Glicozidele de feniletanol din Cistanche Tubulosa suprimă activarea celulelor stelate hepatice și blochează conducerea căilor de semnalizare în TGF-01/smad ca potențiali agenți anti-fibroză hepatică
Mar 05, 2022
Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping You, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang și Tao Liu
Abstract: Cistanche tubulosaeste un medicament pe bază de plante tradițional chinezesc utilizat pe scară largă pentru reglarea imunității șiglicozide feniletanoide(CPhG) sunt printre componentele principale responsabile pentru această activitate. Studiile anterioare au indicat efectele preventive și terapeutice ale CPhG asupra fibrozei hepatice induse de albumina serică bovină (BSA) la șobolani. Scopul studiului a fost de a evalua efectul anti-fibroză hepatică al CPhG și al monomerilor.echinacozidșiacteozidprin inhibarea activării celulelor stelate hepatice (HSC), blocând conducerea căilor de semnalizare în factorul de creștere transformator-p1 (TGF-p1)/smad și determinând că acestea sunt activitate hepatoprotectoare in vitro. Proliferarea HSC a fost în mod evident inhibată după tratamentul cu CPhG (100,50 ^g/mL)/echinacozidă (500,250,125 ^g/ml)/acteozidă (6, 3 ^g/ml), cu valori IC50 de 119,125,520,345 și g/6. mL, respectiv, în testul MTT. Concentrații diferite de CPhG/echinacozid/acteozidnu a afectat toxicitatea celulară asupra HSC conform măsurătorilor lactat dehidrogenazei (LDH). Concentrații diferite de CPhG/echinacozid/acteozida crescut nivelul ARNm și expresia proteinei smad7 și a scăzut nivelurile ARNm ale smad2, smad3 și expresia proteinei smad2, fosfo-smad2 (p-smad2), smad3, fosfo-smad3 (p-smad3) în HSC. În rezumat, aceste rezultate demonstrează că CPhG/echinacozid/acteozidpoate bloca conducerea căilor de semnalizare în TGF-p1/smad și poate inhiba activarea HSC, sugerând căC. tubulosapoate fi astfel un potențial medicament pe bază de plante pentru tratamentul fibrozei hepatice.
Cuvinte cheie: Cistanche tubulosa; feniletanol glicozide dinCistanche(CPHG);echinacozid; acteozid; celule stelate hepatice (HSC); TGF-p1/smad
1. Introducere
devin proliferative și fibrogenice, acumulează ulterior ECM și în cele din urmă se diferențiază în celule fibrogenice asemănătoare miofibroblastelor. Factorul de creștere transformator-.1 (TGF-p 1) este considerat a fi principalul mediator profibrogen. Calea de semnalizare legată de TGF-&1 este un mecanism important al fibrozei hepatice și include în principal semnalizarea dependentă de smad și independentă de smad, iar calea de transducție a semnalizării dependentă de smad este considerată a fi un canal major de semnalizare TGF-p1 . Prin urmare, blocarea căii de semnalizare TGF-p1/smad poate suprima producția de colagen și în cele din urmă poate atenua fibroza hepatică, ceea ce a făcut din această cale o țintă importantă în cercetarea medicamentelor anti-fibroză hepatică din ultimii ani.
În ciuda incidenței mari la nivel mondial a fibrozei hepatice, nu este disponibilă nicio terapie antifibrogenă general acceptată [2—4]. Medicamentele chinezești tradiționale din plante (TCHM) sunt de mare interes pentru tratamentul afecțiunilor hepatice, deoarece unele pot fi utilizate medicamente terapeutice în managementul și prevenirea fibrozei hepatice. În prezent, multe studii sunt concentrate pe potențialele medicamente antifibrogenice care au fost utilizate ca TCHM de mii de ani [5].
Cistanche tubulosa W (familia Orobanchaceae) o plantă parazită, este cultivată pe scară largă în regiunea de sud a Xinjiang din China [6]. Oamenii îl folosesc pentru a revigora rinichii, a hrăni sângele, a relaxa intestinele și a întârzia senescența fără efecte secundare și este listat oficial în Farmacopeea Chineză [7]. C. tubulosa conține o varietate de componente active, inclusiv glicozide feniletanoide (CPhG), iridoide și polizaharide. Printre numeroasele componente active din C. tubulous, CPhG-urile, care prezintă o serie de bioactivități (antioxidant, antioboseală, radiorezistență etc.) sunt principalele componente caracteristice ale acestei plante. În ultimii ani, se raportează că CPhGis au efecte hepatoprotectoare în exces de Hent și pot elimina radicalii copacilor, protejează membranele hepatice și prezintă efecte imunoreglatoare, inhibarea apoptozei, inhibarea exprimării antigenului de suprafață al hepatitei B (HBs Ag) și hepatita B. Activitatea de replicare a ADN-ului antigenului (HBeAg) și virusului hepatitei B (VHB), etc. Nivelul ADN-ului VHB este cel mai sigur indice care reflectă în mod direct activitatea de replicare virală, care este factorul cheie în determinarea istoriei naturale a infecțiilor cronice cu VHB, monitorizarea efectului terapiei antivirale oP și evaluarea prognosticului infecțiilor acute și cronice cu VHB. Indicii de detecție serologică a VHB includ în principal HBsAg, HBeAg etc. [8—11]. Cu toate acestea, există puține rapoarte din literatură cu privire la efectele anti-fibroză hepatică ale CPhG. Studiile anterioare au indicat efectele preventive și terapeutice ale CPhG-urilor asupra fibrozei hepatice induse de albumina serică bovină (BSA) la șobolani, dar activitatea antifibrogenă a CPhG-urilor și a monomerilor săi majori (echinacozidă și acteozidă, Figura 1) nu a fost niciodată evaluată in vitro.
