorat. Cu toate acestea, cifrele EPC circulante sunt reduse progresiv la pacienții cu ESKD [7-9], ceea ce se corelează cu rezultate cardiovasculare adverse [9,10] și mortalitate pe termen lung.

S-a raportat că celulele stromale mezenchimale (MSC) promovează angiogeneza prin stimularea programării EPC. Cu toate acestea, în timp ce MSC-urile au fost evaluate în diferite studii clinice [13], capacitatea lor de a facilita regenerarea endotelială renală nu a fost investigată. Studii recente din laboratorul nostru au identificat potențialul terapeutic îmbunătățit al combinării MSC-urilor derivate din măduva osoasă (BM) umană cu un agent anti-fibrotic, și anume relaxină umană (genă-2) recombinată (serelaxină; RLX[14) în ameliorarea afectarea rinichilor,inflamaţieși fibroză în modelele preclinice de boală. În timp ce RLX singur poate stimula proliferarea EPC derivată din sânge uman și producția de oxid nitric (NO) in vitro și vasculogeneza la șoareci in vivo[18], rămâne necunoscut dacă efectele sale combinate cu BM-MSC ar putea accelera și/sau îmbunătăți EPC- angiogeneza derivată și vindecarea rănilor. Astfel, acest studiu a evaluat potențialul terapeutic al combinării mediilor condiționate (CM) derivate de RLX și BM-MSC asupra proliferării EPC, angiogenezei și vindecării rănilor sănătoase versus ESKD derivate de la pacient.

2. Materiale și metode

2.1.Izolarea și cultura EPC din sângele periferic

La primirea unui formular de consimțământ semnat al pacientului, aproximativ {{0}} ml de sânge de la martori bărbați sănătoși au fost colectați de la Serviciul de sânge al Crucii Roșii Australiane. Spre deosebire de aceasta, numai ~ 5 ml maxim de sânge la pacienții de sex masculin cu ESKD a fost recoltat de la Centrul Medical Monash din cauza stării lor de sănătate. Toate probele de sânge au fost prelucrate în 24 de ore de la timpul de recoltare. Toate probele de sânge au fost diluate cu 1 x soluție echilibrată de sare Hank (HBSS; Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) până la un volum total de 20 mL. Apoi, sângele a fost stratificat cu grijă peste 15 ml de Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Uppsala, Suedia) într-un tub Falcon de 50 ml (BD Biosciences, San Jose, CA, SUA) și centrifugat la 400× g timp de 40 de minute la temperatura camerei pentru a separa stratul leucos de alte componente, utilizând o metodă de separare a gradientului de densitate, așa cum a fost descris anterior [19,20]. În urma separării gradientului, stratul superior care conține plasmă și trombocite a fost îndepărtat prin introducerea cu atenție a unei pipete serologice, lăsând netulburat stratul de leucoplasmă care conține celule mononucleare din sângele periferic (PBMC), constând din celule progenitoare endoteliale (EPC). Peletul a fost resuspendat în 2 ml de Endothelial Cell Growth Media (EGM)-2 Microvascular (MV)Bullet Kit (produs #CC{-3162, Lonza, Hayward, CA, SUA); Suplimentat cu 5% ser fetal bovin (FBS), 0,04% hidrocortizon, 0,4% factor de creștere a fibroblastelor umane (hFGF) și 0,1% factor de creștere a endotelialului vascular (VEGF), factor de creștere asemănător R3-insulinei (IGF) )-1, acid ascorbic, factor de creștere epidermică uman (hEGF) și sulfat de gentamicină/amfotericină (GA-1000), pentru a cultiva EPC izolate. Celulele au fost numărate folosind un contor de celule automatizat CountessM (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) înainte de a fi însămânțate pe plăci/baloane de cultură acoperite cu fibronectină.

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50 celule/colonie) utilizând testul unității formatoare de colonii (CFU).

