Partea 1: Deficiența DHHC21 atenuează disfuncția renală în timpul leziunilor septice

Pentru mai multe informatii. a lua legaturatina.xiang@wecistanche.com

Leziunile septice progresează adesea în disfuncție de organe multiple, servind drept principală cauză de mortalitate în unitățile de terapie intensivă.Rinichisunt unul dintre organele cele mai susceptibile la leziuni septice. Pacienții cu disfuncție renală indusă de leziuni septice tind să aibă spitalizare prelungită, rezultate mai proaste și o mortalitate semnificativ mai mare. Patogenia disfuncției renale asociate leziunilor septice este un proces complex și multifactorial; un mecanism predominant în disfuncția vasculară renală3-5. Studii asupra pacienților și animalelor mari cu leziuni septice indusedisfuncție renalăau arătat o rezistență vasculară renală crescută semnificativ, contribuind la scăderea fluxului sanguin renal (RBF) în leziunile septice-9. Această reducere a RBF a fost confirmată la pacienții cu sepsis cu leziuni renale folosind diferite tehnici, inclusiv Doppler renal, termodiluție și imagistica prin rezonanță magnetică cu contrast de fază. Ischemia regională și hipoxia cauzate de perfuzia insuficientă a țesutului renal pot duce la filtrarea glomerulară afectată cuplată cu moartea celulelor epiteliale tubulare, ducând la disfuncție renală12-14.

EchinacozidulșiVerbascumsunt două molecule monomerice recunoscute ca fiind cele mai benefice pentru organismul uman de țările din întreaga lume, în timp ce echinacozidul și verbascozidul din Cistanche sunt soiurile cu cel mai mare conținut din Cistanche. În plus,CistancheConține, de asemenea, un număr mare de aminoacizi, cistina, vitamine și minerale sunt ingrediente nutritive și hrănitoare rare, care au un efect tonic excelent asupra rinichilor masculini, testiculelor, penisului, corpului cavernos și a altor organe sexuale și, de asemenea, pot îmbunătăți eficient sperma. motilitate și calitate.

Faceți clic pentru a afla pentru ce se folosește cistanche

Mecanismele responsabile de hipoperfuzia țesutului renal în leziunile septice nu au fost încă pe deplin elucidate. Palmitoilarea proteinelor, atașarea covalentă a unui {{{0}}acid palmitic de carbon la reziduurile de cisteină ale unei proteine, a fost recent recunoscută ca un nou regulator al funcției vasculare15,16. Palmitatul atașat crește hidrofobicitatea proteinelor modificate în vasele de sânge și afectează localizarea, stabilitatea și conformația acestora, reglând astfel multe aspecte ale funcției vasculare la nivel posttranslațional/1. Această modificare reversibilă este catalizată de o familie de palmitoil aciltransferaze (PAT) care conține motivul Asp-His-His-Cys (DHHC) 0,21. Până în prezent, 23 de PAT-DHHC au fost identificate la om21. Studii recente au raportat implicarea PAT-DHHC în reglarea hemodinamică, boala arterială periferică șiinflamaţie-leziune vasculară indusă15,1622; cu toate acestea, există o lipsă de informații cu privire la rolurile PAT-urilor în reglementarefuncția vasculară renalăîn leziuni septice.

PAT-DHHC21, spre deosebire de majoritatea altor DHHC, este exprimat pe membrana plasmatică, făcând posibil ca DHHC21 să regleze activitățile receptorilor de suprafață celulară din vasele de sânge8,23. Descoperirile noastre anterioare indică faptul că deficiența funcțională DHHC21 demonstrează beneficii de supraviețuire la animalele cu leziuni septice2. Mai mult, un studiu recent arată că DHHC21 reglează tonusul vascular prin palmitoilarea receptorului l-adrenergic vascular (alAR), un receptor cu șapte transmembranare G cuplat cu proteina (GPCR) care induce contracția mușchilor netezi5. S-a raportat o eliberare crescută de norepinefrină agonist alAR endogen la pacienții cu leziuni septice, contribuind la vasoconstricția intrarenală și la hipoperfuzia tisulară24. Noradrenalina este, de asemenea, utilizată ca vasopresor de primă linie pentru a trata șocul septic, care ar putea crește și mai mult ischemia regională în rinichi12,25. Prin urmare, în acest studiu, am folosit șoareci cu deficit de DHHC21-(Zdhhc21dep/de) și am testat ipoteza conform căreia DHHC21 contribuie la disfuncția renală și leziunile tisulare în leziunile septice prin promovarea vasoconstricției renale dependente de palmitoilare alAR și hipoperfuziei tisulare. Descoperirile noastre au indicat că șoarecii Zdhhc21dep/deP au fost mai rezistenți la disfuncția renală indusă de leziuni septice și leziunile structurale. Pierderea funcției DHHC21 a îmbunătățit perfuzia renală și RBF prin inhibarea palmitoilării lAR și a capacității sale de a media vasoconstricția renală. Astfel, sugerăm DHHC21 ca un nou mediator al disfuncției renale induse de leziuni septice prin mecanisme care implică palmitoilarea alAR și hipoperfuzia țesutului renal asociată activării alAR.