organic Cistanche tubulosa
2. Rezultate
2.1. Determinarea cantitativă a CPhG
CPhG înC. tubulosaconțin două glicozide din alcool feniletilic: echinacozidă și acteo, iar conținutul lor în CPhG a fost detectat prin analiza HPLC (Figura 1) a fi de 42,71 la sută 土 0,42 la sută și 14,27 la sută 土 0.18 la sută, respectiv.
2.2. Activitățile inhibitoare ale CPHG, echinacozide și acteozide pe HSC-T6
CPhG, echinacozidul și acteozidul (62,5-500 卩g/mL) au inhibat viabilitatea celulară a HSC într-o manieră dependentă de concentrație. CPhG-urile și actozidul au arătat o activitate inhibitorie remarcabilă asupra celulelor HSC, cu o inhibare de 50% a valorilor activității de creștere a celulelor (IC50) fiind de 119,125 昭/mL și, respectiv, 6,999 昭/mL. Echinacozidul a prezentat activitate inhibitorie moderată (IC50,520,345 昭/mL; Tabelul 1 și Figura 2).
2.3. Toxicitatea celulară a CPhG, Echin acoside și Acteorida pe HSC
Lactat dehidrogenaza (LDH), o enzimă citoplasmatică stabilă prezentă în toate celulele, este eliberată rapid în supernatantul culturii celulare la deteriorarea membranei plasmatice. Activitatea enzimei în supernatantul culturii se corelează cu proporția de celule lizate [12]. După cum se arată în Tabelul 2, atunci când au fost tratate cu diferite: concentrații de C PhG, echinacozidă și acteozidă, deși activitatea LDH a arătat o ușoară creștere în comparație cu grupul de coirtrol celular, diferența nu a fost semnificativă statistic (p > 0.05 ), indicând faptul că majoritatea membranelor celulare și-au menținut integritatea, iar inhibarea CPhG, echinacozidei și actozidei pe HSC nu se datorează toxicității celulare nespecifice.
2.4. Efectul CPHG, Echinacoside și Acteosde asupra proliferării HSC indusă de TGF-^i
Proliferarea, activarea și diferențierea HSC sunt reglementate de o varietate de factori. Dintre diferiții factori implicați în fibroza hepatică, TGF{{0}} este considerat a fi cel mai important, deoarece poate activa HSC, poate promova diferențierea miofibroblastelor, crește sinteza ECM și inhibă degradarea ECM și eliberează chemokine și citokine implicate în fibroza hepatică [13]. În acest studiu, cu excepția grupului de control, HSC staționare au fost stimulate cu TGF-P1 in vitro pentru a simula formarea fibrozei hepatice precoce și pentru a investiga efectul CPhG, echinacozide și acteozide asupra TGF-p1- proliferarea HSC indusă. După cum se arată în Tabelul 3, în comparație cu grupul de control, grupul TGF-61 a promovat în mod semnificativ proliferarea HSC (p <0.01). comparativ="" cu="" grupul="" tgf-p1,="" tgf-p1="" plus="" cphg="" (tc)="" (50,1{00="" 卩g/ml,="" p=""><0,05), tgf{{18}="" }="" plus="" echinacozidă="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf-p1="" plus="" acteozidă="" (ta)="" (3,0,="" 6,0="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05),="" toate="" au="" inhibat="" remarcabil="" proliferarea="" hsc="" induse="" de="" tgf-|3="" 1="" în="" grade="">
2.5. Expresii ale ARNm smad2)smad3 și smad7 după intervenția CPhG, ochmacoside și actaside asupra HSC
Smad3 și smad2 sunt efectori cheie în aval ai căii de semnalizare TTGF-p [14,15], iar smad7 este un inhibitor al semnalizării smad. Teoretic, expresia crescută a smad7 sau expresia scăzută a smad2/smad3 poate bloca conducerea căilor de semnalizare în TGF-p 1/smad. După cum se arată în Figura 3, analiza PCR cantitafivă în timp real a arătat că expresia ARNm a smad2 și smad3 a indicat un nivel mai scăzut, în timp ce smad7 a indicat niveluri mai mari în grupul de control, în comparație cu grupul TGF-|31. În grupul TC (25, 50, 75,100 |dg/mL), nivelul ARNm al smad2 (p < 0).{{37="" }}5)="" și="" smad3="" (p="">< 0,01)="" au="" fost="" semnificativ="" scăzute="" în="" comparație="" cu="" grupul="" tgf-pf="" și="" au="" fost="" chiar="" similare="" cu="" grupul="" de="" control;="" între="" timp,="" nivelul="" arnm="" al="" smad7="" a="" fost="" crescut="" semnificativ="" în="" grupul="" tc="" (50,="" 75.100="" 卩g/ml)="" (p="">< 0,05,="" p="">< 0,05,="" respectiv="" p="">< 0,01).="" in="" orice="" caz;="" expresia="" smad7="" a="" indicat="" o="" tendință="" ascendentă="" în="" grupul="" tc="" 25="" 卩g/ml="" în="" comparație="" cu="" grupul="" tgf-p1="" (figura="">
