Partea 1: Efectul anti-ascită malign al diterpenoidelor totale din radixul Euphorbiae Ebracteolatae este atribuit modificărilor acvaporinelor prin inhibarea activității PKC în rinichi

Pentru mai multe informatii. a lua legaturatina.xiang@wecistanche.com

Abstract: Acest studiu a evaluat efectul anti-ascita al diterpenoidelor totale extrase din Euphorbiae ebracteolate Radix (TDEE) asupra șoarecilor ascitici maligni și a elucidat mecanismul său de bază. TDEE a fost extras cu diclormetan și supus cromatografiei pe coloană. Puritatea a șase diterpenoide izolate din TDEE a fost determinată a fi de 77,18 la sută prin HPLC. TDEE (3 și 0.6 g ierburi crude/kg, po) a redus ascita și a crescut debitul de urină. Între timp, analiza viabilității celulelor tumorale, a ciclului și a apoptozei a indicat că TDEE nu a avutantitumoralactivitate. În plus, nivelurile de expresie ale acvaporinelor (AQP) și nivelurile de translocare membranară ale proteinei kinazei C (PKC) și PKC înrinichiiar celulele au fost măsurate. TDEE a redus nivelurile de AQP1-4 și a inhibat expresia PKC în fracția de membrană. Patru diterpenoizi principali, cu excepția compusului 2, au redus nivelurile de AQP1 în celulele-2 renale umane. Compușii 4 și 5 au inhibat expresia AQP2-4 în celulele conductelor colectoare medulare interne murine. Inhibarea indusă de diterpenoid a expresiei AQP1-4 a fost blocată de acetatul de forbol-12-miristat-13- (PMA; agonist al PKC). Diterpenoidele din TDEE sunt principalele componente anti-ascita. Efectul anti-ascita al diterpenoidelor poate fi asociat cu modificări ale AOP la nivelul rinichilor pentru a promova diureza. Inhibarea expresiei AOP1-4 de către TDEE este legată de inhibarea activării PKC.

Cuvinte cheie: Euphorbia ebracteolate Hayata; diureza; componente bioactive; terpenoide; celule renale; inhibitor PKC

Faceți clic pentru a afla beneficiile plantelor cistanche

1. Introducere

Euphorbia ebracteolate Hayata (EEH) este un membru al genului Euphorbia din familia Euphorbiaceae și este utilizat pe scară largă în tratamentul distensiei și edemului abdominal, infecției parazitare, tuberculozei și altor boli în medicina tradițională chineză (MTC)[1]. Rădăcina EEH (EER) conține diverse terpenoide, care sunt considerate componente eficiente. Au fost efectuate studii recente asupra terpenoidelor pentru a le determinaantiinflamator, antiviral,anti-tuberculoză și alte efecte in vitro [2-5]. Cu toate acestea, investigațiile de cercetare de bază privind efectele tradiționale ale EER în tratamentul distensiei și edemului abdominal sunt limitate. Conform teoriei MTC, EER poate elimina rapid distensia abdominală și edemul prin promovarea urinarii și a diareei [6]. Studiile noastre anterioare au arătat că diterpenoidele totale din EER (TDEE) pot provoca diaree prin reglarea expresiei acvaporinei (AQP)-1 și AQP3 [7]. Cu toate acestea, până în prezent, substanțele eficiente ale anti-ascitei în EER rămân neclare.

Distensia abdominală și edemul sunt descrise ca ascită în medicina modernă. Ascita este o acumulare patologică de lichid peritoneal [8]. Există multe cauze ale formării ascitei, cum ar fi ciroza, tumora, insuficiența cardiacă și sindromul nefrotic [9]. Apariția ascitei este legată de hipertensiunea portală, care duce la vasodilatația arterială splanhnica, reducerea volumului circulant efectiv, activarea sistemelor vasoconstrictoare endogene și retenția avidă de apă în rinichi [10]. AQP-urile sunt transportatori membranari rapidi de apă pentru traversarea barierelor epiteliale și endoteliale și, astfel, joacă un rol fundamental în menținerea echilibrului apei [11]. Numeroase studii au arătat că AQP-urile joacă un rol cheie în formarea și tulburarea ascitei [12-15]. Există multe tipuri de AQP în rinichi, cum ar fi AQP1, AQP2, AQP3 și AQP4[16]. Deoarece TDEE poate regla expresia AQP-urilor în intestin [7], propunem că TDEE poate fi utilizat în tratamentul ascitei prin reglarea AQP-urilor în rinichi.

AQP-urile joacă un rol critic în formarea urinei, cu toate acestea, mecanismele de reglare a exprimării AQP-urilor în rinichi nu au fost clarificate. În prezent, doar un număr limitat de rapoarte indică faptul că AQP-urile sunt reglate prin căile proteinei kinazei C(PKC) și proteinei kinazei A(PKA) [17-20]. Unele terpenoide izolate din Euphorbia (de exemplu, susțin și ingenol 3-angelat) au efecte de reglementare asupra PKC. TDEE poate regla expresia AQP în rinichi prin calea PKC.