2.2. Prepararea mediului condiționat (CM) din BM-MSC cultivat

Deoarece adăugarea de BM-MSC la culturile EPC ar compromite efectele asociate EPC care trebuie măsurate, s-a decis că ar fi mai bine să se analizeze efectele CM derivate din BM-MSC asupra funcției EPC, așa cum a fost utilizat anterior pentru analiză. a altor obiective [19]. Pe scurt, BM-MSC au fost cultivate în Alpha-Minimum Essential Media (-MEM; Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia), suplimentat cu 16% ser fetal bovin (FBS) și 1% 200 mM L-glutamină și 1% penicilină/streptomicina. Odată ce celulele au atins confluența de ~ 80 la sută, BM-MSC-urile au fost în continuare sub-cultivate și placate într-o placă de 12-godeuri la o densitate de ~0,5 × 10 grade per godeu și menținute în cultură timp de 24-48 ore pentru a asigura atașarea celulară. Pentru a prepara medii condiționate (CM) din BM-MSC, pe scurt, celulele au fost spălate de trei ori cu 1 ml preîncălzit de 1 x HBSS. După etapele de spălare, 500 μL de ser și mediu bazal de celule endoteliale fără factor de creștere (EBM); Produsul #CC-3121.Lonza, Hayward, CA, SUA) a fost adăugat la celule și menținut în cultură la 5% CO, 37 grade pentru încă 24 de ore. La sfârșitul acestei perioade de incubare, CM a fost apoi colectat și centrifugat la 400 x g timp de 10 minute pentru a îndepărta orice resturi celulare. CM în alicote de 500 μL a fost păstrat la -80 grade până la utilizare ulterioară.

2.3. Teste funcționale

2.3.1. Tratamentul EPC tardive cultivate

Odată ce EPC-urile târzii au fost recoltate, au fost efectuate teste funcționale. Toate experimentele au fost efectuate în pasajele 3-6. Au fost efectuate teste funcționale pentru a investiga efectul (i) 25% medii condiționate derivate de BM-MSC (25% CM)[20];(ii)1 [RLX-1] sau 10 [RLX-10 ]ng/mL [18] RLX (reprezentând nivelurile circulante ale relaxinei H2 găsite la femeile gravide [21]); sau (i) efectele combinate ale 25% CM și 1 sau 10 ng/mL RLX; (iv) 20% FBS a fost utilizat ca control pozitiv asupra potențialului (angiogenic) de proliferare și formare a tubului al EPC tardive derivate de la pacienții martor . Grupurile de tratament au fost comparate cu celulele netratate.

2.3.2.Testul de viabilitate și proliferare

Viabilitatea și potențialul proliferativ al EPC-urilor târzii au fost determinate prin utilizarea {{0}}(4,5-dimetitiazol-2-il)-2,5- Testul de bromură de difenil tetrazoliu (MTT) conform instrucțiunilor producătorului (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australia). Pe scurt, ~5×103 celule per godeu au fost însămânțate în 96-plăci de godeuri (BD Falcon, North Ryde, NSW, Australia), după care, celulele au fost tratate cu CM, RLX (10 ng/) derivate de BM-MSC mL), sau o combinație de CM și RLXat 1 sau 10ng/mL timp de 24 de ore. La sfârșitul perioadei de incubare, s-au adăugat 10 μL de reactiv de marcare MTT (0,5 mg/mL, Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australia) și s-au incubat la 37 grade Cand 5% CO2 timp de încă 4 ore. Celulele au fost solubilizate prin adăugarea a 100 μL de soluție de solubilizare (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC Australia), iar potențialul de proliferare al EPC-urilor târzii a fost determinat prin măsurarea absorbanței fiecărei probe la 590 nm folosind o microplacă. cititor (Bio-strategy, Balwyn North, VIC, Australia) și analizat cu software-ul SoftMax Pro pentru sistemul de operare Windows (Ver. 7.3, Molecular Devices LLC, CA, SUA). Fiecare dintre grupurile de tratament a fost efectuat și analizat în șase replici.

2.3.3. Testul de formare a tubului

Efectele diferitelor tratamente pentru a promova potențialul angiogenic al EPC-urilor târzii, folosind un test de formare a tubului, au fost determinate folosind testul de μ-angiogeneză (Abidi, Fitchburg, WI, SUA). Pe scurt, 10 μL de factor de creștere redus (GFR) Matrigel (Produsul #356231, Corning, Tewksbury, MA, SUA) au fost adăugați în godeul interior al trusei de analiză μ-Slide al angiogenezei (Abidi, Fitchburg, WI, SUA). ). Culturile confluente ale EPC-urilor târzii au fost însămânțate pe celulele acoperite și tratate cu CM derivat din BM-MSC, RLX (10 ng/mL) sau o combinație de CM și RLX la 10 ng/mL. Un volum total de 50 μL de suspensie celulară care conține ~ 1 × 104 celule a fost aplicat în fiecare godeu. Imaginile au fost capturate imediat și etichetate ca punct de timp 0-oră. Capacitatea celulelor sub diferite tratamente de a

au fost observate tuburi de formă și imaginile au fost capturate la 2-24 ore după însămânțarea celulelor folosind un microscop cu lumină. Numărul de tuburi, lungimea tubului și numărul de puncte de ramificare au fost determinate folosind software-ul ImageJ.