Între timp, în comparație cu grupul TGF-p1, expresia ARNm smad2 și smad3 a scăzut semnificativ în TE (62,5, 125, 250, 500 卩g /mL) (p <{23}}.01), iar="" expresiile="" arnm="" smad7="" au="" fost="" semnificativ="" crescute="" în="" grupul="" te="" (125,="" 250.500="" 昭/ml)="" (p="">< 0,01)="" (figura="" 4)="" .="" în="" mod="" similar,="" grupul="" ta="" (0,75,="" 1,5,="" 3,0,="" 6,0="" ^g/ml)="" a="" prezentat="" aceeași="" tendință="" (figura="">
2.6. Influența CPhG, echinacozidă și Ac)eozide asupra căii de semnalizare T GF-^i/smad în HSC
Calea de semnalizare TGF-p 1/smad depinde de smad2, smad3, phospho-smad2 (p-smad2), phospho-smad3 (p-smad3) și smad7, unde p-smad2, p-smad3 sunt formele activate de smad2 și smad3. În acest studiu, au fost analizate nivelurile de proteine ale omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 și smad7. Analiza Western blot a detectat creșteri ale nivelurilor de smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 de către TGF-p1 și inhibarea acestor creșteri de către CPhG, ec hinacoside și acteoside; Între timp, analiza Wesiern blot a evidențiat niveluri de smad7 reglate în sus de către CPhG, echinacozide și acteozide. (Figurile 6—8).
După cum se arată în Figura 6, în comparație cu grupul c on2rol (expresiile proteice ale smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 au fost semnificativ crescute, iar expresia proteinei smad7 a fost scăzută în grupul TGF-p1. În TC (25) , 50, 75, 1{00 昭/mL) grupuri de medicamente, smad/ (Figura 6A), p-smad2 (Figura 6B), smad 3 (Figura 6C), p -smad3 (Figura 6D) expresiile au fost semnificativ mai mici decât cele din grupul TGF-p1 (卩 < 0,01), iar expresia proteinei smad7 (Figura 6E) a fost mai mare decât cea a grupului TGF-S1 (p < 0,01) (Figura 6).
În același timp, expresiile ot smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 și smad7 proteine au fost măsurate după intervenția echinacozidă și acteozidă asupra HSC. După cum se arată în figurile 7 și 8, nivelurile de expresie ale proteinei smad2, smad3, p-smad2 și p-smad3 au fost semnificativ inhibate (p < 0.05="" sau="" p="">< 0.01="" ),="" nivelul="" de="" expresie="" a="" proteinei="" smad7="" a="" fost="" crescut="" (p="">< 0,01),="" în="" comparație="" cu="" grupul="" tgf-p="" 1="" (figurile="" 7="" și="">
3. Discuție
Fibroza hepatică este una dintre principalele cauze de morbiditate și mortalitate la nivel mondial, dar opțiunile terapeutice foarte limitate sunt disponibile în prezent pentru această afecțiune, prin urmare, este foarte important pentru noi să căutăm ținte potențiale pentru intervenția terapeutică pentru a preveni dezvoltarea fibrozei hepatice. 16]. Recent, cercetătorii au descoperit că diferite medicamente pe bază de plante au efecte hepatoprotectoare antifibrotice. Multe TCHM, cum ar fi pastilele Fufang Biejia Ruangan [17] și decoctul Xiao-chai-hu (shosaiko to în Japonia) [18,19] au fost utilizate pe scară largă pentru a trata fibroza hepatică în China, Coreea și Japonia de mii de ani. C. tubulosa conține o varietate de componente active, inclusiv CPhG, iridoide și polizaharide. Fiind una dintre bazele materiale eficiente ale C. tubulosa, CPhG-urile posedă o activitate hepatoprotectoare excelentă, dar există informații limitate despre efectele anti-fibrotice ale GPhC și ale compușilor săi înrudiți. În acest studiu, am investigat modul în care CPhG, echinacozidul și actozidul suprimă activarea HSC și blochează conduita căii de semnalizare în TGF-p1/snaad ca potențiali agenți anti-fibroză heptică in vitro.
