PGC-1 inhibă inflamazomul NLRP3 prin păstrarea viabilității mitocondriale pentru a proteja fibroza renală
Dec 15, 2023
INTRODUCERE
Boala cronică de rinichi(CKD) este o problemă de sănătate globală și prevalența sa a crescut la nivel mondial [1-3].Pacienții cu BRCau un risc crescut de progresie către boală renală în stadiu terminal și mortalitate [4, 5]. Prin urmare, este important să găsiți ținte terapeutice eficiente pentru a preveniprogresia BRC. tubulointerstițial renalinflamație și fibrozăsunt semne distinctive patologice cheie înprogresia BRC[6–8]. Celulele epiteliale tubulare renale(RTEC) sunt esențiale pentru menținerea homeostaziei fluidelor și electroliților și reprezintă 90% din masa rinichilor. RTEC-urile asigură mitocondriile abundente și au niveluri ridicate de receptor activat de proliferator peroxizomal (PPAR) și coactivator proliferator peroxizomal-1 (PGC-1) pentru a-și îndeplini cerințele energetice metabolice și funcționale [9]. Dovezile tot mai mari sugerează că disfuncția mitocondrială, caracterizată printr-o scădere a numărului și depolarizarea, umflarea și perturbarea cristelor, contribuie în mare măsură la fibroza renală [10, 11]. Mitocondriile deteriorate nu produc eficient adenozin trifosfat (ATP) și eliberează excesivspecii reactive de oxigen(ROS) și ADN mitocondrial (mtDNA), care, în consecință, declanșează răspunsuri inflamatorii în aval și duc la moartea celulelor și leziuni tubulare.
Familia receptorului NOD care conține domeniul pirină 3 (NLRP3) este implicată în diferite răspunsuri imune înnăscute ale gazdei la stimuli microbieni și nemicrobieni [12, 13]. Mai mulți agenți patogeni și semnale endogene de pericol eliberate de celulele deteriorate și moarte activează NLRP3 și duc la formarea unui complex proteic numit „inflammazom” [14]. Inflamazomul NLRP3 induce apoi autoprocesarea și activarea caspazei-1, ceea ce are ca rezultat scindarea pro-citokinelor pentru a maturiza IL-1 și IL{-18. Recent, inflamazomul NLRP3 a fost implicat în patogeneza leziunii renale și a fibrozei [15-17]. În diferite modele animale de boală de rinichi, calea inflamazomului NLRP3 este activată, iar produșii săi finali, IL-1 și IL{-18, pot provoca leziuni tubulare renale [16-19]. Interesant este că celulele intrinseci renale, cum ar fi RTEC-urile și podocitele exprimă NLRP3, sugerând rolul potențial al semnalizării inflamazomului NLRP3 asupra leziunii celulare [20, 21]. Mai mult, studii recente au demonstrat potențiala interacțiune dintre disfuncția mitocondrială și activarea inflamazomului NLRP3 în modelele de leziune tubulară renală [22-24]. Cu toate acestea, nu se știe dacă PGC-1, un regulator cheie al biogenezei mitocondriale, poate regla calea NLRP3 prin modularea dinamicii mitocondriale.
Astfel, am investigat rolul PGC-1 în reglarea activării inflamazomului NLRP3 în RTEC. În special, am examinat dacă viabilitatea și dinamica mitocondrială modificată induse de activarea sau suprimarea PGC-1 pot regla calea inflamazomului NLRP3 și, prin urmare,afectează leziunea renală.