2.3.4.Testul de vindecare a rănilor

Efectele diferitelor tratamente asupra potențialului regenerativ al EPC-urilor târzii au fost determinate folosind un test de vindecare a rănilor. Pentru a efectua testul, ~ 1 × 10 celule au fost suspendate în 50 μL mediu de creștere și însămânțate în 2 godeuri de silicon într-un vas de 35 mm pentru testul de vindecare a rănilor (Abidi Inc., Fitchburg, WI, SUA). Rănile artificiale în interiorul vaselor au fost create prin îndepărtarea blândă a godeurilor de silicon cu o pensetă sterilă (distanță de spațiu=500±100μm). Vasele au fost completate cu 2 ml 50% EGM-2, cu adăugarea de diverse tratamente incluzând CM derivate de BM-MSC, RLX (10 ng/mL) sau o combinație de CM și RLX la 1 sau 10 ng/mL. Numărul de celule care au migrat pentru a închide rana a fost evaluat prin utilizarea microscopiei cu lumină. celulele migrate au fost capturate la 0-24 h după tratament. Procentul zonei de închidere a golului a fost determinat folosind software-ul Image].

2.3.5.Analize de imagine

Toate analizele de imagine pentru testele funcționale au fost efectuate folosind ImageJ pentru MacOS (Ver. 1.8, National Institute of Health, Bethesda, MD, SUA). Pentru potențialul de formare a tubului al EPC-urilor târzii, imaginile au fost analizate utilizând pluginul de analiză de angiogeneză și au fost înregistrați patru parametri diferiți, inclusiv lungimea totală, numărul de ochiuri, numărul de joncțiuni și numărul de ramuri. Pentru testul de vindecare a rănilor, zona de închidere a plăgii a fost analizată prin marcarea manuală a zonei fără celule la fiecare dintre momentele de timp. Toate măsurătorile au fost efectuate de cel puțin 3 ori pentru a controla variația.

2.3.6. Imunofluorescență

Localizarea proteinei Receptorului 1 al peptidei familiei Relaxin (RXFP1; receptorul RLX înrudit) în EPC-uri tardive cultivate a fost determinată folosind colorarea prin imunofluorescență. În primul rând, celule de ~1 × 1{{20}} grad crescute pe o lamă de sticlă de 13 mm (acoperită cu poli-D-lizină) într-o placă de 12-godeuri au fost fixate în 4% PFA pentru 15 min la temperatura camerei. Celulele fixate au fost blocate pentru legarea nespecifică de proteine ​​folosind 1% albumină serică bovină (BSA) timp de 60 de minute la temperatura camerei. La sfârșitul perioadei de incubare, celulele au fost spălate în PBS timp de 5 minute (de 3 ori) și incubate cu un anticorp policlonal RXFP1 de iepure (aa 609-624; A 9227;1:2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim, Germania). )în 0,01 la sută BSA peste noapte la 4 grade. Celulele au fost spălate cu PBS și incubate cu anticorp secundar Alexa-fluor 594 de capră anti-iepure (1:500; Invitrogen, Scoresby, Victoria, Australia) în 0,01% BSA timp de 2 ore la temperatura camerei. Contracolorarea nucleară a fost efectuată prin adăugarea a 40 μL de DAPI în mediu de montare Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, SUA) și acoperit cu lamela. Proteina imunoreactivă RXFP1 a fost vizualizată folosind un microscop cu fluorescență la mărire ×40 (Olympus BX51) și imaginile au fost îmbinate folosind software-ul ImageJ.

2.4. Analize statistice

Toate datele sunt afișate ca medie ± SEM și toate analizele statistice au fost efectuate folosind GraphPad Prism'M (Ver. 9; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SUA). A fost utilizată un mod ANOVA pentru a compara efectul diferitelor tratamente asupra potențialului de proliferare (test MTT) și angiogenic (test de formare a tubului) al EPC-urilor târzii, urmat de un test post-hoc al lui Tukey pentru a permite comparații multiple între grupurile de tratament. A fost utilizată o măsură repetată - ANOVA în două căi pentru a compara efectul diferitelor tratamente asupra închiderii plăgii de către EPC-urile târzii în timp, urmată de testul post-hoc al lui Tukey pentru a compara fiecare dintre grupurile de tratament. O valoare p mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic.