Glicozidele de feniletanol din Herba Cistanche îmbunătățesc micromediul tumorii hipoxice și îmbunătățesc efectele oxaliplatinei prin calea de semnalizare HIF-1

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

LIMEI WEN, JUNPING HU, JIAWEI ZHANG și JIANHUA YANG

Abstract.

Cancerul hepatic este unul dintre cele mai frecvente tipuri de tumori maligne și se caracterizează prin malignitate ridicată, progresie rapidă, morbiditate ridicată și mortalitate. S-a raportat că oxaliplatina (OXA) are o eficiență marcată împotriva cancerului hepatic avansat cu toxicitate tolerabilă. În tumorile solide, micromediul hipoxic promovează tranziția epitelial-mezenchimală (EMT), care poate induce, de asemenea, rezistența la medicamente a cancerului hepatic la medicamentele cu platină. HerbaCistanche (Cistanche tubulosa) a fost folosit frecvent în medicina tradițională chineză și glicozidele feniletanoide de la HerbaCistanche(CPhG) sunt componentele active majore. Prezentul studiu și-a propus să investigheze efectele CPhG asupra viabilității, apoptozei, migrației și invaziei celulelor canceroase hepatice. Celulele de cancer hepatic HepG2 au fost împărțite în grupele martor, DMSO, CoCl2, OXA, OXA plus CoCl2 și CPhG plus OXA plus CoCl2. Ulterior, au fost efectuate PCR cantitativ cu transcripție inversă și analiză Western blot pentru a determina nivelurile de expresie ale factorului 1 inductibil de hipoxie (HIF-1), 2 asemănător lizil oxidazei (LOXL2) și genele și proteinele legate de EMT (adică E. ‑cadherină și Twist), pentru a investiga efectele CPhG asupra cancerului hepatic. Rezultatele au demonstrat că CPhG ar putea spori efectele OXA asupra cancerului hepatic și ar putea inhiba migrarea, invazia și rata apoptotică a celulelor canceroase hepatice. În plus, tratamentul cu CPhG a indus în mod eficient reglarea în jos a HIF-1, LOXL2 și Twist și reglarea în sus a E-cadherinei. Rezultatele prezente au indicat că CPhG au declanșat o creștere semnificativă a sensibilității la OXA și suprimarea EMT indusă de hipoxie în ficat.

beneficiu cistanche: anti-Cancer de ficat

Introducere

Liver cancer is a malignant tumor that usually involves the digestive system, and consists of primary and secondary types. Primary liver cancer is divided into hepatocellular carcinoma and intrahepatic cholangiocarcinoma (1,2). Notably, liver cancer is associated with a high incidence and mortality rate worldwide (3). According to the World Health Organization, it is predicted that there will be >1,000,000 decese cauzate de cancer la ficat până în 2030, iar dintre cazurile nou confirmate, cele din China continentală vor reprezenta 46,6% .

S-a raportat că oxaliplatina (OXA) exercită efecte inhibitoare asupra creșterii cancerului hepatic cu toxicitate tolerabilă în medii clinice. Cu toate acestea, eficiența generală a terapiei medicamentoase pe bază de platină este împiedicată de rezistența celulelor tumorale (4). Este bine cunoscut faptul că cancerul de ficat prezintă o sensibilitate mai mică la chimioterapie în comparație cu alte tipuri de cancer. Rezistența la mai multe medicamente a cancerului hepatic a contribuit la rezistența acestuia la numeroși agenți terapeutici (5). Într-un studiu anterior, Xie și Zhong (6) au raportat că celulele HepG2 au prezentat o sensibilitate scăzută la adriamicină, 5-fluorouracil și cisplatină în condiții hipoxice. În ciuda faptului că agenții de chimioterapie pe bază de platină sunt opțiunile majore de tratament pentru cancer, rezistența la aceste medicamente există în rândul pacienților. În plus, prognosticul pacienților cu cancer hepatic rămâne prost (7,8). Până în prezent, s-au făcut eforturi extinse pentru a investiga rezistența la medicamente și pentru a îmbunătăți sensibilitatea la medicamente la pacienții cu cancer hepatic.

În condiții hipoxice, revascularizarea are loc în celulele canceroase, ceea ce poate duce la tranziție epitelial-mezenchimală (EMT) și mimetism vascular (VM). EMT și VM pot promova ulterior invazia și metastaza la distanță. Mai mult, s-a speculat că EMT joacă un rol ca forță motrice pentru progresia cancerului (9). În plus, factorii inductibili de hipoxie (HIF) sunt implicați în formarea nevaselor, metabolismul energetic, proliferarea celulară, invazia și metastaza (10).

Proteina asemănătoare lizil oxidazei (LOX) 2 (LOXL2) este un membru al familiei LOX și este strâns legată de legarea covalentă a colagenului și elastinei, care poate duce la fibroză și este crucială pentru integritatea matricei extracelulare ( 11). Într-un studiu anterior, LOXL2 a fost considerat a fi strâns legat de metastaza celulelor canceroase (12). Mai mult, s-a demonstrat că LOXL2 modulează patogeneza și progresia numeroaselor tipuri de cancer malign prin căi extra- și intracelulare, care au fost indici importanți pentru evaluarea prognosticului nefavorabil (13,14).Herba Cistancheeste o plantă tonică distribuită în mod obișnuit în regiunile deșertice, care a fost folosită frecvent în medicina tradițională chineză (15,16).Cistanche tubulosa(C. tubulosa)este un medicament natural pe bază de plante plantat în mod obișnuit în Regiunea Autonomă Xinjiang. Glicozidele feniletanoide din Herba Cistanche (CPhGs) servesc ca una dintre componentele active majore ale Herba Cistanche. Anterior, Hu și colab. (17) au indicat că CPhG-urile ar putea atenua leziunile hepatice la șoarecii purtători de tumori H22 și pot inhiba creșterea celulelor canceroase. S-a sugerat că mecanismul de bază poate fi legat de o reducere a fetoproteinei serice și ar putea crește imunitatea la șoareci.

În studiul de față, a fost indus un model hipoxic al celulelor canceroase hepatice HepG2 utilizând CoCl2. Pe această bază, prezentul studiu și-a propus să investigheze efectele OXA asupra proliferării, apoptozei, migrării și invaziei celulelor canceroase în prezența CPhG în condiții hipoxice. În plus, au fost detectate nivelurile de expresie a mARN și proteinelor HIF-1, LOXL2, E-cadherin și Twist. Mai mult, au fost investigate mecanismele exacte care stau la baza efectelor CPhG asupra patogenezei cancerului hepatic.

beneficiul extractului de cistanche: tratarea cancerului de ficat

Materiale și metode

Linie celulara. Linia de celule de cancer hepatic HepG2, identificată prin metoda STR, a fost furnizată de Instituția de Cercetare Clinică, Primul Spital Afiliat al Universității Medicale Xinjiang (Urumqi, China). Celulele au fost cultivate în DMEM cu conținut ridicat de glucoză (HyClone; Cytiva) care conține 10% ser fetal bovin (FBS; Hyclone; Cytiva) la 37 °C într-un incubator care conține 5% CO2.

Preparation of CPhGs. C. tubulosa extraction (CPhGs) was obtained from Hetian Dichen Biotech Co., Ltd.. The content of CPhGs was >80 la sută, printre care conținutul de echinacozidă și verbascoză a fost de 44,5 și, respectiv, 16,1 la sută. Tulpinile de C. tubulosa (Schrenk) Wight au fost colectate în octombrie 2016 din Xinjiang, China. Planta a fost identificată de Dr. Junping Hu. Toate aceste exemplare de voucher (nr. 201610) au fost depuse la Plant Herbarium, School of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Xinjiang, China.

Design experimental. Celulele HepG2 (5x104/ml) au fost tratate cu diferite concentrații de CPhG (5, 25, 50, 100, 200 și 500 µg/ml) timp de 48 ore la 37˚C (24 ore după însămânțare) la screeningul dozei CPhGs-L/M/H. Celulele HepG2 (5x104/ml) au fost împărțite în următoarele grupuri: i) Grup martor, cultivat în DMEM cu conținut ridicat de glucoză; ii) grupă DMSO, cultivată în 0,1 procente DMSO (v/v); iii) grupa CoCl2 (grup model hipoxie), cultivată în DMEM fără ser care conține 100 uM CoCl2; iv) OXA

grup (grup de control pozitiv), cultivat în 5 uM OXA (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.); v) grupare OXA plus CoCI2, cultivată în 5 pM OXA combinat cu 100 pM CoCl2; și vi) grupări CPhGs, tratate cu CPhGs-L/M/H (25, 50 și respectiv 100 ug/ml) combinate cu 5 uM OXA și 100 uM CoCl2.

Test de viabilitate celulară. Viabilitatea celulară a fost determinată utilizând un test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) conform instrucțiunilor producătorului (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) și așa cum a fost descris anterior (18). Celulele (2.0x103 celule/godeu) au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri. Ulterior, ~ 24 de ore după însămânțare, celulele au fost tratate timp de 48 de ore conform condițiilor de tratament din fiecare grup. Mediul a fost apoi înlocuit cu 100 ui DMEM cu conținut ridicat de glucoză, urmat de adăugarea a 10 ui reactiv CCK-8; celulele au fost incubate timp de 1 oră la 37°C. Densitatea optică a fost măsurată folosind un cititor de microplăci cu detectie multiplă (Thermo Fisher Scientific, Inc.) la 450 nm. Pentru fiecare condiție au fost pregătite șase replici.

Determinarea vitezei apoptotice. Rata apoptotică a fost determinată utilizând un kit de detectare a apoptoticului Annexin V/PI (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.). Celulele HepG2 (5x105) au fost inoculate în plăci cu 6 godeuri la 37˚C în 5% CO2. Ulterior, ~24 ore după tratament, celulele au fost cultivate în DMEM fără ser timp de 4 ore. Celulele au fost apoi digerate folosind 0,25% tripsinizat (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), urmată de cel puțin trei spălări cu PBS pre-răcit. După centrifugare la 167,7 xg timp de 5 minute la 4°C, celulele au fost resuspendate cu tampon de legare 1X și concentrația a fost ajustată la 1~5x106/ml, apoi colorate cu 5 ui de anexină V-FITC și 5 ui de PI timp de 15 minute. la temperatura camerei. Celulele au fost apoi supuse citometriei în flux folosind un citometru în flux BD LSRFortessa (BD Biosciences) și FlowJo

Software 10.6.2 (Tree Star, Inc.).

Test de vindecare a rănilor. Efectele inhibitoare ale CPhG asupra migrației celulelor au fost examinate prin testul de vindecare a rănilor (19). Celulele au fost însămânțate în plăci cu 6 godeuri până când s-a obținut un monostrat confluent de 100 procente. Ulterior, celulele au fost rănite folosind un vârf de pipetă de 200 µl, spălate cu PBS și incubate cu tratamente într-un mediu fără ser. După tratamentul medicamentos, viteza de vindecare a rănilor a fost măsurată la 0, 12, 24 și, respectiv, 48 de ore. Imaginile rănilor au fost obținute folosind un microscop fluorescent (Nikon Ti-S, Japonia) sub o mărire de x10. Închiderea plăgii a fost măsurată prin distanța plăgii în fiecare perioadă și exprimată ca procent din distanța inițială a plăgii la 0 h.

Testele Transwell. Invazia celulară a fost evaluată prin teste Transwell. Celulele (1x105 celule/ml) au fost suspendate în 200 µl DMEM cu conținut ridicat de glucoză fără FBS. Celulele au fost apoi însămânțate pe godeuri superioare acoperite cu Matrigel acoperite cu o membrană de filtru de polietilen tereftalat (dimensiunea porilor, 8,0 µm). Un total de 500 µl DMEM cu conținut ridicat de glucoză care conține 10% FBS a fost plasat în camera inferioară. Tampoane de bumbac au fost folosite pentru a îndepărta celulele de pe suprafața superioară a filtrului după 48 de ore la 37˚C. Celulele care au invadat prin membrană au fost fixate cu 4% paraformaldehidă timp de 30 de minute. Ulterior, celulele au fost colorate cu 0,1 procente de violet cristal timp de 15 minute la temperatura camerei. Celulele invadatoare au fost observate la un microscop fluorescent (Nikon Ti-S) la o mărire de x100.

PCR cantitativ cu transcripție inversă (RT-qPCR). ARN-ul total a fost extras din celulele HepG2 folosind reactiv TRIzol® (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) și sinteza cADN-ului a fost efectuată utilizând kitul de reactivi PrimeScript RT (Takara Bio, Inc.) conform protocolului producătorului. qPCR a fost efectuată pe un sistem PCR în timp real 7500 (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) utilizând TB green™ Premix Ex Taq™ (Takara Bio, Inc.) conform protocolului producătorului. Primerii utilizați pentru qPCR sunt enumerați în Tabelul I. Condițiile PCR au constat în denaturare la 95°C timp de 30 sec, urmată de 40 de cicluri de denaturare la 95°C timp de 5 secunde și recoacere la 60°C timp de 30 sec. În cele din urmă, rezultatele amplificării au fost analizate folosind metoda 2-ΔΔCq (20).

Analiza Western blot. Proteinele au fost extrase din celulele tratate timp de 48 de ore prin omogenizare în tampon de liză RIPA (Thermo Fisher Scientific, Inc.) care conține inhibitori de protează și fosfatază. Conținutul de proteine ​​celulare a fost determinat folosind metoda BCA. Proteinele (40 µg) au fost apoi separate prin SDS-PAGE pe un gel de 10% și transferate pe o membrană PVDF. Membrana a fost blocată în lapte fără grăsimi 5% timp de 1 oră la 4°C și incubată cu următorii anticorpi primari: -actină (1:5,000; nr. cat. bs-0061R; BIOSS), HIF ‑1 (1:1,000; nr. cat. ab179483; Abcam), LOXL2 (1:500; nr. cat. ab179810; Abcam), E-cadherin (1:1,000 ; cat. nr. bs‑10009R; BIOSS) și Twist1 (1:500; cat. nr. bs‑2441R; BIOSS) peste noapte la 4˚C. Membrana a fost apoi incubată cu anticorpi secundari IgG H&L de capră anti-iepure (1:2.000; nr. cat. ab205718; Abcam) timp de 4 ore la temperatura camerei. După spălare cu TBS-0,05 procente Tween-20, petele au fost vizualizate folosind sistemul de chimioluminiscență îmbunătățită (Amersham; Cytiva). Intensitatea relativă a benzilor a fost semi-cuantificată prin analiza densitometrică folosind software-ul ImageJ2x (versiunea 2.1.4.7; Rawak Software Inc.), iar graficele densitometrice ale rezultatelor au fost normalizate la intensitatea -actinei.

Analize statistice. Software-ul SPSS 19.0 (SPSS, Inc.) a fost utilizat pentru analiza datelor. Datele sunt prezentate ca medie ± abatere standard și au fost analizate prin ANOVA unidirecțională urmată de testul post-hoc al lui Tukey. P<0.05 was="">considerată a indica o diferență semnificativă statistic. Toate experimentele au fost efectuate cel puțin în trei exemplare.

Rezultate

Efectele CPhG asupra viabilității celulare. Celulele HepG2 au fost tratate cu diferite concentrații de CPhG (5, 25, 50, 100, 200 și 500 pg/ml) timp de 48 ore (24 ore după însămânțare). După cum se arată în Fig. 1, a existat o scădere semnificativă a viabilității celulelor tratate cu 200 și 500 µg/ml CPhG în comparație cu cea a grupului de control (P<0.05). these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" could="" modulate="" cell="" viability="" in="" a="" dose‑dependent="">

CPhG-urile sporesc efectele OXA asupra cancerului hepatic. Efectele CPhG asupra viabilității celulelor HepG2 modulate cu OXA au fost ulterior evaluate (Fig. 2). După ~48 ore, combinația de CPhG și OXA a scăzut semnificativ viabilitatea celulelor HepG2 în comparație cu cea din OXA plusgrupa CoCl2. Mai exact, CPhGs-M plus OXA plus CoCl2 și CPhGs-H plus OXA plus CoCl2 au inhibat semnificativ viabilitatea celulelor HepG2 în comparație cu grupul OXA plus CoCl2 (P<0.05 and=""><0.01,>

CPhG inhibă migrarea și invazia celulelor canceroase hepatice. Pentru a studia în continuare potențialul invaziv și capacitatea de migrare a celulelor canceroase hepatice în urma tratamentului cu CPhG și OXA, au fost efectuate teste de vindecare a rănilor și Transwell. Testul de vindecare a rănilor a indicat că, în comparație cu cel din grupul DMSO, migrarea celulelor HepG2 a fost redusă în urma tratamentului cu CoCl2, OXA și CPhG (200 sau 500 µg/ml) (P<0.05; fig.="" 3a="" and="" b).="" for="" the="" transwell="" assay,="" the="" invasive="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="" inhibited="" in="" the="" co-treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2)="" compared="" with="" that="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 3c="" and="" d).="" conversely,="" in="" the="" co‑treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2),="" the="" invasive="" potential="" and="" migratory="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="">

Efectele CPhG și OXA asupra apoptozei. În urma tratamentului cu combinația de CPhG și OXA pentru