Serviciul de asistență al Wecistanche-Cel mai mare exportator de cistanche din China:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Cumpărați pentru mai multe detalii despre specificații:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
OBȚINEȚI EXTRACT DE CISTANCHE ORGANIC NATURAL CU 25% ECHINACOSIDE ȘI 9% ACTEOSIDE PENTRU INFECȚIA RINCHILOR
METODE
Culturile celulare, tratamentul TGF- 1, activatorul PGC-1 și transfecția la RTEC primare RTEC au fost izolate de la șoarecii C57BL/6. O metodă concisă este descrisă în Metode suplimentare. RTEC-urile subconfluente au fost restricționate cu FBS timp de 24 de ore, iar apoi mediul a fost înlocuit cu mediu FBS DMEM 1% pentru grupul de control și același mediu cu TGF- 1 (5 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN) , SUA) pentru grupul TGF- 1. RTEC-urile au fost recoltate pentru analize de ARN și proteine la 48 de ore după modificările mediului. Activatorul PGC-1, metforminul (1 mM) a fost tratat atât pentru grupul martor, cât și pentru grupul TGF- 1. Dozele de medicamente au fost determinate pe baza testelor noastre anterioare. Mai mult, celulele au fost, de asemenea, transfectate cu plasmidă Ppargc1a (1 ug) (Addgene, Cambridge, MA, SUA) și ARN mic interferent Ppargc1a (siRNA), utilizând reactivi Lipofectamine 2000 și Plus (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). Apoi, la 6 ore după transfecție, mediile au fost schimbate în mediu fără ser și celulele au fost incubate pentru încă 48 de ore. Pentru a inhiba expresia Drp1, dărâmăm gena Drp1 cu lentivirus care conține Drp1 care vizează ARN-ul în ac de păr scurt (shRNA) pentru a infecta RTEC-urile (cu amabilitate oferite de Dr. Yu J, Colegiul de Medicină al Universității Yonsei) [25]. Pentru a explora în continuare relația dintre inflamazomul NLRP3 și leziunea mitocondrială, am obținut și RTEC-uri de la șoareci knockout Nlrp3 (cu amabilitate dăruiți de la Dr. Yu J, Colegiul de Medicină al Universității Yonsei).
Studiu și tratament pe animale
Șoarecii masculi C57BL/6 (6 săptămâni, greutate inițială 2 0 g) au fost achiziționați de la The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, SUA). Animalele au fost menținute într-o cameră cu temperatură controlată (22 grade) într-un ciclu lumină/întuneric de 12 ore. Toate animalele au fost repartizate aleatoriu. La o săptămână după sosire, animalele au fost împărțite în două grupuri și hrănite fie cu o dietă normală (ND; n=10), fie cu o dietă cu 0,2% adenină (Ade; n=10) timp de până la 4 săptămâni. Ambele grupuri ND și Ade au fost, de asemenea, tratate zilnic cu o injecție intraperitoneală de metformină (250 mg/kg), cu o săptămână înainte de începerea dietei. După 4 săptămâni de ND sau Ade, animalele au fost sacrificate și rinichii au fost extrași în timp ce au fost anesteziați cu Zoletil (10 mg/kg) (Virbac, Carros, Franța). O metodă concisă pentru prepararea șoarecilor cu obstrucție unilaterală a ureterului (UUO) este descrisă în Metode suplimentare. Probele de rinichi au fost apoi congelate imediat în azot lichid și depozitate la -80 de grade până la utilizare.
Reacție cantitativă în lanț a polimerazei în timp real, analize Western blot
Nivelurile de transcriere ale genelor, inclusiv Ppargc1a, calea inflamazomului NLRP3, dinamica mitocondrială, proteina 3 indusă de factorul de necroză tumorală (TNFAIP3), markerul de stres oxidativ și markerii profibrotici au fost comparate prin reacția cantitativă în lanț a polimerazei (qPCR). Secvențele de primer utilizate în acest studiu au fost descrise în Tabelul suplimentar 1. Metode mai detaliate sunt descrise în Metode suplimentare. Nivelurile de expresie a proteinei ale PGC-1, căii inflamazomului NLRP3, TNFAIP3, markerului de stres oxidativ și markerilor profibrotici au fost examinate cu analize Western blot. Metodele și informațiile detaliate despre anticorpi sunt descrise separat în Metode suplimentare.
