Partea 1: Molecula de leziune renală-1 este un receptor potențial pentru SARS-CoV-2

Pentru mai multe informatii. a lua legaturatina.xiang@wecistanche.com

Pacienții cu COVID-19 prezintă o incidență mare derinichianomalii, care sunt asociate cu prognostic prost și mortalitate. Identificarea SARS-CoV-2 în rinichiulCOVID-19pacienții sugerează tropism renal al SARS-CoV-2. Cu toate acestea, rămâne neclar dacă există o țintă specifică a SARS-CoV-2 în rinichi. Aici, prin utilizarea simulării in silico, coimunoprecipitarea, transferul de energie prin rezonanță de fluorescență, marcarea cu izotiocianat de fluoresceină și proiectarea rațională a peptidelor antagoniste. demonstrăm că molecula de leziune renală-1(KIM1), o moleculă suprareglată dramatic la leziunea renală, se leagă de domeniul de legare la receptor (RBD) al SARS-CoV-2 și facilitează atașarea acestuia la membrana celulară. , cu domeniul variabil imunoglobulinei asemănător lg (lg V) al KIM1 jucând un rol cheie în această recunoaștere. Interacțiunea dintre SARS-CoV-2 RBD și KIM1 este puternic blocată de o polipeptidă AP2 derivată din KIM1-proiectată rațional. În plus, rezultatele noastre sugerează, de asemenea, interacțiuni între domeniul KIM1 lg V și RBD-urile SARS-CoV și MERS-CoV, agenți patogeni ai două boli respiratorii infecțioase severe. Împreună, aceste descoperiri sugerează KIM1 ca un receptor nou pentru SARS-CoV-2 și alte coronavirusuri. Propunem că KIM1 poate media și exacerba astfel infecția renală cu SARS-CoV-2 într-un „cerc vicios”, iar KIM1 ar putea fi explorat în continuare ca o țintă terapeutică.

Cuvinte cheie: SARS-CoV-2, COVID-19, boli de rinichi, moleculă de leziune renală-1, coronavirus

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a ști că cistanche îmbunătățește funcția rinichilor

Introducere

Organizația Mondială a Sănătății a anunțat boala coronavirus 2019 (COVID-19) ca o pandemie (Guan și colab., 2020).Sindromul respirator acut sever coronavirus 2(SARS-CoV-2), agentul patogen al COVID-19, aparține genului beta-coronavirus care include și SARS-CoV și coronavirusul sindromului respirator din Orientul Mijlociu (MERS-CoV) (Shahrajabian și colab. ,2021). SARS-CoV-2, SARS-CoV și MERS-CoV vizează în principal sistemele respiratorii pentru a se manifesta în principal cu boli respiratorii (Shahrajabian și colab., 2021). În special, rapoartele despre implicarea renală în rândul pacienților infectați, precum și identificarea infecției virale în rinichi au sugerat că aceste coronavirusuri pot infecta direct rinichiul (Ding și colab., 2004; Eckerle și colab., 2013; Braun și colab., 2020; Su și colab., 2020).

Insuficiența renală la pacienții spitalizați cu COVID-19 este frecventă, iar noi și alții am raportat asocierea acesteia cu inflamație severă, progres clinic slab și mortalitate ridicată în spital (Chen și colab., 2020; Hirsch și colab., 2020; Pei și colab., 2020; Yang și colab., 2020).Incidența ridicată a acutelorleziuni renale(AKI (56,9 la sută) în rândul pacienților cu COVID-19 a fost observată (Fisher și colab., 2020). Important, prezența SARS-CoV-2 infecțioasă a fost confirmată în rinichi, în special în celule epiteliale renale și un studiu post-mortem a sugerat tropismul renal al SARS-CoV-2, care a fost detectat în rinichii a 72% dintre pacienții cu COVID{-19 cu AKI (Braun și colab., 2020). manifestări multiorganice la pacienții cu COVID-19, în afară de plămân, rinichiul este foarte vulnerabil la virus șidisfuncții renalesunt strâns asociate cu o mortalitate ridicată, mecanismele moleculare subiacente rămânând neclare.