Leziunile hepatice de orice etiologie vor duce în cele din urmă la activarea HSC, care suferă o transdiferențiere la celule fibrogenice asemănătoare miofibroblastelor [20]. Adică miofibroblastele
sunt derivate din activarea și proliferarea HSCss [21] și este considerat ca mediator al formării fibrozei hepatice. Din acest motiv, am efectuat studii in vitro pentru a compara ratele de viabilitate celulară ale HSC-urilor expuse la CPhG, echinacozide și acteozide. Rezultatele au arătat că efectul inhibitor al actozidei asupra HSC a fost cel mai puternic, iar efectul CPhG a fost mai bun decât cel al echinacozidei. Serurile medicamentate cu CPhG, echinacozide și acteozide au inhibat toate proliferarea HSC într-o manieră dependentă de doză.
LDH este o enzimă citoplasmatică din celulele vii și nu poate pătrunde în membrana celulară în circumstanțe normale. Când celulele sunt deteriorate, permeabilitatea membranei crește și LDH este eliberat în exteriorul celulei. De obicei, LDH poate detecta gradul de deteriorare celulară [{{0}}]. Investigația a arătat că activitatea LDH a serului medicamentos CPhG, echinacozide și acteozide a arătat doar o ușoară creștere în comparație cu grupul de control celular, iar diferența nu a fost semnificativă statistic (p > 0,05), indicând faptul că cea mai mare parte a membranei celulare și-a menținut integritatea. , iar inhibarea HSC de către CPhG, echinacozide și acteozide nu se datorează toxicității celulare nespecifice.
Când apare leziuni hepatice, hepatocitele activate pot elibera TGF-pi care, la rândul său, activează HSC-T6, prin urmare, TGF-pi are o relație strânsă cu fibroza [25-27]. În acest studiu, CPhG, echinacozidul și acteozidul ar putea fi considerate o strategie terapeutică atractivă pentru inhibarea proliferării HSC după ce HSC-urile au fost stimulate cu wTGF-pi in vitro. Noi speculăm că CPhG, echinacozidul și actozidul pot fi utilizate ca un fel de tratament și/sau prevenire a fibrozei hepatice și inhibă formarea fibrozei hepatice precoce. Formarea fibrozei hepatice este un proces complex de implicare multifactorială și multicelulară. În acest proces patologic, interacțiunile celulă-celulă, celulă-citokine și celulă-matrice constituie o rețea greoaie. În această rețea, dezvoltarea fibrozei hepatice poate fi reglată prin diferite căi și mijloace de semnalizare. TGF-pi este un activator clasic al HSC și un mediator cheie în patogeneza fibrozei hepatice [28]. CPhG, echinacozidul și acteozidul pot inhiba expresiile ARNm și proteinelor legate de calea TGF-pi/smad în HSC.
TGF-pi își exercită efectele celulare prin intermediul căii de semnalizare smad și a fost considerat un mediator cheie în dezvoltarea fibrozei și inflamației hepatice. La legarea TGF-pi la receptorul TGF-p de tip II, receptorul kinaza de tip II fosforilează domeniul GS al receptorului TGF-p de tip I, ducând la activarea receptorului de tip I [29]. Prin acțiunea p-smad2 și p-smad3 la două resturi de serină din motivul SSXS al terminalului lor C, reacțiile în aval de calea de semnalizare smad sunt activate prin activarea receptorului de tip I [30]. P-smad2 și p-smad3 formează complexe oligomerice cu smad4, apoi intră în nucleu și își exercită activitatea de transcripție biologică. Astfel, proteinele smad transmit semnale direct de la receptorul kinazei către nucleu [3i]. Pe de altă parte, smad7 este ferm combinat cu receptorul TGF-pi, ceea ce duce la incapacitatea smad 2/3 de a fi activat, precum și la inhibarea căilor de transducție a semnalului [32]. Smad7 poate acționa pentru a inhiba p-smad2 și p-smad3, translocarea nucleară a complexelor smad activate și activarea (CAGA) (9)-MLP-Luc, rezultând scăderea expresiei colagenului I și inhibarea completă a transducției semnalului TGF-p [33,34]. Rezultatele noastre au arătat că CPhG, echinacozidul și acteozidul pot scădea expresiile ARNm smad2 și smad3 și pot crește expresia ARNm smad7; inhibă expresiile proteinei smad2, p-smad2, smad3 și p-smad3 și reglează în sus expresia proteinei smad7, sugerând că CPhG, echinacozidul și acteozidul joacă, de asemenea, un rol în inhibarea activării HSC și astfel inhibă fibroza hepatică, evidențiind un potențial antifibrotic mecanism.