Testarea ansamblului inflamazomului NLRP3
Pentru a determina oligomerizarea proteinei de tip speck asociată apoptozei care conține un domeniu de recrutare a caspazei (ASC), a fost efectuat un test de reticulare mediat de disuccinimidil suberat (DSS) (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA), așa cum este descris. anterior [26]. Pe scurt, RTECS și celulele din probele de țesut renal au fost peletizate prin centrifugare și lizate în 0,5 ml tampon de liză care conține 20 mM Hepes KOH, pH 7,5, 150 mM KCl, 1% NP40, 0,1 mM PMSF și cocktail inhibitor de protează pe gheață. Lizatele celulare au fost centrifugate la 6000 rpm la 4 grade timp de 10 minute. Peletele au fost spălate de două ori cu PBS și apoi resuspendate în 500 ui PBS. Peletele resuspendate au fost reticulate cu DSS proaspăt (2 mM) timp de 30 de minute și apoi peletate prin centrifugare la 6000 rpm timp de 10 minute. Peletele reticulate au fost resuspendate în 30 ui tampon de probă SDS și fracționate pe gel de poliacrilamidă SDS 12% urmată de imunoblot cu anticorp ASC (Cell Signaling Technology, MA, SUA).
Măsurarea nivelului de stres oxidativ
Nivelurile de stres oxidativ (malondialdehidă [MDA]) au fost măsurate în RTEC-uri și țesuturi renale folosind un kit de testare MDA (Abcam, Cambridge, MA, SUA). 10 mg de RTEC au fost omogenizate pe gheață în 300 ul de tampon de liză MDA (Abcam, Cambridge, MA, SUA), apoi centrifugate (13,000 × g, 10 min) pentru a îndepărta materialele insolubile. 10 ml de plasmă au fost amestecați cu 500 ul de H2SO4 42 mM și 125 ul de soluție de acid fosfotungstic la RT timp de 5 min. După centrifugare (13,000 × g, 3 min), peletul a fost resuspendat pe gheață cu 100 ul de H2O dublu distilat. Apoi, 200 ul de soluție și 600 ul de soluție de acid 2-tiobarbituric au fost incubate la 95 de grade timp de 60 de minute înainte de răcire la temperatura camerei în baia de gheață timp de 10 minute. Intensitatea absorbanței la 532 nm a fost proporțională cu nivelul MDA.
Izolarea mitocondriilor
RTEC-urile au fost fracționate în citosol și mitocondrii folosind un kit de izolare a mitocondriilor (BioVision, Inc. CA, SUA) conform protocolului producătorului. Pe scurt, celulele au fost colectate și spălate cu 10 ml PBS rece ca gheață. Celulele au fost centrifugate la 600 × g timp de 5 minute la 4 grade și resuspendate în 1,0 ml de tampon de extracție 1 × Cytosol. Omogenizarea a fost efectuată pe gheață și centrifugată la 1200 × g timp de 10 minute la 4 grade pentru a îndepărta nucleii și celulele intacte. Supernatantul colectat a fost centrifugat la 10,000 x g timp de 30 de minute la 4 grade. Peletele rezultate au fost resuspendate în 1,0 ml de tampon de extracție cu citosol 1 x și centrifugate la 10,000 x g timp de 30 de minute la 4 grade pentru a obține mitocondrii. Mitocondriile obţinute au fost lizate în 30 ul de tampon de liză mitocondrială şi adăugate la 100 ul de amestec de enzime (inclus în trusa de izolare) cu 100 ul de etanol absolut. După centrifugare, peletul rezultat a fost ADNmt. ADNmt citosolic a fost obţinut din supernatant după precipitare cu etanol. Concentrația de ADNmt a fost determinată prin test qPCR.