48 de ore, celulele HepG2 au fost colorate cu anexină V-FITC și PI, urmate de citometrie în flux pentru a determina apoptoza celulară. După cum se arată în Fig. 4A, grupurile de co-tratament (CPhGs-L/M/H plus OXA plus CoCl2) au prezentat o creștere treptată a proporției de celule apoptotice odată cu creșterea concentrației de CPhG. Majoritatea celulelor tratate cu CPhG și OXA au fost localizate în regiunea Q4, ceea ce a indicat că combinația de CPhG și OXA a indus apoptoza în stadiul incipient. În comparație cu grupul OXA plus CoCl2, a fost detectată o creștere semnificativă a ratei apoptotice a celulelor în grupurile tratate cu OXA, CoCl2 și doze moderate sau mari de CPhG (P<0.01; fig.="" 4b).="" these="" findings="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" oxa="" and="" cphgs="" may="" contribute="" to="" the="" apoptosis="" of="" hepg2="">

mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist following CPhGs and OXA co‑incubation. There were no statistical differences in the mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist between the control and DMSO groups (P>0.05; Fig. 5A-D). În schimb, CoCl2 a indus o creștere semnificativă a nivelurilor de expresie ARNm ale LOXL2, HIF-1 și Twist în comparație cu cele din DMSOgrup (P<0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group,="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" loxl2,="" hif‑1α="" and="" twist="" were="" significantly="" enhanced="" in="" the="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups=""><0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" by="" contrast,="" cocl2="" induced="" a="" significant="" downregulation="" in="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" dmso="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" all="" concentrations="" of="" cphgs="" combined="" with="" oxa="" and="" cocl2="" were="" able="" to="" upregulate="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" these="" results="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" cphgs="" and="" oxa="" effectively="" inhibited="" the="" emt="" under="" hypoxic="">

Nivelurile de expresie a proteinelor HIF-1, LOXL2, E-cadherină și Twist după co-incubarea CPhG și OXA. Rezultatele Western blotting au dezvăluit că nivelurile de expresie a proteinei ale HIF-1, LOXL2 și Twist au fost reglate în creștere în condiții hipoxice în comparație cu cele din grupul DMSO. În contrast,

nivelurile de expresie a proteinelor E-cadherinei au fost reglate în jos în condiții hipoxice (P<0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" notably,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" cphgs‑m="" +="" oxa="" +="" cocl2="" or="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" compared="" with="" dmso="" group,="" cocl2="" treatment="" significantly="" decreased="" the="" expression="" level="" of="" e‑cadherin.="" in="" the="" cphgs="" groups,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6b).="" these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" treatment="" could="" effectively="" inhibit="" the="" downregulation="" of="" e‑cadherin,="" and="" the="" upregulation="" of="" hif‑1α,="" loxl2="" and="" twist="" induced="" by="">

Discuţie

Hipoxia este o caracteristică comună în micromediul cancerului; aceasta este asociată în principal cu faptul că proliferareacelulele canceroase este mai rapidă în comparație cu formarea vasculară a nevaselor aberante. În plus, alte procese biologice, inclusiv proliferarea, metastazele și sensibilitatea la medicamente sunt afectate de hipoxie (21). Micromediul hipoxic tumoral este crucial pentru patogeneza și progresia cancerului și este, de asemenea, important în rezistența la medicamente și vascularizarea cancerului hepatic (22).

În studiul de față, celulele HepG2 au fost tratate cu diferite concentrații de CPhG, printre care CPhG (200 pg/ml) ar putea induce semnificativ o scădere a viabilității celulelor. În special, CPhG-urile ar putea modula viabilitatea celulară într-o manieră dependentă de doză. În condiții hipoxice, combinația de OXA și CPhG (50 sau 100 pg/ml) a inhibat semnificativ viabilitatea celulelor HepG2 în comparație cu tratamentul cu OXA singur. O tendință similară dependentă de doză a fost observată în testele de migrare și invazie a celulelor canceroase hepatice. În prezent, au fost efectuate studii ample pentru a investiga rolurile apoptozei celulelor canceroase în patogenia bolii hepatice (23-26). Au fost dezvoltate mai multe strategii pentru tratarea cancerului hepatic prin promovarea apoptozei (27-29); prin urmare, interferența în

Apoptoza celulelor HepG2 poate servi ca un candidat promițător pentru prevenirea și tratamentul cancerului hepatic. Apoptoza celulelor HepG2 a fost îmbunătățită semnificativ în urma tratamentului cu combinația de CPhGs-M/-H și OXA în comparație cu cea din celulele tratate numai cu OXA. Prin urmare, sa indicat că CPhG-urile ar putea îmbunătăți în mod semnificativ efectele antitumorale ale OXA.