Secvența efectelor hepatoprotective ale celor trei agenți de testare s-a dovedit a fi actozidă > CPhG > echinacozidă. Pentru a elucida în continuare motivele diferențelor în mecanismul prin care CPhG, echinacozidul și actozidul protejează împotriva fibrozei hepatice, au fost analizate structurile lor chimice. Porțiunea glicozidă de alcool fenetil pare a fi o structură esențială pentru efectul hepatoprotector [35]. Acteozidul (C29H36Oi5) este o glicozidă dublă, iar echinacozida (C35H46O20) este o triglicozidă, adică echinacozida are o glicozidă suplimentară în structură în comparație cu acteozida, ceea ce duce la creșterea dimensiunii sale spațiale. Hepatoprotectorul sau inhibarea activității HSC a actozidei este mai bună decât cea a echinacozidei, ceea ce poate fi din cauza existenței unei piedici sterice.
proteja ficatul: extract de cistanche
4. Sectiunea Experimentala
4.1. Produse chimice și reactivi
TGF-pi a fost achiziționat de la Peprotech (Rocky Hill, NJ, SUA). Linia celulară HSC-T6 a fost achiziționată de la Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd. (Wuhan, China). Dimetil sulfoxid (DMSO) a fost achiziționat de la Sigma Inc. (St. Louis, MO, SUA). Primerii Smad2, smad3 și smad7 au fost produși de Shanghai Sangon Biological and Technological Company (Shanghai, China). Kitul de sinteză a ADNc-ului Revert Aid a fost achiziționat de la Thermo Scientific (Shanghai, China). Kit-ul Quantifast SYBR Green PCR a fost achiziționat de la QIAGEN GmbH (Hilden, Germania). Anticorpul p-smad2 (ser465/467), mAb de iepure Smad3 (C67H9) și mAb de iepure p-smad3 (ser423/425) au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology (Boston, MA, SUA). Anticorpul Smad7 a fost achiziționat de la Boster (Wuhan, China). Anticorpul policlonal Smad2 și anticorpul monoclonal p-actină au fost achiziționate de la Proteintech (Wuhan, China). Detectarea anticorpului primar a fost realizată utilizând soluție de anticorpi de 2 grade (Alk-Phos. Conjugated, Anti-iepure) și soluție de anticorpi de 2 grade (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) achiziționate de la Invitrogen™ (Carlsbad, CA, SUA). Trusa de testare a lactat dehidrogenazei a fost de la Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China).
4.2. Material vegetal
C. tubulosa a fost colectată de la Tulufan, în regiunea autonomă Xinjiang Uirghur din China, în mai 2006. Materialele vegetale au fost identificate ca fiind C. tubulosa de către Jiang He, Institutul de Materia Medică din Xinjiang. Un exemplar de voucher a fost depus la Institutul de Materia Medica din Xinjiang din China.
4.3. Izolarea și purificarea CPhG-urilor și a compușilor săi
Rizomii uscați și tăiați de C. tubulosa (6,0 kg) au fost extrași consecutiv de trei ori sub reflux cu 70 procente etanol (4,8 L), iar solventul a fost apoi îndepărtat din extractele combinate la pentru a se obţine extractul etanolic (1,146 kg). Extractele de etanol au fost purificate cu rășină AB-8 pentru a obține extractul brut de glicoide feniletanol (CPhGs). După dizolvarea în apă, extractul a fost purificat prin cromatografie pe rășină macroporoasă cu sorbție AB-8 pentru a obține părțile totale de fenil etanol glico din C. tubulosa (CPhGs, 210 g). CPhG au fost aplicate pe o coloană ODS OP{{10}} și eluate succesiv cu amestecuri de MeOH-H?.(0:1 -^1:0). Eluate au fost combinate în cinci subfracţii conform comportamentului TLC utilizând sistemul de solvenţi CHCh-MeOH-Ha. (6:4:0,5). Petele au fost vizualizate după pulverizarea cu 1% FeCih. Diverse fracții au fost purificate în mod repetat prin cromatografie pe coloană Sephadex LH-20 cu metanol ca eluent și două glicozide feniletanol au fost izolate din CPhG. Structurile lor au fost confirmate ca echinacozidă (C35H46O20) și actozidă (C29H36O15) utilizând MS, 1H- și MC-RMN [35], puritățile care au fost determinate a fi de 99,17% și, respectiv, 98,92% prin UV-HPLC. Structurile echinacozidei și acteozidei sunt prezentate în figura 9.
4.5. Determinarea cantitativă a CPhG
Cromatografia lichidă (HPLC) (LC{{0}}Un instrument HPLC, Shimadzu Co., Kyoto, Japonia) a fost utilizată pentru a analiza conținutul de coside echina și o cteozidă din CPhG. O coloană Phenomenex Gemini ODS (250 x 4,6 mm, 5 |^m) a fost utilizată la 30 de grade. O fază mobilă izocratică constând din metanol-acetonitril-1 procente de acid acetic (15:10:75, v/v/v) a fost utilizată pentru o rulare de 40 de minute, la un debit de 0,6 mL/min, cu UV detecție la 334 nm.
