Antrenamentul fizic inhibă formarea fibrozei în rinichiul bolii Alzheimer, influențând căile de semnalizare TGFB

edmund.chen@wecistanche.com

INTRODUCERE 

Boala Alzheimer (AD) este cea mai frecventă formă de demență, dar aspectul ei sistemic a început să fie discutat abia în ultimele decenii. Deși s-au făcut eforturi mari pentru a dezvolta medicamente și terapii de modificare a bolii, nu există proceduri curative disponibile până în prezent [1-3]. Formarea plăcilor de amiloid și funcția anormală a precursorilor amiloid-proteinei (APP) sunt considerate ca primele semne ale bolii nu numai în sistemul nervos central (SNC), ci și la periferie [4]. Dovezi convingătoare susțin rolul esențial al amiloidului-B (AB) în patogeneza AD [5] subliniind că clearance-ul scăzut al AB este unul dintre procesele cheie în patomecanismul. În AD sunt implicate mai multe organe periferice, cum ar fi testiculul [5], pancreasul [6] șirinichi[7], evidențiind dezvoltarea unei boli sistemice complexe cu ținte multiple [8]. S-a dovedit cărinichieste implicat în eliminarea AB [9]. Mai mult, concentrația serică a AB este semnificativ crescută în croniciboală de rinichi pacienți (CKD) [10, 11]. Acumularea AB a fost demonstrată și înrinichi[12], ducând la o tulburare de filtrare. Filtrarea adecvată este parțial reglată de factorul de creștere transformator B (TGFB), care este o citokină principală în patogenezarenalinflamație și fibroză [13] și este, de asemenea, cunoscut ca un factor important în patogeneza AD [14]. În AD, semnalizarea TGFB joacă un rol în activarea microglială și neuroprotecția mediată de astrocite [15]. În plus, expresia alterată a TGFB afectează, de asemenea, inflamația în SNC și țesuturile periferice [13, 16].

CISTANCHE VA AMUNĂȚI BOLILE RENALILOR/RENALILOR

TGFB are trei izoforme: TGFB1, TGFB2 și TGFB3 [17]. TGFB1 participă la mai multe procese, cum ar fi dezvoltarea fetală, controlul creșterii și diferențierii celulelor, fibroza și formarea țesutului cicatricial, creșterea tumorii și răspunsul imun [18]. Este o citokină importantă în formarea fibrozei în diferite organe precum ficatul șirinichi[19]. TGFB1 formează dimeri, care se leagă mai întâi la receptorul TGFB tip II (TGFRII), apoi activează receptorul TGFB tip I (TGFRI) Ser/Thr kinaza, inițiind formarea complexului de semnalizare intracelulară a factorilor de transcripție Smad. În calea de semnalizare canonică a TGFB, factorii de transcripție Smad2/3 sunt fosforilați și, după formarea complexului cu Smad4, se translocă în nucleu [20]. Mai multe gene pot fi afectate de activarea TGFB1, deoarece induce expresia diferiților colageni, controlează proliferarea celulară, afectează apoptoza [20] și reglează expresia metaloproteinazei matriceale (MMP) [21]. Calea de semnalizare non-canonică a TGFB inițiază activarea MAPK-urilor prin fosforilare care, la rândul său, poate induce expresia ulterioară a TGFB [22]. JNK și p38 kinaze ca ținte TGFB sunt identificate înrenalfibroză și reglează apoptoza [23].