Invazia SARS-CoV-2 inițiază prin legarea cu receptorii membranei celulare prin intermediul proteinei sale (Shahrajabian și colab., 2021). În prezent, enzima de conversie a angiotensinei 2 (ACE2), care este îmbogățită în rinichi și, de asemenea, ținta pentru

SARS-CoV este singurul receptor bine recunoscut pentru SARS-CoV-2 (Shang et al, 2020). Responsabilă pentru recunoașterea receptorului, proteina spike SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-S) constă din subunitățile S1 și S2 (Figura 1A), iar domeniul de legare la receptor (RBD) din S1 leagă ACE2 pentru a iniția fuziunea S2 cu membrana celulară și intrarea ulterioară în celule (Shang și colab., 2020). Recent, s-a observat o scădere a nivelului de proteine ​​al ACE2 în plămânii și rinichii infectați cu SARS-CoV-2 (Nie și colab., 2021); prin urmare, tropismul renal al SARS-CoV-2 și leziunea renală asociată par puțin probabil asociate cu nivelul ACE2. În plus, am raportat recent că administrarea inhibitorilor ACE2 nu a arătat nicio asociere cu rezultatele clinice în rândul COVID{{25} }} pacienți (Chen și colab., 2020). Având în vedere că intrarea în celulele virale poate implica receptori transmembranari multipli (Lan și colab., 2020), speculăm că receptorii suplimentari pot media infecția renală cu SARS-CoV-2.

Molecula de leziune renală-1(KIM1) este exprimată în principal în rinichi și drastic suprareglată în tubul proximal al rinichiului lezat la leziune și joacă un rol crucial îninflamaţieinfiltrarea și răspunsurile imune (Rong și colab., 2011). Din punct de vedere structural, KIM1 constă dintr-un domeniu variabil de imunoglobulină asemănător lg (g V), domeniu mucină, un domeniu transmembranar și domeniu citosol. Printre acestea, domeniul lg V este necesar pentru legarea și internalizarea virusului, cum ar fi intrarea virusurilor Ebola și Dengue (Yuan și colab., 2015; Dejarnac și colab., 2018). Aici, am investigat dacă KIM1 este o țintă obligatorie a SARS-CoV-2 care mediază invazia renală a acestuia.

Rezultate

Profilurile de expresie ale KIM1 și ACE2 în țesuturile umane

Pentru a elucida îmbogățirea KIM1 și ACE2 în țesuturi, au fost colectate transcriptomul și datele de exprimare a proteinelor bazate pe histologie din Atlasul țesuturilor din Atlasul proteinelor umane. Cele mai importante 10 probleme cu ARNm și abundența proteinelor KIM1 și ACE sunt enumerate în figura suplimentară S1A-F. În special, KIM1 și ACE2 sunt coexprimate în rinichi, colon, rect, testicul și vezica biliară (Figura suplimentară S1C și F), care sunt toate printre organele țintă ale SARS-CoV-2(Cha et al., 2020) , implicând o corelație strânsă a KIM1 cu manifestările COVID-19.

Andocările moleculare dezvăluie interacțiunea dintre SARS-CoV-2-RBD și KIM1 lg V

Secvențele primare ale SARS-CoV-RBD și SARS-CoV-2-RBD au o similaritate mare (62,93 la sută), cu 9 din 14 reziduuri de contact ACE2- conservate în ambele RBD (Figura 1B). În comparație, MERS-CoV-RBD, care recunoaște DPP4 (Li et al, 2020c), prezintă o asemănare scăzută cu SARS-CoV-RBD și SARS-CoV-2-RBD (17,07 la sută și 14.86 procente, respectiv; Figura 1B).

Kim1 este drastic supraregulat în rinichii șoarecilor afectați de ischemie-reperfuzie (I/R) sau cisplatină, în timp ce au fost observate doar modificări ușoare ale Ace2 (Figura 1C). Printre cele patru domenii ale KIM1 (Figura 1D și E), domeniul lg V este responsabil pentru legarea virusului (Yuan și colab., 2015; Dejarnac și colab., 2018), iar andocarea dinamică moleculară a fost astfel efectuată pentru a investiga legarea acestuia cu SARS-CoV{ {11}}RBD.