4.6. Cultură de celule
Celulele HSC au fost cultivate în mediu Eagle modificat de Dulbecco (Glucoză ridicată) (DMEM, Beijing, China) suplimentat cu 10 procente de ser fetal bovin (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, SUA), 10 0 UI/mL penicilină și 100 ^g/mL streptomicină (HyClone, Logan, UT, SUA) într-un incubator umidificat la 37 de grade cu 5% CO2. Aceste celule au fost subcultivate în mod regulat prin soluție de tripsină 0,25% (1x) (HyClone, Logan, UT, SUA) și mediul a fost schimbat la fiecare 2 zile. Inițial, celulele au fost cultivate cu DMEM care conține 10% FBS timp de 48 de ore. Mediul a fost apoi înlocuit cu DMEM fără FBS pentru a înfometa celulele timp de 12 ore. Aceste celule au fost propagate timp de 48 de ore și, după 48 de ore, serul a fost înfometat cu 0,5% FBS timp de 12 ore înainte de a adăuga 5 ng/mL TGF-&1,
4.7. Determinarea valorilor IC50
După o incubare peste noapte în mediu de înfometare care conține {{0}},5% FBS, celulele HSC au fost însămânțate într-o placă de 96-godeuri la o densitate de 5 x 104 celule/ml timp de 24 de ore. Celulele HSC au fost tratate cu CPhG, echinacozidă și acteozidă la diferite concentrații (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250 și 500 ^g/mL) timp de 48 de ore. Fiecare concentrație a avut patru godeuri. La sfârșitul tratamentului, 20 卩L MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bromură de difeniltetrazoliu] (Sigma; s-au adăugat 5 mg/mL) și celulele au fost incubate încă 4 ore. DMSO (200 rL) a fost adăugat în fiecare godeu după îndepărtarea supernatantului. După agitarea plăcii timp de 10 minute pe un agitator, valorile IC50 au fost obținute prin măsurarea absorbanței la o lungime de undă de 490 nm folosind un instrument de etichetare enzimatică (Benchmark PLUS, Hercules, CA, SUA), acest test a fost făcut în trei exemplare. Valorile IC50 ale CPhG, echinacozidei și acteozidei au fost 119,125, 520,345 și, respectiv, 6,999 Rg/mL.
4.8. Efectele de inhibare a proliferarii celulare si viabilitatea celulara
Celulele HSC au fost expuse la diferite concentrații de CPhG (25,50,100 Rg/mL), echinacozidă (125,250,500 Rg/mL) și actozidă (1,5,3, 6 Rg/mL). Diferite concentrații de CPhG, echinacozidă și acteozidă au fost aplicate pe placă în patru godeuri consecutive și incubate timp de 48 de ore. Efectele de inhibare a proliferării celulare și nivelul de viabilitate celulară (pe baza măsurării activității LDH eliberate din celulele deteriorate în supernatant [36]) au fost determinate printr-un test MTT. Rata de inhibiție a fost calculată folosind următoarea formulă [37]:
Rata de inhibiție (procent) " [1 — (absorbanța medie a grupului experimental/absorbanța medie a grupului martor)] x 100 la sută
Conform instrucțiunilor trusei,
LDH (U/L) {{0}} (DO măsurată — OD de control)/(OD standard — OD vid) x 0,2 mmol/L x 1000
Studiul nostru preliminar a arătat că CPhG, echinacozidul și acteozidul nu au afectat viabilitatea celulelor.
4.9. Activități anti-proliferative ale TGF-^1
HSC activat de TGF-p1 a fost mult timp considerat a fi asociat cu fibroza hepatică, iar inhibarea creșterii HSC a fost propusă ca metodă de tratare a fibrozei hepatice [36,38]. Efectele anti-proliferative ale CPhG, echinacozidei și acteozidei asupra HSC activate de TGF-p1 au fost determinate printr-un test MTT [39]. Folosind procedurile și concentrațiile de medicamente descrise,
grupurile experimentale au inclus grupul de control, grupul TGF-pi, TGF-pi plus grupuri de medicamente cu concentrație diferită. Toate grupurile de celule, cu excepția grupului de control, au fost cultivate cu DMEM care conține 5.0 ng/mL TGF-p1 (fără FBS) timp de 24 de ore. Activitatea inhibitoare asupra proliferării celulare a fost calculată ca 100 x (absorbanța compusului tratat - absorbanța luminii de fundal)/(absorbanța modelului - absorbanța luminii de fundal).
4.10. Transcripție inversă-reacție în lanț a polimerazei (RT-PCR)
Nivelul de expresie ARNm al smad2, smad3 și smad7 a fost determinat prin PCR în timp real. Pentru a determina expresia ARNm în celulele HSC, celulele (5 x 104 celule) au fost însămânțate în plăci cu șase godeuri cu 3,0 mL DMEM cu 10% FBS și incubate peste noapte la 37 de grade și 5 procente CO2. După ce mediul de cultură a fost schimbat în DMEM fără ser, CPhG-uri (100,50,25 µg/mL), echinacozidă (500,250,125 µg/mL) și actozidă (6, 3,1,5 µg/mL) au fost adăugate în godeuri. După incubare timp de 48 de ore cu CPhG și compoziții de monomeri, ARN-ul total a fost extras folosind reactiv TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) și agitat energic cu cloroform timp de 15 s. După ce a lăsat să stea la temperatura camerei timp de 3 minute, lizatul a fost centrifugat la 12,000 xg timp de 15 minute la 4 grade. ARN-ul în faza apoasă a fost precipitat cu izopropanol, iar faza apoasă superioară a fost transferată într-un tub nou de microcentrifugă. ARN a fost precipitat prin adăugarea de 0,75% etanol, după care tubul de microcentrifugă și centrifugat la 12,000 xg la 4 grade timp de cel mult 5 minute. Supernatantul a fost îndepărtat și ARN-ul a fost uscat la temperatura camerei timp de 5-10 min. Primerii (Sangon) au fost proiectați utilizând Primerul lotului 3 și sunt enumerați în Tabelul 4. Rezultatele au fost normalizate la ARNm al genei de întreținere p-actină ca control intern și sunt prezentate ca niveluri relative de ARNm. Reacțiile au fost efectuate cu 8 |^L iQ SYBR Green Supermix, 1 10 pereche de primeri pM, 8,5 apă distilată și 2,5 rL cADN.
