Extract de Cistanche Deserticola crește formarea osoasă în osteoblaste
Mar 05, 2022
Persoană de contact: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 e-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Te-Mao Liun, Hsin-Chih Huangb, Chen-Ming Suc, Tin-Yun Houn, Chi-Ming Wuun, Wen-Chi Chend,Yi-Chin Fonga, eși Chih-Hsin Tangf,c
Abstract
Obiectivele:Am investigat efectulCistanche deserticola Ma. (CD) privind formarea oaselor prin osteoblaste cultivate.MetodeTestul de formare a nodulilor mineralizați a fost utilizat pentru a examina efectele in vitro ale CD-ului asupra formării osoase. Fosfataza alcalină (ALP), proteinele morfogenetice osoase (BMP)-2 și expresia ARNm osteopontinei (OPN) au fost analizate prin reacția cantitativă în lanț a polimerazei în timp real. Mecanismul de acțiune al extractului de CD-uri a fost investigat folosind western blotting. Efectul anti-osteoporotic in vivo al extractului de CD a fost evaluat la șoarecii ovariectomi.Principalele constatăriExtractul de CD nu a avut niciun efect asupra proliferării, migrației sau vindecării rănilor osteoblastelor cultivate, dar a crescut ALP, BMP-2 și ARNm OPN și mineralizarea oaselor. Mitogen activat protein kinaza (MAPK) sau inhibitori ai factorului nuclear (NF)-kB redus CD extract induse de formarea osoasă și ALP, BMP-2, și expresia OPN. Cu toate acestea, extract de CD-ul nu a afectat osteoclastogeneza. În plus, extractul de CD a prevenit pierderea osoasă indusă de ovariectomie in vivo.ConcluziileCD-ul poate fi un nou agent de formare osoasă pentru tratamentul osteoporozei.
Introducere
Osul este un țesut complex compus din mai multe tipuri de celule care suferă un proces continuu de reînnoire și reparare numit "remodelare osoasă". Două tipuri majore de celule responsabile pentru remodelarea osoasă sunt osteoclastele, care resorb osul, și osteoblastele, care formează os nou. Remodelarea osoasă este reglementată de mai mulți hormoni sistemici (de exemplu, hormon paratiroidian, 1, 25-hidroxivitamina D3, hormoni sexuali și calcitonină) și factori locali (de exemplu, oxid nitric, prostaglandine, factori de creștere și citokine). [1]
Osteoporoza rezulta atunci cand resorbtia si formarea osului sunt necoordonate, iar descompunerea osoasa in exces depaseste constructia osoasa. [2] Tratamentele actuale pentru osteoporoză includ bifosfonați, calcitonină și estrogen, care sunt inhibitori de resorbție osoasă care mențin masa osoasă prin inhibarea activității osteoclastelor. [3] Cu toate acestea, efectul acestor medicamente în creșterea sau recuperarea masei osoase este relativ mic, cu siguranță nu mai mult de 2% pe an. [3] Prin urmare, este nevoie de agenți de construire a oaselor, cum ar fi teriparatida, care stimulează formarea de noi oase și corectează schimbarea microarhitecturii trabeculare care este caracteristică osteoporozei stabilite. [4,5] Deoarece formarea osoasă nouă este în primul rând o funcție a osteoblastului, agenții care acționează fie prin creșterea proliferării celulelor liniei osteoblastice, fie prin inducerea diferențierii osteoblastelor pot spori formarea oaselor. [5,6]