HIF-1 poate regla în creștere nivelurile de expresie ale E-cadherinei, N-caderinei și Vimentinului, precum și ale unor factori de transcripție, cum ar fi Snail1/2, Zeb1 și Twist1. Ulterior, acest lucru ar putea duce la o pierdere a polarității celulare, slăbirea joncțiunilor celulă-celulă, modificări ale proteinei citoscheletice și migrarea și invazia celulelor canceroase, ceea ce ar putea duce la translocarea celulelor canceroase în sistemul circulator prin membrana bazilară. și metastaze ulterioare (30). În studiul de față, CoCl2 a fost folosit pentru a induce un model de hipoxie, care a declanșat o creștere a viabilității celulelor HepG2, precum și migrarea și invazia celulelor. În plus, nivelurile de expresie a mRNA și proteinelor HIF-1 au fost semnificativ crescute, indicând faptul că CoCl2 a indus generarea unui

micromediu hipoxic. Tratamentul cu combinația de CPhG și OXA a inhibat semnificativ ARNm și nivelurile de exprimare a proteinei HIF-1 induse de hipoxie. Aceste descoperiri au sugerat că CPhG-urile ar putea atenua micromediul cancerului hepatic într-o manieră dependentă de doză.

E-cadherina este o moleculă de adeziune dependentă de Ca2 plus, care are un rol cheie în adeziunea celulă-celulă, menținerea integrității structurii țesuturilor și transmiterea semnalizării. În cazurile de reglare în jos sau chiar pierderea funcției de adeziune, celulele canceroase pot prezenta proliferare și dediferențiere necontrolată, ceea ce poate promova invazia crescută a celulelor canceroase și metastazele ulterioare (31). În plus, E-cadherina este crucială pentru inhibarea EMT a celulelor canceroase, care este strâns asociată cu diferențierea, invazia, metastaza și prognosticul malignităților epiteliale multiple. Factorii de transcripție care induc EMT (EMT-TF), cum ar fi Twist, Snail și Zeb, sunt cruciali pentru EMT. S-a raportat că hipoxia activează căile de semnalizare care induc expresia EMT-TF; în special, ar putea promova direct EMT prin activarea transcripțională a acestor factori (32). Răsucirea este un helix-inel-helix foarte conservat

factor de transcripție care a fost nou identificat în ultimii ani. Expresia High Twist a fost detectată în numeroase tipuri de celule canceroase (33). Prin urmare, este esențial să se investigheze asocierea dintre expresia Twist și migrarea sau metastaza celulelor canceroase, precum și prevenirea clinică și tratamentul metastazelor (34). În studiul de față, s-a dezvăluit că nivelurile de exprimare a mARN și proteine ​​ale E-cadherinei au fost reglate în jos în prezența hipoxiei, în timp ce nivelurile de expresie a mRNA și a proteinei ale Twist au fost crescute. Aceste constatări au fost în concordanță cu rezultatele testelor de invazie și migrare, ceea ce a implicat că hipoxia poate contribui la apariția EMT. În urma tratamentului cu OXA, nivelurile de exprimare a proteinei ale E-caderinei au fost reglate în jos; acest lucru a indicat că OXA a prezentat o eficiență slabă în inhibarea creșterii celulelor canceroase hepatice, în timp ce ar putea promova EMT. Cu toate acestea, în combinație cu CPhG, sensibilitatea celulelor HepG2 la OXA a prezentat o îmbunătățire marcată în prezența hipoxiei. În plus, cotratamentul cu CPhG și OXA ar putea inhiba viabilitatea celulară, migrarea și invazia celulelor HepG2. Studiul de față a detectat doar

Expresia Twist și E-cadherin; prin urmare, studiile viitoare își propun să se concentreze pe mai mulți markeri legați de EMT, pentru a evalua efectul inhibitor al CPhG asupra EMT indusă de hipoxie în cancerul hepatic.

S-a raportat că HIF-1 promovează expresia LOXL2 și sporește migrarea și invazia celulelor canceroase hepatice, care pot fi strâns legate de prognosticul nefavorabil al cancerului hepatic (30). Într-un studiu anterior, nivelurile de expresie ale LOXL2 în țesuturile adiacente ale cancerului hepatic au fost semnificativ crescute în comparație cu cele din țesuturile canceroase (35). În plus, a fost strâns legată de invazia și metastaza cancerului hepatic. Reducerea genei LOXL2 de către ARN mic de interferență a inhibat proliferarea celulelor HepG2 și SMCC-7721, ceea ce a dus la oprirea ciclului celular al celulelor canceroase și creșterea apoptozei (36). Shao și colab. (35) au investigat corelația dintre LOXL2 în probele de cancer hepatic și factorii clinicopatologici, VM și prognosticul dintre 201 cazuri care au fost operate pentru tratament. S-a emis ipoteza că LOXL2 a jucat roluri importante în patogeneza și progresia cancerului hepatic, care poate servi ca țintă pentru dezvoltarea medicamentelor. În plus, Peng și colab. (37) au demonstrat că LOXL2 ar putea activa căile de semnalizare Snail/E-cadherin și Src kinazei/focal adeziune kinazei, care pot contribui la patogeneza și progresia EMT a celulelor canceroase gastrice. În studiul de față, în condiții hipoxice, nivelurile de exprimare a ARNm și a proteinei ale LOXL2 au fost crescute, în timp ce expresia sa a fost reglată în jos în urma tratamentului cu OXA. În plus, tratamentul cu o combinație de CPhG și OXA a dus la o reglare în jos evidentă a expresiei LOXL2, care poate ajuta în mod eficient efectele antitumorale ale OXA asupra cancerului hepatic.