Evaluarea dinamicii și funcției mitocondriale
Pentru vizualizarea dinamicii mitocondriale, a fost utilizată colorarea imunofluorescentă pentru mitocondrii, MitoTracker Deep Red (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). RTEC-urile au fost fixate în paraformaldehidă 4% și blocate în DPBS care conține 5% ser de iepure normal și 0,1% Tween- 20. Celulele au fost apoi colorate cu NLRP3 anti-șoarece, MitoTracker, urmat de anticorpi anti-iepure de capră conjugați AlexaFluor594-(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) și, în cele din urmă, diapozitivele au fost montate cu DAPI și fotografiate. Apoi am examinat structura mitocondrială prin microscopia electronică cu transmisie standard. RTEC-urile primare au fost fixate cu un amestec de 2% paraformaldehidă și 2,5% glutaraldehidă peste noapte, spălate, deshidratate și încorporate într-o rășină conform procedurilor standard. Mitocondriile au fost examinate la microscopul JEOL 1011 (JEOL, Tokyo, Japonia). Pentru a evalua rata respirației mitocondriale, a fost utilizat un analizor de flux extracelular Seahorse Bioscience × 24 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, SUA). Pentru măsurarea producției mitocondriale de ROS, celulele au fost resuspendate în soluția de sare echilibrată Hank după tratamente adecvate și colorate cu MitoSOX (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) la 37 de grade timp de 20 de minute. Fluorescența celulelor a fost măsurată cu un citometru de flux (FACSVerse, BD Biosciences, San Jose, CA, SUA). Pentru testarea potențialului membranei mitocondriale, a fost utilizat un kit de testare a potențialului membranei mitocondriale de tetrametilrodamină (TMRE) (Abcam, Cambridge, MA, SUA).
REZULTATE
Modificările PGC-1, dinamica mitocondrială și calea inflamazomului NLRP3 în timpul leziunii renale În primul rând, am examinat expresia PGC-1, dinamica mitocondrială și calea NLRP3 în RTEC-urile tratate cu TGF- 1 . În aceste celule, tratamentul cu TGF- 1 a scăzut transcriptul și nivelurile de proteine ale Ppargc1a (Fig. 1A, B și Fig. 1A suplimentară). În consecință, nivelurile de expresie a ARNm ale mitofusinei (Mfn), o genă legată de fuziunea mitocondrială și factorul de transcripție mitocondrial A (Tfam), care reprezintă masa mitocondrială, au fost semnificativ scăzute, în timp ce cea a proteinei 1 asociate cu dinamină (Drp1), un mitocondrial. gena legată de fisiune, a fost crescută în comparație cu controlul (Fig. 1C). În plus, tratamentul cu TGF- 1 a activat semnalizarea inflamazomului NLRP3 evidențiată de niveluri crescute de expresie ale genelor și proteinelor legate de calea inflamazomului NLRP3 (Fig. 1D, E și Fig. 1B suplimentară). Concentrațiile de IL-1 și IL{-18, produșii finali ai căii NLRP3, în lizatele celulare tratate cu TGF- 1-măsurate prin ELISA au fost crescute (Fig. 1F). În plus, nivelurile de expresie ale markerilor fibrotici, inclusiv fibronectina și colagenul 1, și indicele de moarte celulară apoptotică al raportului Bax/bcl-2 și caspaza scindată-3 au fost, de asemenea, crescute (Fig. 1G, H și Fig. 1C suplimentară). ). Aceste constatări au fost similare în modelul de leziune renală indusă de adenină (Fig. 2A-H și Fig. 1D-F suplimentară). Astfel, în timpul leziunii renale, există modificări semnificative ale expresiei PGC-1 și ale dinamicii mitocondriale, împreună cu activarea căii inflamazomului NLRP3.