Rezultate

Pierderea funcției DHHC21 reduce disfuncția renală în leziunile septice. Soarecii Zdhhc21dep/de au fost angajați pentru a investiga rolul PAT-DHHC21 în disfuncția renală în timpul leziunii septice. Deficiența funcțională a DHHC21 la șoarecii Zdhhc21deplde se datorează unei deleții de 3 bp în exonul 7 al genei Zdhhc21, ducând la pierderea unui singur aminoacid fenilalanină (F) la poziția 2332. Informații detaliate despre genotipul și fenotipul Zdhhc21 sunt prezentat în Figura suplimentară S1.

Am comparat excreția renală între șoarecii WT și Zdhhc21dep/der folosind o tehnică imagistică nouă și minim invazivă, tomografia optoacustică multispectrală (MSOT). MSOT se bazează pe efectul fotoacustic și detectează semnalele ultrasunete produse de expansiunea termică a țesuturilor/moleculelor atunci când sunt excitate de impulsuri laser în infraroșu apropiat (NIR,680-950 nm)27, colorant NIR IRDye800CW, care este excretat exclusiv de rinichi282 , a fost injectat intravenos la 24 de ore după procedura simulată și leziunea septică indusă de CLP. După cum se arată în Fig.1, înregistrarea în timp real a clearance-ului IRDye800CW a arătat că IRDye800CW a apărut mai întâi în regiunea cortexului renal, apoi s-a mutat către regiunea medulo-pelvis înainte de a fi excretat rapid de rinichi. Intervalul de timp dintre intensitatea maximă a cortexului și a regiunii medulo-pelvis (întârziere Tmax) a fost determinat pe baza cineticii de clearance a IRDye800CW, așa cum se arată în Fig. 2a. Întârzierea Tmax mai mare indică faptul că IRDye800CW durează mai mult pentru a trece de la cortex la regiunea medulo-pelvis, ceea ce sugerează o excreție renală afectată30. Pierderea funcției DHHC21 nu a arătat niciun efect semnificativ asupra excreției renale la martorii simulați; cu toate acestea, creșterea întârzierii Tmax indusă de leziuni septice a fost mult inhibată la șoarecii Zdhhc21dep/deP (Fig. 2b).

Deficiența funcțională DHHC21 atenuează afectarea renală indusă de leziuni septice. Apoi am efectuat colorarea periodică cu acid-Schiff pentru a vizualiza deteriorarea structurală a rinichilor la șoarecii WT și Zdhhc21d/deP după CLP După cum se arată în Fig, 3a, leziunea septică a dus la leziuni severe ale țesutului renal, inclusiv anomalii glomerulare, pierderea marginii periei în tubul proximal. , vacuolizarea epiteliului tubular, detașarea/necroza celulelor tubulare și infiltrarea neutrofilelor; totuși, aceste modificări morfologice au fost atenuate la șoarecii Zdhhc21depide. Analiza cantitativă a arătat că leziunea septică a dus la un scor semnificativ crescut al leziunii renale, care a fost foarte inhibat de pierderea funcției DHHC21 (Fig. 3b). Nivelurile circulante ale creatininei și azotului ureic din sânge (BUN) au fost, de asemenea, măsurate ca indicatori ai disfuncției renale. În concordanță cu rezultatele histologiei, leziunile septice au crescut semnificativ nivelurile plasmatice ale creatininei și ale BUN la șoarecii WT; cu toate acestea, aceste modificări au fost ameliorate la șoarecii Zdhhc21dep/deP (Fig. 3c, d).

De asemenea, am comparat nivelurile de citokine circulante la șoareci WT și Zdhhc21dep/de după leziuni simulate și septice. Analiza matricei de citokine a arătat că CLP a condus la creșterea producției de citokine, cum ar fi interleukină-1(IL{-1), IL-6 și TNF-a atât la șoareci WT, cât și la Zdhhc21dep/de?; veterinar, nu au existat diferențe remarcabile în profilurile de citokine între cele două tulpini de șoarece după CLP (Fig. S2 suplimentară). Aceste date indică faptul că efectele protectoare ale deficienței funcționale DHHC21 asupra funcției rinichilor în timpul leziunilor septice nu se datorează inhibării producției de citokine proinflamatorii.