Există unele limitări ale studiului de față. Prezentul studiu ar fi trebuit să folosească încă două linii celulare de cancer hepatic, inclusiv linia celulară SMCC-7721, dar acestea nu au putut fi utilizate, deoarece nu a fost posibilă achiziționarea acestor linii celulare deoarece au fost identificate greșit și au fost derivate din celule HeLa. În plus, studiul de față nu a analizat efectele antioxidante ale diferitelor concentrații de CPhG în celule.

În concluzie, CPhG-urile ar putea alterna micromediul tumoral hipoxic al celulelor canceroase hepatice prin modularea căii de semnalizare HIF-1. În plus, sensibilitatea celulelor canceroase hepatice la OXA a fost semnificativ crescută ca răspuns la tratamentul cu o combinație de CPhG și OXA. Aceste descoperiri pot oferi o strategie nouă de tratament pentru a îmbunătăți sensibilitatea cancerului hepatic la chimioterapie.

Mulțumiri

Nu se aplică.

Finanțarea

Prezentul studiu a fost susținut de Xinjiang Cheie Laboratorului de Componente active a medicamentelor naturale și tehnologie de eliberare a medicamentelor (grant nr. XJDX1713), Proiectul Candidat Rezervă pentru liderul inovației științifice și tehnologice din regiunea autonomă Xinjiang Uygur (grant nr. 2019XS14), Fundația Națională de Științe Naturale din China (grant nr. 81860735) și Bethune Charitable

Fundația „Bethune·Quest-constructia capacității de cercetare științifică farmaceutică” (grant nr. B-19-H-20200622).

Disponibilitatea datelor și materialelor

Seturile de date utilizate și/sau analizate în timpul studiului curent sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere rezonabilă.

Contribuții ale autorilor

LMW și JWZ au efectuat experimentele, au redactat manuscrisul și au confirmat autenticitatea tuturor datelor brute. JPH și JHY au conceput prezentul studiu. Toți autorii au citit și au aprobat manuscrisul final.

Aprobarea etică și acordul de participare

Nu se aplică.

Consimțământul pacientului pentru publicare

Nu se aplică.

Interese concurente

Autorii declară că nu au interese concurente.

Referințe

1. Carcinom hepatocelular. Nat Rev Dis Primers 2: 16019, 2016.

2. Gingold JA, Zhu D, Lee DF, Kaseb A și Chen J: Profilul genomic și homeostazia metabolică în cancerele hepatice primare. Trends Mol Med 24: 395‑411, 2018.

3. McGuire S: World cancer report 2014. Geneva, Elveția: World Health Organization, the international agency for research on cancer, WHO press, 2015. Adv Nutr 7: 418‑419, 2016.

4. Gholamreza K, Jadidi-Niaragh F, Jahromi AS, Zandi K și Hojjat-Farsangi M: Mecanisme de rezistență a celulelor tumorale la agenții actuali de terapie țintită. Tumor Biol 37: 10021-10039, 2016.

5. Dong X și Mumper RJ: Strategii nanomedicale pentru tratarea tumorilor multirezistente: progresul actual. Nanomedicine (Londra) 5: 597‑615, 2010.

6. Xie Y și Zhong DW: AEG-1 este asociat cu chimiorezistența carcinomului hepatocelular indus de hipoxie prin reglarea căii PI3K/AKT/HIF-1alpha/MDR-1. EXCL J 15: 745‑757, 2016.

7. Xiong H, Ni Z, He J, Jiang S, Li X, He J, Gong W, Zheng L, Chen S, Li B și colab.: LncRNA HULC declanșează autofagia prin stabilizarea Sirt1 și atenuează chemosensibilitatea celulelor HCC. Oncogene 36: 3528‑3540, 2017.

8. Gade TPF, Tucker E, Nakazawa MS, Hunt SJ, Wong W, Krock B, Weber CN, Nadolski GJ, Clark TWI, Soulen MC și colab: Ischemia induces quiescence and autophagy dependence in hepatocellular carcinom. Radiologie 283: 702‑710, 2017.