Fig. 1 Modificări în PGC-1, dinamica mitocondrială și calea inflamazomului NLRP3 în RTEC-urile tratate cu TGF- 1-. Nivelurile de expresie a mARN și a proteinei B ale PGC-1 au fost scăzute în RTEC-urile tratate cu TGF- 1-. Expresia ARNm C a genelor mitocondriale legate de dinamica, inclusiv Mfn, Tfam și Drp1, au fost modificate în RTEC-urile tratate cu TGF- 1-. Nivelurile de expresie a ARNm D și a proteinei E ale căii inflamazomului NLRP3 au fost crescute în RTEC-urile tratate cu TGF{{10}}. F Concentrațiile de IL-1 și IL{-18 evaluate prin ELISA au fost crescute în RTEC-urile tratate cu TGF- 1-. Nivelurile de expresie ale proteinei G mRNA și H ale markerilor fibrotici, inclusiv fibronectină și colagen 1, și markerii de moarte celulară apoptotică ai Bax/bcl-2 și caspazei scindate{-3 au fost crescute în RTEC-urile tratate cu TGF- 1-. Notă: *P < 0,05 față de control. PGC-1 proliferator peroxizomal-coactivator-1; Familia de receptori asemănător NOD NLRP3, care conține 3 domeniul pirin; ASC, proteină de tip speck asociată apoptozei care conține un domeniu de recrutare a caspazei; RTEC celula epitelială tubulară renală; Mfn mitofusin; factorul transcripțional A mitocondrial Tfam; proteina 1 asociată cu dinamina Drp1; Testul imunosorbant ELISA legat de enzime.
PGC-1 restabilește dinamica și morfologia mitocondriale afectate în timpul leziunii renale
Apoi, am examinat dacă PGC-1, un regulator cheie al biogenezei mitocondriale, ar putea atenua dinamica mitocondrială în timpul leziunii renale. Pentru a modula expresia Ppargc1, am folosit în plus plasmida Ppargc1a, siARN împotriva Ppargc1 (siPGC-1) și metformină, un activator indirect al PGC-1. După cum era de așteptat, genele afectate legate de dinamica mitocondrială au fost restaurate prin supraexprimarea Ppargc1. Spre deosebire de aceasta, distrugerea Ppargc1a cu siPGC-1 a scăzut expresia Mfn și Tfam, dar a crescut expresia Drp1 (Fig. 3A-C și Fig. 2A, B suplimentară). Aceste constatări au fost coroborate de experimente suplimentare cu metformină (Fig. 3D-F și Fig. 2C, D suplimentară). Astfel de îmbunătățiri au condus la recuperarea funcției mitocondriale. Restaurarea PGC-1 cu plasmidă Ppargc1a și metformină a îmbunătățit semnificativ potențialul scăzut al membranei mitocondriale și rata scăzută de consum de oxigen în RTEC-urile tratate cu TGF- 1 (Figura suplimentară 3A-D). În concordanță cu modificările PGC-1, expresia proteinei kinazei activate de fosfo-AMP (p-AMPK) a fost scăzută în celulele tratate cu TGF- -, în timp ce tratamentul cu metformin a recuperat aceste expresii (Fig. 3F și Fig. 2E suplimentară). Cu toate acestea, metformina nu a crescut nivelurile de expresie a ARNm și proteinei PGC-1 în RTEC-uri cu tăcere Ppargc1a. Aceste constatări sugerează că AMPK mediază efectul metforminei și PGC -1 este un efector în aval al AMPK (Figura suplimentară 2F, G, J). Efectele benefice ale metforminei asupra dinamicii mitocondriale au fost, de asemenea, abrogate prin tăcere Ppargc1a (Figura suplimentară 2H-J). In vivo, tratamentul cu metformin a restabilit, de asemenea, nivelul de transcriere al Ppargc1 și a inversat expresia modificată a genelor mitocondriale legate de dinamica la șoarecii hrăniți cu adenină și UUO (Fig. 3G-I și Fig. 2K, L, 4A-E suplimentare). Activitatea AMPK de către metformină a fost, de asemenea, confirmată in vitro în modelul alimentat cu adenină (Fig. 3I și Fig. 2M suplimentară). Examinarea cu microscopia electronică a confirmat, de asemenea, pierderea integrității mitocondriilor în RTEC-urile șoarecilor hrăniți cu adenină și UUO. Cu toate acestea, acestea au fost îmbunătățite semnificativ de metformină (Fig. 3J și Fig. 4F suplimentară). Aceste descoperiri sugerează că PGC-1 restabilește dinamica, morfologia și funcțiile afectate în mitocondrii în timpul leziunii renale.