Fiecare reacție în lanț a polimerazei a fost efectuată în următoarele condiții: 95 de grade timp de 3 minute, apoi 40 de cicluri de 10 s la 95 de grade, 30 s la 55 de grade și 10 s la 55 de grade -95 grade pentru extensie, urmate de o singură măsurare a fluorescenței. Rezultatele finale au fost descrise cu valorile relative (2_AACt). Calculul și analiza au fost efectuate de sistemul de detecție PCR în timp real iQ5.
4.11. Analiza Western Blot
Extractele de celule întregi au fost preparate utilizând tampon de testare radioimunoprecipitare (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) cu 1% cocktail-uri de inhibitor de protează Halt și 1% cocktailuri de inhibitor de fosfatază Halt (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Proteina totală a fost utilizată pentru detectarea smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 și smad7. Concentrația de proteine a fost măsurată și cuantificată prin metoda Bradford. Proteina (10-30 Rg) a fost separată pe un gel SDS-PAGE de 10 procente și transferată pe membrane de fluorură de poliviniliden (PVDF) (Millipore, Boston, MA, SUA). Membranele au fost blocate timp de 1 oră la temperatura camerei cu albumină serică bovină 5%, iar anticorpii primari (anticorp policlonal smad2, anticorp p-smad2, mAb de iepure smad3 și mAb de iepure p-smad3, diluție 1:1000; mAb de iepure de smad7, 1). :200 diluție, anticorp monoclonal p-actină, diluție 1:5000) au fost incubate la 4 grade peste noapte. Alk-Phos corespunzător. anticorpii secundari conjugați au fost incubați la temperatura camerei. În cele din urmă, membranele au fost spălate de trei ori cu 1 x Tris-HCl salin cu 0,1% Tween 20, iar semnalele au fost scanate și vizualizate cu un sistem de imagistică GEL DOC XR (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA). Analiza densitometrică a fost efectuată pe proteinele de interes și normalizate la p-actină prin software-ul GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). p-actina a fost folosită ca control intern.
4.12. Analize statistice
Datele au fost exprimate ca medie 土 abatere standard (SD). Analizele statistice au fost efectuate folosind software-ul SPSS 16.0 (Universitatea Medicală din Xinjiang). Analiza probit a fost utilizată pentru a analiza valorile IC50. Semnificația diferenței a fost calculată prin testul ANOVA unidirecțional, iar valorile cu p < 0,05="" au="" fost="" considerate="" a="" fi="" semnificative="">
5. Concluzii
În concluzie, CPhG-urile din C. tubulosa și componentele sale echinacozide și acteozide prezintă efecte anti-fibrotice semnificative. Dintre acestea, activitatea actozidei este cea mai puternică, în timp ce activitatea CPhG este între cei doi compuși. Inhibarea activării semnalizării TGF-p1/Smad poate fi mecanismul de bază prin care CPhG-urile protejează împotriva bolilor hepatice cronice asociate cu fibroză, iar echinacozidul și acteozidul sunt baza materialului anti-fibrotic eficient al C. tubulosa.
Mulțumiri:Această cercetare a fost susținută de Fundația Națională de Științe Naturale din China (81260624). Autorii ar dori să-și exprime sincere mulțumiri profesorului Tao Liu pentru îmbunătățirea scrisului din această lucrare.
Contribuții ale autorului:TL, JZ, S.-PY, LM și S.-LZ au conceput și proiectat experimentele. S.-PY, TL și JZ au analizat datele. S.-PY și JZ au scris manuscrisul. TL, LM și JZ au revizuit manuscrisul. Toți autorii au citit și au aprobat manuscrisul final.
Conflicte de interes:Autorii nu declară niciun conflict de interese.
Referințe
1. Subramoniam, A.; Pushpangadan, P. Dezvoltarea fitomedicinei pentru bolile hepatice. Ind. J. Pharmacol. 1999, 31,166-175.
2. Friedman, SL Mecanismele bolii: Mecanismele fibrozei hepatice și implicațiile terapeutice. Nat. Clin. Practică. Gastroenterol Hepatol. 2004,1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. Friedman, SL; Roll, FJ; Boyles, J.; Bissell, DM Lipocite hepatice: principalele celule producătoare de colagen ale ficatului normal de șobolan. Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. Friedman, SL; Bansal, MB Inversarea fibrozei hepatice一Realitate sau fantezie? H叩atology 2006, 43, S82-S88. [CrossRef] [PubMed]
5. Ahmad, A.; Ahmad, R. Înțelegerea mecanismului fibrozei hepatice și a potențialelor abordări terapeutice. Saudi J. Gastroenterol. 2012,18,155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. Petru, H.; Corb; Zhang, LB Orobanchaceae Ventenat. În Flora of China, ed. 23; Comitetul editorial al Florei Chinei: Academia Chineză de Științe, Beijing, China, 2013; pp. 1-16.