9. Siegel RL, Miller KD și Jemal A: Cancer statistics, 2017. CA Cancer J Clin 67: 7-30, 2017.

10. Dong LQ, Shen BQ și Ma Y: Progresul cercetării micromediului hipoxiei în carcinomul hepatocelular. Zhong Guo Pu Wai Ji Chu Yu Lin Chuang Za Zhi 25: 1254‑1258, 2018 (în chineză).

11. Moon HJ, Finney J, Ronnebaum T și Mure M: Human lysyl oxidase-like 2. Bioorg Chem 57: 231-241, 2014.

12. Ferreira S, Saraiva N, Rijo P și Fernandes AS: inhibitori LOXL2 și progresia cancerului de sân. Antioxidanți (Basel) 10: 312, 2021.

13. Philp CJ, Siebeke I, Clements D, Miller S, Habgood A, John AE, Navaratnam V, Hubbard RB, Jenkins G și Johnson SR: Reticularea matricei extracelulare îmbunătățește creșterea fibroblastelor și protejează împotriva proteolizei matricei în fibroza pulmonară. Am J Respir Cell Mol Biol 58: 594-603, 2018.

14. Galván JA, Zlobec I, Wartenberg M, Lugli A, Gloor B, Perren A și Karamitopoulou E: Exprimarea represorilor E-cadherinei SNAIL, ZEB1 și ZEB2 de către celulele tumorale și stromale influențează fenotipul tumorii și sugerează eterogenitatea stromalei celule în cancerul pancreatic. Br J Cancer 112: 1944-1950, 2015.

15. Gu C, Yang X și Huang L: Cistanches herba: A neuropharmacology review. Front Pharmacol 7: 289, 2016.

16. Fu Z, Fan X, Wang X și Gao X: Cistanches Herba: O privire de ansamblu asupra proprietăților sale chimice, farmacocinetice și farmacocinetice. J Ethnopharmacol 219: 233‑247, 2018.

17. Hu Q, You SP, Liu T, Wang B, Liu X și Jiang Y: O investigație privind efectul anti-cancer hepatic al cistanchei. Carcinog Teratog Mutagen 30: 194-199, 2018.

18. Mao J, Tian Y, Wang C, Jiang K, Li R, Yao Y, Zhang R, Sun D, ​​Liang R, Gao Z și colab.: CBX2 reglează proliferarea și apoptoza prin fosforilarea YAP în carcinomul hepatocelular. J Cancer 10: 2706-2719, 2019.

19. Qin Y, Liu HJ, Li M, Zhai DH, Tang YH, Yang L, Qiao KL, Yang JH, Zhong WL, Zhang Q și colab.: Salidrozida îmbunătățește micromediul tumorii hipoxice și inversează rezistența la medicamente a medicamentelor cu platină prin Calea de semnalizare HIF-1. EBioMedicine 38: 25-36, 2018.

20. Livak KJ și Schmittgen TD: Analiza datelor despre expresia genelor relative utilizând PCR cantitativă în timp real și metoda 2(-Delta Delta C(T)). Metode 25: 402-408, 2001.

21. Vaupel P: Fiziologia micromediului tumoral și implicațiile sale pentru oncologia radiațiilor. Semin Radiat Oncol 14: 198‑206, 2004.

22. Chen C și Lou T: Factori inducibili de hipoxie în carcinomul hepatocelular. Oncotarget 8: 46691‑46703, 2017.

23. Schwabe RF și Luedde T: Apoptoza și necroptoza în ficat: O chestiune de viață și de moarte. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 15: 738‑752, 2018.

24. Kanda T, Matsuoka S, Yamazaki M, Shibata T, Nirei K, Takahashi H, Kaneko T, Fujisawa M, Higuchi T, Nakamura H și colab.: Apoptosis and non-alcoholic fatty hever diseases. World J Gastroenterol 24: 2661-2672, 2018.

25. Pittala S, Kremlin Y și Shoshan-Barmatz V: țintirea cancerului hepatic și a patologiilor asociate la șoareci cu o peptidă mitocondrială pe bază de VDAC1. Neoplazia 20: 594‑609, 2018.

26. Jing ZT, Liu W, Xue CR, Wu SX, Chen WN, Lin XJ și Lin X: activatorul AKT SC79 protejează hepatocitele de apoptoza mediată de TNF și ameliorează leziunile hepatice induse de d-Gal/LPS. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 316: G387-G396, 2019.