Leziunile mitocondriale pot duce la moartea celulelor renale și la fibroză. Am observat niveluri crescute de expresie ale markerilor fibrotici, inclusiv fibronectina și colagenul 1, și indicele de moarte celulară apoptotică al raportului Bax/bcl-2 și caspaza-3 scindată în RTEC-uri după tratamentul cu TGF- 1. Aceste expresii crescute ale markerilor de moarte celulară au fost atenuate de supraexprimarea PGC -1 și metformină, în timp ce au fost exacerbate de siPGC -1 (Fig. 4A-D și Fig. 5A, B suplimentară). În conformitate cu aceste constatări, nivelurile de expresie ale markerilor fibrotici și indicele de moarte celulară apoptotică au fost semnificativ crescute la șoarecii hrăniți cu adenină și UUO. În schimb, metformina a inversat toate aceste expresii (Fig. 4E, F și Fig. Suplimentar 5C, 6A, B). Colorația tricrom a lui Masson a confirmat, de asemenea, îmbunătățirea fibrozei prin metformină (Fig. 4G). În special, markerii de moarte celulară augmentați și semnalizarea NLRP3 în RTEC-urile tratate cu TGF- au fost inversați de Z-Asp-2,{6- diclorobenzoiloximetilcetonă (Enzo Life Science, Farmingdale, NY, SUA), o pan-caspază. inhibitor, sugerând că leziunea indusă de TGF- -ar putea fi mediată de deteriorarea mitocondrială și apoptoza precoce (fig. 7A-D suplimentară). Aceste descoperiri împreună sugerează că activarea PGC-1 atenuează deteriorarea mitocondrială și scade moartea celulară și fibroza renală.
PGC-1 modulează
Calea de semnalizare a inflamazomului NLRP3 Apoi am explorat în continuare relația dintre calea PGC-1 și inflamazomul NLRP3 în mediarea leziunii renale. Când supraexprimarea PGC-1 a fost indusă utilizând transfecția plasmidei Ppargc1a, nivelurile de expresie ale NLRP3, ASC, IL-1 și IL{-18 au fost diminuate în RTEC-urile tratate cu TGF- 1- ( Fig. 5A, B și Fig. 8A suplimentară). Concentrațiile de IL-1 și IL{-18 în lizatele celulare tratate cu TGF- 1-măsurate prin ELISA au fost, de asemenea, scăzute după transfecția plasmidei Ppargc1a (Fig. 5C). Tratamentul cu metformină a dat o descoperire similară (Fig. 5D, E și Fig. 8B suplimentară). Cu toate acestea, distrugerea Ppargc1a a dus la niveluri de expresie crescute ale genelor și proteinelor legate de calea inflamazomului NLRP3 (Fig. 5A, B și Fig. 8A suplimentară). Mai mult, activarea căii de semnalizare a inflamazomului NLRP3 la șoarecii hrăniți cu adenină și UUO a fost scăzută concomitent de metformină (Fig. 5F, G și Fig. 6C, D, 8C suplimentare). Concentrațiile de IL-1 și IL{-18 în RTEC și lizatele de țesut renal au fost semnificativ scăzute prin tratamentul cu metformină măsurat prin ELISA (Fig. 5H).
Având în vedere capacitatea PGC-1 de a regla dinamica mitocondrială, am testat apoi rolul Drp1 în activarea inflamazomului NLRP3. Semnalizarea inflamazomului NLRP3 a fost redusă semnificativ de distrugerea Drp1. Cu toate acestea, în RTEC-urile cu atât distrugerea Ppargc1a, cât și a Drp1, nivelurile de expresie ale componentelor inflamazomului NLRP3 nu au fost scăzute în comparație cu cele din celulele tratate cu TGF- 1-. În RTEC-urile cu supraexpresie Ppargc1a și deprimarea Drp1, semnalizarea inflamazomului NLRP3 a fost mai puțin activată (Fig. 9A, B suplimentară). Aceste descoperiri sugerează că Drp1 poate media parțial activarea inflamazomului NLRP3, dar alte acțiuni ale PGC-1 sunt implicate în reglarea căii de semnalizare NLRP3.