În acest studiu, am extras TDEE și am evaluat efectul său anti-ascita, precum și expresia AQP-urilor analizate, activitățile PKC și PKA în rinichii șoarecilor ascitici. Apoi, am izolat și purificat principalele diterpenoide din TDEE pentru a investiga efectele acestora asupra nivelurilor de expresie a proteinei AQP și a ARNm în două tipuri decelule de rinichi(celule de rinichi uman-2 (HK{-2) și celule de canal colector medular intern murin (mIMCD3)). În cele din urmă, alegem un compus diterpenoid (eufebracteolatina A), folosind forbol-12-miristat-13-acetat (PMA; agonist al PKC) pentru a activa calea PKC, pentru a identifica dacă expresia AQP-urilor în rinichi este reglată. prin calea PKC. Acest studiu și-a propus să determine efectul anti-ascita al TDEE în EER și să ofere o bază pentru aplicarea clinică a EER și identificarea medicamentelor candidate pentru diureză și efecte anti-ascitice.

2. Rezultate

2.1. Efectele TDEE asupra greutății fluidului ascitic, a urinei și a conținutului de apă fecală

Tratamentul șoarecilor ascitici cu extract total de EER (TEER) și TDEE (3 și 0,6 g ierburi crude/kg, po) și furosemid (medicament pozitiv) a redus semnificativ creșterea greutății lichidului ascitic comparativ cu modelul grup (Figura 1A). Figura 1C a arătat că urina cântărește semnificativ (p<0.05, compared="" to="" the="" model="" group)increased="" in="" ascitic="" mice="" pretreated="" with="" teer,="" tdee,="" and="" furosemide.="" in="" addition,="" in="" the="" teer="" and="" tdee="" groups="" at="" a="" dose="" of="" 3="" g="" raw="" herbs/kg,="" a="" significant="" increase="" in="" fecal="" water="" content="" was="" observed="" compared="" with="" the="" model="" group="" (figure="" 1d).="" however,="" the="" non-diterpenoid="" fraction="" of="" eer(ntdee)="" groups="" showed="" no="" significant="" influence="" on="" ascites="" weight,="" urine="" weight,="" and="" fecal="" water="" content="" compared="" to="" the="" model="">

2.2. Efectele TDEE asupra nivelurilor de albumină serică la șoarecii ascitici

Albumina serică este cea mai abundentă proteină din plasma vertebratelor și poate menține presiunea osmotică a sângelui și poate regla transportul apei. Figura 1B a arătat că producția de ascită la șoarecii model a provocat o scădere semnificativă a albuminei serice în comparație cu grupul normal. După tratamentul cu furosemid, TEER și TDEE (3 și 0.6 g ierburi crude/kg, po), nivelurile de albumină seric au fost recuperate în mod eficient în comparație cu grupul model. Nu a fost observată nicio îmbunătățire a acestui indice în grupurile NTDEE.

2.3. Efectele TDEE asupra viabilității celulelor tumorale, ciclului și apoptozei la șoarecii ascitici

În ascita malignă, celulele tumorale plutesc în lichidul ascitic. Am evaluat dacă reducerea ascitei este legată de activitatea anticanceroasă a TEER și TDEE. Rezultatele au arătat că aceste medicamente nu au inhibat viabilitatea celulelor tumorale (Figura 2A) și nu au condus la oprirea ciclului celular (Figura 2B) și apoptoză (Figura 2C, D).

2.4. Efectele TDEE asupra expresiei AQP în rinichii șoarecilor ascitici

Rinichiul este un organ important pentru reabsorbția apei și concentrarea urinară. Canalele de apă AQP mediază transportul rapid al apei în rinichi. Astfel, am examinat expresia AQP-urilor în rinichi. Figura 3 a arătat că îmbunătățirea ascitei a avut un efect redus asupra expresiei AQP în rinichi, în comparație cu grupul normal. Când a fost tratat cu TEER și TDEE, expresia proteinelor AQP1, AQP2, AQP3 și AQP4 a fost semnificativ mai mică decât în ​​grupul model la majoritatea dozelor. TEER a dus la o scădere semnificativă a expresiei AQP2, AQP3 și AQP4 la doze de 3,0 și {{10}},6g ierburi crude/kg, în timp ce expresia AQP1 a fost redusă doar la un doză mică (0,6 g ierburi crude/kg). În special, TDEE a avut aceleași efecte inhibitoare asupra expresiei AQP3 și AQP4 ca TEER la două doze. Diferența dintre TDEE și TEER este că TDEE a inhibat expresia AQP1 și AQP2 doar la o doză mare (3 g ierburi crude/kg). 3 g ierburi crude/kg.