Deși mecanismele osteoporozei rămân neclare, acestea sunt probabil legate de disponibilitatea sau efectele scăzute ale factorilor de creștere osoasă, cum ar fi proteinele morfogenetice osoase (BMP). [7] BMP, care sunt legate structural de superfamilia factorului de creștere b transformant, au fost identificate inițial prin capacitatea lor de a induce formarea oaselor ectopice la rozătoare. [8] PIF-urile joacă un rol important în formarea oaselor și diferențierea celulelor osoase prin stimularea activității fosfatazei alcaline (ALP), precum și a sintezei proteoglicanilor, colagenului și osteopontinei (OPN). [9] Un studiu recent a descoperit o legătură între osteoporoză și polimorfismele specifice din genele BMP-2, ALP și OPN, sugerând că acestea sunt asociate cu dezvoltarea osteoporozei. [10]
Cistanche deserticola Ma.(Orobanchaceae; abreviat ca CD) este o planta nativa in China si este utilizat pe scara larga in medicina traditionala ca agent terapeutic datorita proprietatilor sale sedative, analgezice si imunostimulatoare. [11] Studiile farmaco-logice moderne au arătat că extractele de CD-uri pot stimula imunitatea,[12] curăța radicalii liberi[13], și de a crește activitatea superoxid dismutaza. [14] Agentii antiinflamatori si antioxidanti au potentialul de a trata osteoporoza prin cresterea formării osoase si/sau suprimarea resorbtiei osoase. [15,16] Cu toate acestea, efectul CD-ului asupra funcției celulelor osoase nu a fost încă determinat. Aici, raportăm că extractul de CD-uri nu a afectat proliferarea, migrarea sau activitatea de vindecare a rănilor osteoblastelor cultivate, dar a crescut ALP, BMP-2 și expresia OPN și mineralizarea oaselor. În plus, arătăm că căile de semnalizare mitogen-activat protein kinaza (MAPK) și factorul nuclear (NF)-kB pot fi implicate în creșterea mediată de CD-uri în expresia genelor și mineralizarea oaselor. În schimb, extractul de CD-uri nu a suprima osteoclastogeneza in vitro. În special, tratamentul șoarecilor cu extract de CD a împiedicat pierderea osoasă indusă de ovariectomie in vivo. Prin urmare, datele noastre sugerează că CD-ul poate fi utilizat pentru a stimula formarea oaselor pentru tratamentul osteoporozei.
Cistanche deserticola
Materiale și metode
Extract de Cistanche deserticola și materiale
Extract de CD-uri a fost achiziționat de la Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwan). Extracția și izolarea CD-ului au fost urmate așa cum s-a descris anterior (pe baza datelor spectrale au identificat compoziția chimică, inclusiv beta-sitosterolul, daucosterolul, acidul succinic, triacontanolul, actozida, betaina și polizaharida). [17] Anticorpii policlonali de iepure specifici kinazelor p-extracelulare reglementate de semnal (ERK), ERK, p-p38, p38, p-c-Jun N-terminal kinazs (JNK), JNK, p-p65 și p65 au fost achiziționați de la Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, SUA). Kitul ELISA cu osteocalcină a fost achiziționat de la Biosource Technology (Nivelles, Belgia). Telopeptidele C-terminale ale kitului ELISA de colagen de tip I au fost obținute de la Cross Laps (Herlev, Danemarca). Mutantul dominant-negativ p38 a fost furnizat de Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, SUA). Mutantul dominant-negativ JNK a fost furnizat de Dr. M. Karin (Universitatea din California, San Diego, SUA). Mutantul dominant-negativ ERK2 a fost furnizat de Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Toți ceilalți reactivi au fost obținuți de la Sigma-Aldrich (St Louis, SUA).
Cultura celulară
Linia celulară osteoblastică murină MC3T3-E1 a fost achiziționată de la American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, SUA). Celulele au fost cultivate în 95% aer, 5% CO2 cu a-MEM care a fost suplimentat cu HEPES de 20 mm și 10% ser fetal de vițel inactivat termic, 2 mm-glutamină, penicilină (100 U/ml) și streptomicină (100 mg/ml).