Informațiile de andocare și structurale ale complexului SARS-CoV-2-RBD și KIM1 lg V sunt furnizate în figurile suplimentare S1G-I și S2.Phe338, Val367, Ser371, Phe374 și Trp436of SARS-CoV-2-RBD contact Leu54, Phe55, Gln58, Trp112 și Phe113 ale KIM1 lg V (Figura 2A) și conduc la o energie liberă de legare combinată de -35.64kcal/mol (Tabelul 1; Tabelul suplimentar S1), care este mai mică decât aceasta de SARS CoV-2-RBD și ACE2 (-50.60kcal/mol), dar comparabil cu cel al SARS-CoV-RBD și ACE2 ({-38.3kcal/mol) (Li et al. ,2020c). Deoarece ACE2 este recunoscut ca un receptor cheie pentru SARS-CoV-RBD (Li et al, 2020c), se sugerează o interacțiune puternică între SARS-CoV-2-RBD și KIM1 (Tabelul 1; Tabelul suplimentar S1). În special, diferitele regiuni de legare ale SARS-CoV-2-RBD la KIM1 și la ACE2 indicate de datele noastre sugerează că KIM1 și ACE2 pot media sinergic invazia SARS-CoV{-2 (Figura 2B).

Din punct de vedere clinic, au fost identificate mutații în SARS-CoV-2-S (figura suplimentară S3 și tabelul S2) și cazuri de COVID-19 purtând mutația V367F în SARS-CoV-2-S, care contactează KIM1 , au fost raportate, rezumate în figurile suplimentare S3B și O (Mercatelli et al., 2020). Analiza generalizată a suprafeței Born (MM-GBSA) de mecanică moleculară sugerează că mutația V367F duce la o legare îmbunătățită cu KIM1 (Tabelul suplimentar S1), care se poate asocia cu constatările clinice conform cărora V367F duce la creșterea infecțiozității SARS-CoV-2( Li și colab., 2020a; Starr și colab., 2020); investigațiile ulterioare asupra acestor mutații clinice vor fi importante.

SARS-CoV-RBD și SARS-CoV-2-RBD vizează același buzunar de legare în KIM1

Datele cu microarray au arătat o expresie crescută a Kim1 în celulele mononucleare din sângele periferic derivate de la pacienții cu SARS în comparație cu controalele sănătoase (GSE1739, Figura suplimentară S4A; Raghunathan și colab., 2005). Având în vedere faptul că SARS-CoV-RBD și SARS-CoV-2-RBD invadează rinichiul (Ding și colab., 2004; Braun și colab., 2020) și au o omologie ridicată (Figura 1B), am evaluat legarea potențialul SARS-CoV-RBD cu KIM1 (Figurile suplimentare S4 și S5). Împărțind același buzunar de legare în KIM1 (suprafața de contact prezentată în Figura 2C), SARS-CoV-RBD se leagă de KIM1 lg V la o energie liberă combinată de -21.59 kcal/mol (Tabelele suplimentare S1 și S3), sugerând o afinitate relativ mai scăzută pentru KIM1 decât cea a SARS-CoV-2-RBD({-35,64kcal/mol), în timp ce s-a găsit o interacțiune chiar slabă între MERS-COV-RBD și lg V ({{33 }}.12 kcal/mol, Tabel suplimentar S1). Prin urmare, SARS-CoV-2-RBD a arătat cea mai mare afinitate de legare la KIM1; în plus, SARS-CoV-RBD și SARS-CoV-2-RBD au același buzunar de legare pe domeniul lg V (Figura 2C.