7. Comisia de Farmacopeea Chineză a Ministerului Sanitar al Republicii Populare Chineze. Farmacopeea Chineză; Partea 1; Editura industriei chimice: Beijing, China, 2010; p. 126.
8. Li, J.; Huang, D.; El, L. Efectul roucongrongului (Herba Cistanches Deserticolae) asupra toxicității reproductive la șoareci indus de glicozidul Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J. Tradit. Bărbie. Med. 2014, 34, 324-332. [CrossRef]
9. Xing, Y.; Liao, J.; Tang, Y.; Zhang, P.; Tan, C.; NIH.; Wu, X.; Li, N.; Jia, X. ACE și inhibitori de agregare a trombocitelor de la Tamarix hohenackeri Bunge (planta gazdă a Herba Cistanches) crescând în Xinjiang. Pharmacogn. Mag. 2014,10,111-118. [PubMed]
10. Jia, Y; Guan, Q.; Jiang, Y.; Salh, B.; Guo, Y.; Tu, P.; Du, C. Ameliorarea colitei induse de dextran sulfat de sodiu la șoareci prin extract de Cistanche tubulosa îmbogățit cu echinacozide. Phytother. Res. 28, 2014 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches stimulează ciclul redox al glutationului celular prin speciile reactive de oxigen generate de respirația mitocondrială în cardiomiocitele H9c2. Farmacia. Biol. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. Martin, A.; Clynes, M. Fosfataza acidă: obiectiv pentru testele de toxicitate in vitro. Celula vitro. Dev. Biol. 1991, 27, 183-184. [CrossRef]
13. Lechuga, CG; Hernandez-Nazara, ZH; Dominguez Rosales, JA; Morris, ER; Rincon, AR; Rivas-Estilla, AM; Esteban-Gamboa, A.; Rojkind, M. TGF-01 modulează expresia metaloproteinazei-13 matricei în celulele stelate hepatice prin mecanisme complexe care implică p38MAPK, PI3-kinaza, AKT și p70S6k. A.m. J. Physiol. Gastrointest Ficat Physiol. 2004, 287, G974-G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Nguyen, J.; Tang, SY; Nguyen, D.; Alliston, T. Load reglează formarea osoasă și expresia sclerostinei printr-un mecanism dependent de TGFp. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. Pessah, M.; Marais, J.; Prunier, C.; Ferrand, N.; Lallemand, F.; Mauviel, A.; Atfi, A. C-Jun se asociază cu oncoproteina Ski și suprimă activitatea transcripțională Smad2. J. Biol. Chim. 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. Ding, N.; Yu, RT; Subramaniam, N.; Sherman, MH; Wilson, C.; Rao, R.; Leblanc, M.; Coulter, S.; Tiv.; Scott, C.; et al. Un receptor de vitamina D/circuitul genomic SMAD poartă răspunsul fibrotic hepatic. Celula 2013,153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. Yang, FR; Fang, BW; Lou, JS Efectele pilulelor Fufang Biejia Ruangan asupra fibrozei hepatice in vivo și in vitro. Lumea J. Gastroenterol. 19, 2013, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. Sakaida, I.; Hironaka, K.; Kimura, T.; Terai, S.; Yamasaki, T.; Okita, K. Medicina pe bază de plante Sho-saiko-to (TJ-9) crește expresia metaloproteinazelor matricei (MMP) cu expresia redusă a inhibitorului tisular al metaloproteinazelor (TIMP) în celulele stelate de șobolan. Life Sci. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. Chen, M.; Chen, J.; Tsai, C.; Wang, W.; Chang, D.; Tu, DG; Hsieh, HY Rolul TGF-01 și al citokinelor în modularea fibrozei hepatice de către Sho-saiko-to în modelul legat de conductele biliare de șobolan/s. J. Etnofarmacol. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. Bolarin, DM; Azinge, markeri biochimici EC, componente extracelulare în fibroza hepatică și ciroza. Nig. QJ Hosp. Med. 2007,17, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. Kong, D.; Zheng, S.; Lu, Y. Sursa și rolul miofibroblastelor în fibroza hepatică. Bărbie. Pharmacol. Taur. 27, 2011 297-300.
22. De Lavor, MSL; Binda, NS; Fukushima, FB; Caldeira, FMC; Da Silva, JF; Silva, CMO; de Oliveira, KM; Martins Bde, C.; Torres, BB; Rosado, IR; et al. Model de ischemie-reperfuzie în măduva spinării de șobolan: studiu de viabilitate celulară și de semnalizare a apoptozei. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. Bahadar, H.; Maqbool, F.; Niaz, K.; Abdollahi, M. Toxicitatea nanoparticulelor și o privire de ansamblu asupra modelelor experimentale actuale. Iran Biomed. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]