Măsurarea formării nodulilor mineralizați
Formarea nodulilor mineralizați a fost evaluată conform descrierii. [18] Pe scurt, osteoblastele au fost cultivate într-un mediu care conținea vitamina C (50 mg/ml) și b-glicerofosfat (10 mm) timp de două săptămâni, iar mediul a fost schimbat la fiecare trei zile. După incubarea cu extract de CD timp de 12 zile, celulele au fost spălate de două ori cu soluție salină tamponată tris de 20 mm care conține
0,15 m NaCl (pH 7,4), fixat în etanol rece ca gheața 75% (v/v) timp de 30 de minute și uscat la aer. Depunerea calciului a fost determinată cu ajutorul colorării roșu-S alizarin. Pe scurt, celulele fixate cu etanol și matricea au fost colorate timp de 1 h cu 40 mm alizarin roșu-S (pH 4.2) și clătite extensiv cu apă. Pata legată a fost eluată cu clorură de cetylpyridinium de 10% (g/v), iar alizarinul roșu-S din probe a fost cuantificat prin măsurarea absorbției la 550 nm și comparat cu o curbă standard. Un mol de alizarin roșu-S leagă selectiv aproximativ două alunițe de calciu.
Reacție cantitativă în lanț a polimerazei în timp real
ARN-ul total a fost extras din osteoblaste folosind un kit TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). Transcrierea inversă a fost efectuată folosind 2 mg ARN total și un grund oligo(dT). [19,20] Reacția cantitativă în lanț a polimerazei în timp real (qPCR) a fost efectuată folosind TaqMan® one-step PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, SUA). S-a adăugat cDNA totală (100 ng per reacție de 25 ml) cu grunduri specifice secvenței și sonde Taqman®. Toate grundurile și sondele genelor țintă au fost achiziționate în comerț, inclusiv b-actina ca control intern (Applied Biosystems). Testele qPCR au fost efectuate în trei exemplare pe un sistem de detectare a secvențelor Ste- pOnePlus (Applied Biosystems). Condițiile de ciclism au fost activarea polimerazei de 10 minute la 95 °C, urmată de 40 de cicluri de 95 ° C pentru 15 s și 60 ° C pentru 60 s. Pragul a fost stabilit deasupra fundalului de control non-șablon și în faza liniară de amplificare a genei țintă pentru a calcula numărul ciclului la care a fost detectată transcrierea (ct notat).
Analiza western blot
Lizatele celulare au fost preparate așa cum s-a descris anterior. [21,22] Proteinele au fost rezolvate de SDS-PAGE și transferate în membranele difluoridei de polivinil immobilon (Millipore, Billerica, SUA). Blots au fost blocate cu 4% albumină serică bovină timp de 1 h la temperatura camerei și apoi sondate cu anticorpi anti-umani de iepure împotriva p-65, sau p-p65 (1: 1000) timp de 1 h la temperatura camerei. După trei spălări, patele au fost incubate cu anticorp secundar anti-iepure conjugat cu peroxidază de măgar (1: 1000) timp de 1 h la temperatura camerei. Petele au fost vizualizate prin chemiluminescență îmbunătățită folosind filmul X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, SUA).
Osteoporoza indusă de ovariectomie
Șoarecii ICR de sex feminin, în vârstă de patru săptămâni, 22 ~ 28 g, au fost utilizați pentru acest studiu. Șoarecii au fost ovariectomiți bilateral sub tricloro- acetaldehidă (100 mg/kg) anestezie și șoareci de control au fost sham-operate (Sham) pentru comparație. Densitatea minerală osoasă și conținutul de minerale osoase au fost măsurate după administrarea orală a diferitelor concentrații de extracte de CD la fiecare două zile timp de patru săptămâni. Densitatea minerală osoasă totală a corpului și conținutul de minerale osoase au fost determinate de un absorptiometru cu raze X cu dublă energie (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, SUA) folosind un mod pentru subiecți mici, așa cum este descris anterior. [18,23] Toate protocoalele au respectat orientările instituționale și au fost aprobate de Comitetul de îngrijire a animalelor al Universității de Medicină din China.