2.5. Efectele TDEE asupra activării PKC și PKA în rinichii șoarecilor ascitici

Studiile anterioare au indicat că expresia AQP-urilor ar putea fi reglată de activarea PKC și PKA. Am examinat efectele TDEE asupra activării PKC-a, PKC- și PKA. Activarea PKC a fost măsurată prin translocarea sa din citosol în membrana celulară. După cum se arată în figurile 4A și B, nivelul de exprimare a proteinei PKC- în fracția de membrană a fost semnificativ scăzut în grupurile TDEE, în timp ce nu a existat un efect semnificativ asupra nivelului de expresie a proteinei de membrană PKC-. Fosfolipaza C (PLC) este o moleculă importantă de semnalizare în amonte care mediază activarea PKC. Tratamentul TDEE nu a avut niciun efect asupra nivelurilor de PLC fosforilat și total (Figura 4D). PKA este un heterotetramer format din două subunități catalitice legate la două subunități reglatoare. Eliberarea subunităților catalitice este un semn distinctiv al activării PKA. În Figura 4C, TDEE nu a afectat expresia subunităților catalitice PKA.

2.6. Determinarea conținutului de șase diterpenoide în TDEE prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC)

Rezultatele experimentelor pe animale au arătat că TDEE a fost principala fracțiune eficientă a EER. Am izolat șase diterpenoide (structurile compușilor de la 1 la 6 sunt prezentate în Figura 5; datele spectrale au fost adăugate la Materialul suplimentar) din TDEE și am folosit acești compuși ca standarde pentru a determina conținutul de diterpenoizi în TDEE. Cromatogramele HPLC pentru TDEE și cele șase standarde diterpenoide sunt prezentate în Figura 6. Conținutul compușilor de la 1 la 6 a fost de 1,07 la sută, 12,00 la sută, 12,69 la sută, 9,15 la sută, 39,26 la sută și, respectiv, 3,02 la sută, ținând cont pentru 77,18 la sută din TDEE.

2.7. Efectele diterpenoidelor din TDEE asupra expresiei AQP în celulele renale

TDEE a fost fracția activă a EER care a inhibat ascita prin reducerea expresiei AQP1, AQP2, AQP3 și AQP4 în rinichi. În același timp, TDEE a redus semnificativ, de asemenea, expresia proteinei și ARNm a AQP1, AQP2, AQP3 și AQP4 în celulele renale-2 umane (HK{-2) și celulele canalului colector medular intern murine (mIMCD3) (Figura 7). Principalele componente ale TDEE sunt diterpenoidele. Am comparat efectele dintre TDEE și amestecul de diterpenoide (șase diterpenoide izolate au fost amestecate în funcție de conținutul lor în TDEE). Rezultatele au arătat că efectele inhibitoare ale amestecului de diterpenoide și ale TDEE asupra expresiei AQP1, AQP2, AQP3 și AQP4 au fost similare (Figura 7). Activitățile a patru diterpenoide principale din TDEE au fost evaluate in vitro. Figurile 8 și 9 au arătat că nivelurile de expresie a proteinei și ARNm ale AQP1 în celulele HK-2 au fost reduse semnificativ de compușii 3,4 și 5. Tratamentul cu compusul 2 nu a indus o scădere notabilă a AOP1 la proteină și ARNm. niveluri. Pentru acești compuși, compusul 3 (un diterpenoid de tip ent-abietan) a fost mai activ decât ceilalți compuși. În celulele mlMCD3, patru compuși diterpenoizi au indus grade diferite de inhibare a expresiei AQP2, AQP3 și AQP4. Rezultatele expresiei proteinei și genei sunt prezentate în figurile 8 și 9. Compușii 4 și 5 au avut efecte puternice inhibitoare AQP2, AQP3 și AQP4 în comparație cu grupul de control la niveluri de genă și proteine. Compușii 2 și 3 au arătat doar efecte diferite asupra expresiei ARNm Aqp2, Aqp3 și Aqp4.

2.8. Efectele activatorului PKC asupra inhibării AQP induse de diterpenoizi

Rezultatele experimentului pe animale au indicat că TDEE a inhibat simultan activitatea PKC și expresia AQP în rinichii șoarecilor purtători de celule tumorale H22. Pentru a clarifica în continuare dacă PKC a reglementat expresia AQP-urilor în celulele renale, agonistul PKC (PMA) a fost pretratat în celule HK-2 și mIMCD3 la 1,5 ore înainte de stimularea cu diterpenoid (Euphebracteolatin A). S-a detectat modificarea exprimării membranei PKC, AOP1, AOP2, AOP3 și AOP4. Rezultatele Western Bolt au arătat că eufebracteolatina A ar putea reduce expresia proteinei membranei PKC, AOP1, AOP2, AOP3 și AOP4, iar efectele ar putea fi atenuate prin pretratarea PMA (Figura 10).