Deficiența funcțională DHHC21 previne reducerea perfuziei renale și a saturației de oxigen în timpul leziunilor septice. Având în vedere faptul că hipoperfuzia țesutului renal este o cauză majoră a disfuncției renale în timpul leziunii septice, am comparat perfuzia renală între șoarecii WT și Zdhhc21dep/aeP după leziuni septice folosind MSOT. Detectarea hemoglobinei absorbante de lumină NIR intrinsecă prin MSOT a fost raportată a fi o tehnică de încredere pentru măsurarea perfuziei de organ în multe studii1,3. După cum se arată în Fig. 4a, b, intensitatea hemoglobinei totale a scăzut semnificativ în rinichii șoarecilor WT după CLP în comparație cu controalele simulate. Această reducere a fost mult atenuată de deficiența funcțională DHHC21, sugerând o perfuzie renală mai bine conservată la șoarecii Zdh-hc21dep/de după leziuni septice. Apoi, am diferențiat hemoglobina oxigenată și cea deoxigenată pe baza spectrului lor distinctiv și am calculat saturația de oxigen a țesutului renal. După 24 de ore de CLP, șoarecii WT au prezentat remarcabil mai puțină hemoglobină oxigenată, dar mai multă hemoglobină deoxigenată în rinichi decât șoarecii operați de simulare, în timp ce aceste răspunsuri au fost ameliorate la șoarecii Zdhhc21depMdeP (Fig. 4c). În mod constant, datele cantitative din Fig. 4d au indicat că șoarecii Zdhhc21dp/de au fost mai rezistenți la scăderea indusă de leziuni septice a saturației renale de oxigen.

Deficiența funcțională DHHC21 scade palmitoilarea 1AR și inhibă activarea căii de semnalizare mediată de 1AR și vasoconstricția. Pentru a investiga mecanismul prin care DHHC21 reglează RBF și perfuzia țesutului renal, am determinat rolurile DHHC21 în palmitoilarea și funcția alAR. Atât DHHC21, cât și alAR sunt localizate în membrana plasmatică, ceea ce permite DHHC21 să interacționeze dinamic cu alAR. Mai mult, a fost raportat anterior că al AR co-imunoprecipită cu DHHC21, indicând interacțiunea lor directă de legare15. Am comparat nivelurile de alARpalmitoyation în arterele renale ale șoarecilor WT și Zdhhc214plde după CLP, utilizând captura asistată de rășină (RAC, Fig. S3 suplimentară). După cum este ilustrat în Fig.6a, leziunea septică a dus la o creștere dramatică a lARpalmitoilării în arterele renale ale șoarecilor WT. care a fost redus semnificativ la șoarecii Zdhthc21P. În plus, am evaluat fosforilarea kinazei reglate de semnal extracelular (ERK), un eveniment de semnalizare în aval al activării alAR, în arterele renale ale șoarecilor WT și Zdhhc214pideP după leziuni septice. Nivelul de ERK fosforilat a fost crescut semnificativ de CLP în arterele renale ale șoarecilor WT; acest răspuns a fost diminuat de pierderea funcției DHHC21 (Fig.6b).

Într-un efort de a evalua în continuare impactul funcțional al DHHC21 asupra vasoconstricției mediate de lAR, am izolat arterele renale de la șoarecii WT și Zdhhc214pideP și am provocat vasele cu fenilefrină, un agonist lAR. Datele noastre miograf cu fir nu au arătat nicio diferență semnificativă în vasoconstricțiile induse de potasiu ridicat (60 mM) între arterele renale WT și arterele renale Zdhhc214evae (Fig. S4a suplimentară); totuși arterele renale izolate de la șoarecii Zdhhc21dd au prezentat o reducere semnificativă a vasoconstricției induse de fenilefrină în comparație cu cele ale șoarecilor WT (Fig. 6c, d). Aceste rezultate sugerează rolul critic al palmitoilării lAR mediată de DHHC{10}}în activarea semnalizării a1AR și vasoconstricția mediată de lAR.

S-au observat constatări consistente în arterele mici izolate din rinichi umani viabile. Imaginile noastre de imunofluorescență au arătat dovezi pentru co-localizarea DHHC21 și alAR în arterele renale umane (Fig, 7a). Inhibitorul PAT 2-bromopalmitatul (2-BP) a fost aplicat pentru a bloca funcția DHHC21 în arterele mici izolate din rinichii umani.2-Tratamentul cu BP nu a arătat efecte asupra vasoconstricției induse de potasiu (suplimentar) Fig. S4b); cu toate acestea, arterele mici tratate cu BP au prezentat răspunsuri de constricție tocite la fenilefrină în comparație cu cele tratate cu vehicul (Fig.7b). Colectivitatea, constatările de mai sus au demonstrat că DHHC21 contribuie la afectarea perfuziei renale și a funcției în timpul leziunilor septice prin promovarea palmitoilării alAR și a vasoconstricției renale mediate de al AR.