Analiza statistică
Analiza statistică a fost efectuată folosind Prism 4.01soft- ware. (GraphPad Software Inc., San Diego, SUA). Valorile date sunt medii ± SEM. Analiza statistică între două probe a fost efectuată cu ajutorul testului t student. Comparațiile statistice ale mai mult de două grupuri au fost efectuate folosind o analiză unidirecțională a varianței cu testul posthoc al lui Bonfer- Roni. În toate cazurile, P< 0.05="" was="" considered="">
Extract de Cistanche deserticola
Rezultatele
Extractul de Cistanche deserticola creste mineralizarea oaselor prin osteoblaste
Adăugarea extractului de CD-uri pentru 24 sau 48 h nu a afectat proliferarea celulelor osteoblastului MC3T3-E1 de șoarece într-un test MTT (date neprezentate). Deoarece diferențierea osteoblastelor este un proces complex care implică proliferarea celulară și migrarea, am testat, de asemenea, capacitatea de migrare a celulelor MC3T3-E1 după tratamentul cu extract de CD. Folosind Transwell și teste de vindecare a rănilor, am constatat că extractul de CD nu a afectat migrarea osteoblastelor (datele nu au fost afișate). Formarea nodulilor mineralizați este unul dintre markerii maturării osteoblastelor. Colorarea roșu S alizarin a arătat că nodulii mineralizați s-au format atunci când osteoblastele au fost cultivate timp de două săptămâni într-un mediu care conține vitamina C (50 mg/ml) și b-glicerofosfat (10 mm), iar acest lucru a fost crescut într-o manieră dependentă de concentrație prin adăugarea de CD (Figura 1a). Prin urmare, extractul de CD a indus formarea nodulilor osoși prin osteoblaste cultivate, dar nu proliferarea sau migrarea lor. Am examinat, de asemenea, rolul extractului de CD-uri în osteoclastogeneza indusă de RANKL, dar nu a găsit nici un efect (date nu sunt prezentate).
Extractul de cistanche deserticola crește fosfataza alcalină, proteina morfogenetică osoasă-2 și expresia osteopontinei în osteoblastele cultivate
Osteoblastele diferențiate prezintă o activitate ALP ridicată, care se corelează cu niveluri ridicate de expresie enzimatică. [18] Am constatat că tratamentul cu extract de CD-ul pentru 72 h a crescut semnificativ osteoblaste ALP activitate (Figura 1b). Având în vedere rolul crucial al BMP-2, ALP, și OPN în diferențierea osteoblastelor, am testat dacă extractul de CD-uri își exercită efectul asupra diferențierii osteoblastelor prin reglarea BMP-2, ALP, și expresia OPN. Tratamentul celulelor cu extract de CD-uri a crescut expresia ARNm a ALP, BMP-2, și OPN într-o manieră dependentă de concentrație (Figura 1c), demonstrând că extractul de CD induse de diferențierea osteoblaste prin upregulating ALP, BMP-2, și expresia OPN.
Extractul de cistanche deserticola crește formarea nodulilor osoși prin calea proteinei kinazei activate de mitogen
S-a raportat că MAPK joacă un rol important în formarea oaselor[24,25] așa că am examinat în continuare dacă această cale de semnalizare este implicată în mineralizarea osoasă indusă de extract de CD. Pretratarea celulelor cu inhibitor ERK U0126, inhibitor al p38 SB203580 sau inhibitor JNK SP600125 redus CD extract-crescut mineralizare osoasă (Figurile 2a, 3a, și 4a). În plus, inhibitorii blocat, de asemenea, CD-ul induse de ALP, BMP-2, și expresia OPN (Figurile 2b-4c). Transfecția celulelor cu ERK2, p38 sau JNK mutant a redus creșterea extractului de CD în alp, BMP-2 și expresia ARNm OPN (figurile 2c, 3c și 4c). Apoi, am examinat direct activarea ERK, p38 și JNK după tratamentul cu extract de CD. Incubarea celulelor cu extract de CD induse de ERK, p38 și fosforilarea JNK (figurile 2d, 3d și 4d). Prin urmare, ERK, p38 și JNK mediază formarea osoasă crescută indusă de tratamentul cd al osteoblastelor.