Am examinat în continuare dacă există un semnal de feedback de la inflamazomul NLRP3. În acest scop, am obținut RTEC-uri prin cultură primară de la șoareci knockout Nlrp3. În aceste celule tratate cu TGF - 1, a existat mai puțină activare a semnalizării NLRP3 decât în celulele omoloage, ceea ce a condus la îmbunătățiri ale dinamicii mitocondriale (Figura suplimentară 10A-E). În consecință, au existat îmbunătățiri concomitente ale modificărilor fibrotice și ale morții celulare în absența Nlrp3 (Figura suplimentară 10F, G). Aceste descoperiri sugerează o posibilă relație bidirecțională între deteriorarea mitocondrială și semnalizarea NLRP3.
Oligomerizarea NLRP3 cu proteina adaptor, ASC, este o etapă cheie a formării complexului inflamazom. Astfel, am examinat dacă ansamblul inflamazomului NLRP3 este afectat de PGC- 1. În RTEC-urile tratate cu TGF- 1-, a fost observată legarea ASC la NLRP3. Această oligomerizare a fost redusă semnificativ prin supraexprimarea PGC-1 sau metformină, în timp ce legarea a fost restabilită prin siPGC-1 (Fig. 6A-C). La șoarecii hrăniți cu adenină, oligomerizarea și activarea NLRP3 au fost confirmate prin legarea ASC la NLRP3 și aceasta a fost eliminată de metformină (Fig. 6D, E).
În cele din urmă, am examinat în continuare conținutul mitocondrial și modificarea concomitentă a expresiei NLRP3. Examinarea la microscopie confocală a arătat că a existat o schimbare reciprocă a intensității MitoTracker Red și a expresiei NLRP3 în RTEC-uri cu sau fără PGC-1 . TGF- 1 a scăzut intensitatea colorării MitoTracker și acestea au fost restabilite prin supraexprimarea PGC-1 și metformină. În schimb, expresia crescută a NLRP3 în RTEC-urile tratate cu TGF- 1-a fost redusă prin supraexpresia PGC-1 și metformină. Cu toate acestea, siPGC-1 a inversat aceste constatări (Fig. 7). În total, aceste constatări indică faptul că ansamblul complexului inflamazom NLRP3 a fost indus în timpul leziunii renale, iar activarea acestei căi a fost atenuată de PGC-1 .
Fig. 5 PGC-1 modulează calea de semnalizare a inflamazomului NLRP3. Nivelurile de expresie a ARNm și a proteinei B ale căii inflamazomului NLRP3 au fost reduse în RTEC-urile tratate cu TGF- 1-cu transfecția plasmidei Ppargc1a, în timp ce a crescut cu siPGC-1. C Concentrațiile de IL- 1 și IL-18 evaluate prin ELISA au fost reduse în RTEC-urile tratate cu TGF{- 1-cu supraexprimarea Ppargc1a. Nivelurile de expresie a ARNm D și a proteinei E ale căii inflamazomului NLRP3 au fost atenuate în RTEC-urile tratate cu TGF- 1-cu metformină. Nivelurile de expresie a ARNm F și proteinei G ale căii inflamazomului NLRP3 și concentrațiile H de IL-1 și IL{-18 evaluate prin ELISA au fost atenuate la șoarecii hrăniți cu adenină cu metformină. Notă: *P < 0.05 față de control; **P <0,05 față de RTEC-urile tratate cu TGF- 1-sau șoarecii hrăniți cu adenină. PGC-1 proliferator peroxizomal-coactivator-1; Familia de receptori asemănător NOD NLRP3, care conține 3 domeniul pirin; Proteină tip speck asociată apoptozei ASC care conține un domeniu de recrutare a caspazei; RTEC celula epitelială tubulară renală; test ELISA imunosorbent legat de enzime; Ade adenina; S-a întâlnit cu metformină.