Interacțiunea intracelulară a SARS-CoV-2-RBD și KIM1 Ig V

Pentru a confirma legarea dintre SARS-CoV-2-RBD și KIM1, au fost efectuate teste de coimunoprecipitare (co-IP) endogene și exogene (Figura 3A-D; Figura suplimentară S6A). Proteinele virale exogene (flag-tagged SARS-CoV-2-S sau SARS-CoV-2-RBD) au fost imunoprecipitate cu KIM1 din lizate de celule din linia de celule epiteliale tubulare renale umane HK{-2 și HEK293T celule care s-au transfectat cu plasmidele corespunzătoare (Figura 3B; Figura suplimentară S6A), indicând legarea directă a KIM1 și SARS-CoV-2-RBD. Rezultate similare au fost obținute și prin transferul de energie prin rezonanță fluorescentă (testul bazat pe FRED (Karpova și McNally, 2006) utilizând proteina fluorescentă cyan KIM1-CFP) și proteina fluorescentă galbenă SARS-CoV-2-RBD ( YFP) (Figura 3F-). CFP și YFP neconjugate au fost cotransfectate ca control negativ (Figura 3E, F și ), iar interacțiunea dintre KIM1-CFP și ligandul său TIM{4-YFP a fost, de asemenea, inclus ca control pozitiv (Figura 3E, G și ). După cum a fost detectat prin spectrofotometrie cu fluorescență și microscopie confocală, cotransfecția celulelor KIM1-CFP și SARS-CoV{-2-RBD-YFPin HEK293T a dus la un Semnal FRET (Figura 3E și H), indicând interacțiunea intracelulară dintre KIM1 și SARS-CoV-2-RBD.

Deoarece KIM lg V este crucial în mediarea legării receptorilor virali (Yuan și colab., 2015; Niu și colab., 2018), plasmidele care supraexprimă KIM1 cu lungime completă, domeniul lg V al KIM1 sau KIM1 trunchiat fără domeniul lg V (Alg V) ) au fost, respectiv, cotransfectate cu SARS-CoV-2-RBD într-o linie celulară stabilă KIM1 knockout HK{-2 sau celule HEK293T (Figura 3C și D; Figura suplimentară S6B și C). Eliminarea KIM1 sau ștergerea domeniului lg V a abolit legătura dintre KIM1 și SARS-CoV-2-RBD (Figura 3C și D). Interacțiunea dintre KIM1lg V și SARS-CoV-2-RBD a fost, de asemenea, verificată prin teste bazate pe FRET și nu

semnalul FRET evident a fost observat în celulele cotransfectate cu KIM1 △lg V-CFP și SARS-CoV-2-RBD-YFP (Figura 3I și ). Aceste rezultate împreună sugerează că domeniul lg V este crucial în medierea interacțiunii dintre KIM1 și SARS-CoV-2.

KIM1 mediază atașarea celulară a SARS-CoV-2-RBD

Apoi am folosit etichetarea cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) pentru a urmări SARS-CoV-2-RBD în celulele umane. Pentru fiecare grup indicat, au fost incluse în evaluare cel puțin 100 de celule din cinci câmpuri sub o lentilă obiectiv de mare putere. Am observat un semnal mai puțin obligatoriu al FITC-SARS-CoV-2-RBD pe suprafața celulelor renale umane atunci când KIM1 a fost eliminat, în timp ce un semnal mai intens când KIM1 a fost supraexprimat (Figura 4A și B). În celulele HK-2 knockout KIM1, restabilirea KIM1 cu lungime completă și supraexprimarea lg V ambele au salvat semnalele de legare ale SARS-CoV-2-RBD pe suprafața celulei (Figura 4A), demonstrând importanța KIM1 Ig V în mediarea atașării virale. Mai mult, knockout-ul KIM1 a atenuat citotoxicitatea indusă de SARS-CoV -2-RBD (Figura suplimentară S6D). Împreună, aceste rezultate confirmă și mai mult rolul crucial al domeniului lg V în medierea atașării SARS-CoV-2 la celulele renale.