Extractul de cistanche deserticola crește formarea nodulilor osoși prin calea factorului nuclear kB
După cum sa menționat anterior, activarea NF-kB este necesară pentru formarea oaselor. [26,27] Am tratat apoi osteoblastele cu inhibitorii NF-kB ditiocarbamat de pirrolidină (PDTC) și N-tosil-L-fenilalanină clormetil cetonă (TPCK) au fost achiziționate de la Calbiochem (Darmstadt, Germania) pentru a determina dacă activarea NF-kB este implicată în mineralizarea osoasă indusă de extract de CD. Figura 5a arată că pretratarea osteoblastelor cu PDTC sau TPCK a inhibat formarea nodulilor osoși induse de extractul de CD și, de asemenea, a redus creșterea expresiei ALP, BMP-2 și OPN (Figura 5b și 5c). Fosforilarea subunității NF-kB p65 este un indicator al activării NF-kB; [28] în concordanță cu acest lucru, am constatat că extractul de CD a crescut fosforilarea p65 în osteoblaste (Figura 5d). Aceste rezultate au indicat că activarea NF-kB este importantă pentru CD-ul induse de extract alp, BMP-2, și expresia OPN și formarea nodulilor osoși.
Inhibarea pierderii osoase de cistanche deserticola extract la șoareci ovariectomized
Pentru a examina efectul extractului de CD asupra pierderii osoase, osteoporoza a fost indusă la șoarecii de sex feminin prin ovariectomie. Așa cum era de așteptat, șoarecii ovariectomizați au prezentat o densitate minerală osoasă totală a corpului și conținut de minerale osoase (figurile 6a și 6b). Tratamentul cu extract de CD timp de patru săptămâni a inhibat pierderea densității minerale osoase și a conținutului de minerale osoase într-o manieră dependentă de doză (Figura 6a și 6b). Concentrațiile sanguine ale ALP pot reflecta activitatea osteoblastică. [29] După cum se arată în figura 6c, extract de CD-uri inhibat scăderea activității ALP serice induse de ovariectomie. În plus, extractul de CD a crescut, de asemenea, nivelul osteocalcinei, un marker al formării osoase, și a redus nivelul telopeptidelor C-terminale ale colagenului de tip I, un marker al resorbției osoase (Figura 6d și 6e). Aceste constatări susțin astfel potența și eficacitatea extractului de CD în prevenirea pierderii osoase in vivo.
Discuție
Cistanche deserticolaMa, o planta nativa din China, este utilizat pe scară largă în medicina tradițională pentru diverse tratamente terapeutice datorită activității sale sedative, analgezice, și imunostimulatoare. [11–15] Aici, am arătat că extractul de CD a indus mineralizarea oaselor în osteoblastele cultivate, dar nu a afectat migrarea sau proliferarea celulelor lor. În plus, am constatat că ALP, BMP-2 și OPN sunt proteine țintă ale semnalizării induse de extract de CD, care necesită activarea ERK, p38, JNK și NF-kB.
Osul este un țesut complex compus din mai multe tipuri de celule care trec continuu printr-un proces de reînnoire și reparare. [30] Când resorbția și formarea osului sunt dezechilibrate, defalcarea osoasă depășește formarea oaselor și rezultatele osteoporozei. [30] Am folosit șoareci ovariectomized pentru a examina efectul anti-osteoporotic de extract de CD-uri. Șoarecii ovariectomi au redus densitatea minerală osoasă totală a corpului și conținutul de minerale osoase, care a fost atenuat prin tratamentul cu extract de CD. Extract de CD-uri, de asemenea, a crescut nivelurile serice ale marker osteogen ALP și osteocalcină. Prin urmare, CD-ul este un agent de formare osoasă care previne pierderea osoasă cauzată de ovariectomie in vivo.
Deși mecanismele osteoporozei nu sunt pe deplin clare, acestea sunt probabil legate de scăderea disponibilității sau scăderea efectelor factorilor de creștere osoasă, cum ar fi ALP, BMP-2 și OPN. Acești trei factori joacă un rol important în procesul de formare și remodelare osoasă,[31] și a fost bine documentat faptul că stimularea diferențierii celulelor osteoblaste se caracterizează în principal prin exprimarea crescută a ALP, BMP-2 și OPN. [32] În acest studiu, am constatat că extractul de CD-uri a crescut ALP, BMP-2 și expresia OPN și mineralizarea osoasă îmbunătățită. Prin urmare, extract de CD mediază formarea oaselor în parte prin upregulating expresia ALP, BMP-2, și OPN.