Fig. 6 PGC-1 modulează oligomerizarea inflamazomului NLRP3 în timpul leziunii renale. Structurile oligomerice A-C ASC testate prin reticulare mediată de DSS au fost observate în RTEC-urile tratate cu TGF- 1-, care au fost atenuate prin supraexprimarea Ppargc1a și metformină, în timp ce au fost agravate de siPGC-1. Structurile oligomerice D, E ASC au fost observate la șoarecii hrăniți cu adenină, care au fost atenuate de metformină. Notă: *P < 0.05 față de control; **P < 0,05 față de RTEC tratați cu TGF- 1-sau șoareci hrăniți cu adenină. PGC-1 proliferator peroxizomal-coactivator-1; Familia de receptori asemănător NOD NLRP3, care conține 3 domeniul pirin; Proteină tip speck asociată apoptozei ASC care conține un domeniu de recrutare a caspazei; Suberat de disuccinimidil DSS; RTEC celula epitelială tubulară renală; Ade adenina; S-a întâlnit cu metformină.
PGC-1 orchestrează eliberarea de mtDNA, stresul oxidativ și TNFAIP3 pentru a regla inflamazomul NLRP3
Pentru a clarifica în continuare legătura mecanicistă dintre PGC-1 și calea inflamazomului NLRP3 în leziunea renală, am examinat mai întâi modificările ADNmt la leziuni celulare, care este cunoscut ca un declanșator al activării inflamazomului NLRP3. Numărul de copii ADNmt a scăzut în fracția mitocondrială și a crescut în fracțiunea citosolică după tratamentul cu TGF- 1, sugerând că ADNmt a fost eliberat din mitocondrii în citosol. În special, aceste modificări au fost restaurate după supraexprimarea Ppargc1a (Fig. 8A).
Apoi, am examinat stresul oxidativ, un regulator pozitiv al inflamazomului NLRP3. În RTEC-urile tratate cu TGF- 1-, stresul oxidativ a fost deosebit de pronunțat în comparație cu controalele evidențiate prin intensitatea crescută a colorării MitoSOX și niveluri crescute de MDA. Tratamentul cu plasmidă Ppargc1a și metformină a atenuat această supraproducție de ROS mitocondriale. În schimb, deprimarea Ppargc1a a crescut și mai mult nivelurile de stres oxidativ în RTEC-urile tratate cu TGF- 1- (Fig. 8B-D). Similar cu constatările studiului in vitro, nivelurile de MDA au fost semnificativ crescute la șoarecii hrăniți cu adenină și UUO. Stresul oxidativ sporit a fost redus de metformină (Fig. 8E și Fig. 6E suplimentară).
În cele din urmă, am examinat în continuare TNFAIP3, care este reglementat de PGC-1 și este, de asemenea, cunoscut ca un regulator negativ al inflamazomului NLRP3. TGF- 1 a redus nivelurile de transcriere ale Tnfaip3 și această expresie scăzută a Tnfaip3 a fost restabilită prin restaurarea PGC-1. În schimb, deprimarea Ppargc1a a dus la o scădere suplimentară a expresiei Tnfaip3 (Fig. 8F, G și Fig. 8D, E suplimentară). Mai mult, a existat o scădere a expresiei TNFAIP3 la șoarecii hrăniți cu adenină și UUO, iar metformina a restabilit această expresie (Fig. 8H și Fig. 6F, 8F suplimentară). În total, aceste descoperiri sugerează că PGC-1 poate regla inflamazomul NLRP3 prin modularea eliberării ADNmt, ROS mitocondrial/stres oxidativ și TNFAIP3.
Serviciul de asistență al Wecistanche-Cel mai mare exportator de cistanche din China:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Cumpărați pentru mai multe detalii despre specificații:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