O peptidă derivată din KIM1-blochează atașarea celulară a SARS-CoV-2-RBD

Pentru a lega competitiv cu SARS-CoV-2-RBD și a inhiba interacțiunea acestuia cu KIM1, am proiectat rațional două peptide antagoniste bazate pe motive de contact SARS-CoV{-2-în KIM1 (motiv 1: Leu54, Phe55, Gln58; motivul 2: Trp112, Phe113; Figura 5A). Peptida 1 (AP1) imită motivul 1, în timp ce peptida 2 (AP2) acoperă ambele motive, cu trei glicine utilizate ca linker flexibil (Figura 5A). Energia liberă de legare, care indică legarea dintre peptide și SARS-CoV-2-RBD, a fost furnizată în tabelul suplimentar S1. Ambele peptide nu au prezentat citotoxicitate distinctă, iar AP2 a redus atașarea SARS-CoV-2-RBD la suprafața celulei și a protejat împotriva citotoxicității acesteia (Figura 5B-D). Mai mult, AP2 a inhibat semnificativ interacțiunea dintre KIM1 și SARS-CoV-2-RBD, indicat de semnalul FRET abolit între KIM1 și SARS-CoV{-2-RBD la tratamentul AP2 (Figura 5E și F). Legarea SARS-CoV-2-RBD îmbunătățită și timpul de înjumătățire prelungit sunt supuse optimizării secvențelor sau modificărilor AP2 cu abordările pe care le-am descris recent (Wang și colab., 2020). Deoarece KIM1 este protector împotriva AKI (Yang et al., 2015), este puțin probabil ca strategia noastră să interfereze cu efectele benefice ale KIM1 in vivo.

Coronavirusul vizează oamenii: persoanele cu imunitate scăzută

Persoanele cu imunitate slabă: boli gastrointestinale, răceli, vânt și frig

Populația subsanătă: constituție slabă, malnutriție, oboseală, pierderea poftei de mâncare, tulburări de somn etc.

Persoanele care abuzează de antibiotice: duc la disfuncții imunitare și infecții repetate, copii, vârstnici, persoane imunodeprimate, manifestări ale imunității slăbite

Imunitatea este mecanismul propriu de apărare al organismului și este capacitatea organismului de a recunoaște și elimina orice intruziune străină (virusuri, bacterii etc.). Imunologia modernă consideră că imunitatea este răspunsul fiziologic al corpului uman de a identifica și exclude „ceilalți”. Imunitatea scăzută este cauza principală a majorității invaziilor bolilor.

Când funcția imunitară a organismului este disfuncțională, răcelile, amigdalita, astmul bronșic, bronșita, pneumonia, diareea, alergiile și alte boli vor recidiva în mod repetat și este ușor să fii atacat de diferiți viruși și chiar poate provoca o serie de tumori și cancere. , deci nu trebuie subestimat. Imunitate scăzută.

Cistanche este una dintre „Nouă Mari Ierburi Nemuritoare din China”. Tonifică yang-ul rinichilor, hrănește esența și sângele, hrănește cinci organe interne, revigorează mijlocul și hrănește qi-ul și tratează cinci tulpini și șapte leziuni. Este cea mai des folosită comoară tonică în China.Cistancheaparține unui fel de material medicinal prețios care poate stimula glanda pituitară și cortexul suprarenal sau poate avea un efect asemănător hormonal similar cortexului suprarenal și reglează funcția imunitară a organismului. Conținutul de polizaharide din speciile sale de extract este relativ mare, iar efectul de îmbunătățire a sistemului imunitar al componentelor polizaharidelor este în efectul puternic și tonic al Cistanche deserticola. poate juca un rol major.

Echinacozidul și verbascozidul din Cistanche deserticola nu numai că au un efect protector asupra leziunilor organelor imune cauzate de medicamente și radiații, dar pot de asemenea spori capacitatea de apărare a organismului. Echinacea și verbascozidul pot îmbunătăți transformarea limfocitelor in vivo și in vitro și pot spori activitatea citotoxică a celulelor ucigașe naturale.

Cistanche are multe funcții, cum ar fi îmbunătățireaimunitate, antitumoral, reglează metabolismul substanțelor și îmbunătățește adaptabilitatea corpului.