S-a raportat că p38 este implicat în reglarea expresiei ALP în timpul diferențierii celulelor osteoblastice; [33] în mod similar, ERK1/2 este important pentru proliferarea și diferențierea osteoblastelor. [34,35] JNK este implicat în formarea osteoclastelor. [36] Am arătat aici că extractul de CD indus de ERK, p38 și fosforilarea JNK, iar inhibitorii acestor enzime au antagonizat potențarea mediată de extract de CD a mineralizării osoase, sugerând că activarea ERK, p38 și JNK joacă un rol obligatoriu în formarea osoasă indusă de extractul CD de către osteoblaste. în plus, inhibitorii enzimei și mutanții dominant-negativi ai ERK, p38 și JNK au redus ALP-ul îmbunătățit cu extract de CD, BMP-2 și expresia OPN. Aceste date sugerează că activarea căilor ERK, p38 și JNK este necesară pentru creșterea expresiei și maturizării ALP, BMP-2 și OPN cauzate de extractul de CD în osteoblaste. ERK a fost raportat pentru a crește proliferarea osteoblastelor și diferențierea. [34,35] Cu toate acestea, nu am detectat un efect al extractului de CD asupra proliferării osteoblastelor. Prin urmare, este posibil ca alte căi să fi contracarat efectul ERK după stimularea extractului de CD sau să fie necesare pentru proliferare. În acest sens, am constatat că inhibitorii PI3K și Akt reduc, de asemenea, mineralizarea osoasă indusă de extractul de CD și expresia ARNm ALP, BMP-2 sau OPN (date neprezentate). Prin urmare, aceste căi pot fi necesare pentru formarea osoasă indusă de extract de CD-uri.
NF-kB a fost demonstrat pentru a controla funcția osteoblastelor în os. [37] Rezultatele acestui studiu arată că activarea NF-kB contribuie la mineralizarea osoasă indusă de extract de CD și la expresia ALP, BMP-2 și OPN în osteoblastele cultivate și că inhibitorii căii de semnalizare dependente de NF-kB (PDTC și TPCK) au inhibat mineralizarea osoasă indusă de extractul de CD și expresia ALP, BMP-2 și OPN. p65 este fosforilat la Ser536 de o varietate de kinaze în mai multe căi de semnalizare, ceea ce sporește potențialul de transactivare p65. [38] Rezultatele acestui studiu au arătat că extractul de CD a crescut fosforilarea p65. Luate împreună, aceste rezultate sugerează că activarea NF-kB este necesară pentru formarea osoasă indusă de extract de CD-uri în osteoblaste cultivate. De asemenea, am constatat că inhibitorii ERK, p38 și JNK au inversat activitatea luciferazei NF-kB induse de extract de CD (date care nu au fost prezentate), în concordanță cu aceste enzime fiind mediatori în amonte ai activării NF-kB induse de extract cd. Prin urmare, extractul de CD induce formarea oaselor prin căile ERK/p38/JNK/ și NF-kB.
Concluziile
Acest studiu a demonstrat că extractul de CD induce diferențierea osteoblastelor și maturare, dar nu proliferarea sau migrarea. Extract de CD-uri, de asemenea, a crescut ALP, BMP-2 și OPN expresie și mineralizare osoasă. Am arătat că căile ERK, p38, JNK și NF-kB sunt implicate în formarea osoasă mediată de extract de CD-uri și expresia ALP, BMP-2 și OPN. În plus, extractul de CD a prevenit pierderea osoasă in vivo indusă de ovariectomie. Prin urmare, CD-ul poate fi benefic în stimularea formării osoase în tratamentul bolilor osteoporotice.