S-a demonstrat că activitatea fizică exercită efecte benefice la pacienții umani. Exercițiile fizice pot regla și amâna manifestarea AD [24, 25] și s-a raportat, de asemenea, reducerea biomarkerilor AD, cum ar fi tau și AB în plasmă [25]. S-a descoperit că activitatea fizică reduce incidența AD, sarcina neuropatologică asociată cu AD și declinul cognitiv [26]. Deși au fost publicate numeroase studii despre beneficiile activității fizice asupra formării AD [27], mecanismele intracelulare implicate în aceste efecte pozitive nu au fost discutate în detaliu. Există câteva modele animale în care șoareci modificați genetic cu supraexpresie tau și AB au fost testați în timpul exercițiilor fizice. În aceste modele, s-a dovedit că activitatea fizică crescută a fost capabilă să amâne manifestarea AD [28, 29]. Mai mult, s-a demonstrat că antrenamentul pe termen lung al acestor șoareci a avut efecte pozitive asupra disfuncțiilor organelor periferice în AD. Activitatea fizică a modificat diafonia PACAP-BMP în ADrinichiprin normalizarea expresiei acumulării de colagen de tip IV și A [30]. Mai mult, a fost publicată o analiză detaliată a funcției de protecție a antrenamentului asupra expresiei Sox9 în testiculele AD [31]. Antrenamentul activ afectează, de asemenea, semnalizarea TGFB, deoarece suprimărenalinflamație și fibroză ulterioară [32]. În plus, TGFB și semnalizarea acestuia sunt importante pentru remodelarea osoasă adultă care este perturbatărinichifibroză [33]. Ulterior, ipoteza noastră majoră a fost că antrenamentul fizic pe termen lung are un efect sistemic asupra semnalizării TGFB care poate reglarinichiproducția de matrice în AD. Modificările acestor căi de semnalizare pot duce la o scădere rinichifibroză și normalizează clearance-ul AD. Prin urmare, scopul nostru a fost să elucidam relația dintre semnalizarea TGFB și efectele bene-oficiale ale antrenamentului fizic asuprarinichifibroza în AD. În experimentele noastre, prezentăm dovezi că antrenamentul pe termen lung are efecte directe asupra semnalizării TGFB înrinichia șoarecilor AD. Mai mult, arătăm că exercițiul fizic crescut scaderinichifibroză prin normalizarea semnalizării TGFB canonice și necanonice.

Cuvinte cheie:boala Alzheimer, fibroza, activitatea fizica, Smad, boala de rinichi; renal

CISTANCHE VA ÎMBUNĂTĂȚI DIALIZA RINICHILOR/RENALĂ

MATERIAL SI METODE

AnimalS-au folosit șoareci masculi transgenici Alzheimer (n=5) (B6C3-Tg (APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/J) pentru a urmări efectul AD. Tip sălbatic (WT) de trei luni (fără modulare transgenică și fără antrenament) (n=5), șoareci transgenici Alzheimer (AD) (n=5) și AD antrenați (TAD) (n=5) șoarecii au fost ținuți în cicluri lumină/întuneric de 12/12 ore cu hrană și apă ad libitum. Alergarea pe banda de alergare cu intervale a fost aplicată pentru grupul de exerciții și combinat. Anterior, toate animalele care făceau exerciții au fost obișnuite cu banda de alergare cu motor (Columbus Inst., Columbus Ohio, SUA) și viteza de alergare timp de 2 săptămâni. Antrenamentul a fost efectuat de patru ori pe săptămână, timp de 60 de minute. Fiecare sesiune de antrenament a durat 10 cicluri, fiecare ciclu a constat din 4 minute de intensitate mare și 2 minute de alergare de intensitate scăzută. Viteza de alergare de intensitate scăzută a fost permanentă în timpul experimentului, adică o viteză de 10 m/min. În timp ce viteza de alergare de mare intensitate a început de la 16 m/min și a fost crescută la fiecare a treia săptămână cu 1 m/min până când s-a atins 20 m/min. Grupul de control și nutriție a fost, de asemenea, obișnuit cu banda de alergare și a stat acolo timp de 5 minute/zi pe o bandă de alergare în picioare [28]. Experimentele au fost începute cu animale de 3-lună și s-au încheiat la vârsta de 10 luni. Studiul a fost realizat în conformitate cu liniile directoare etice (numărul permisiunii etice pentru acest studiu: PEI/001/2105-6/2014, Universitatea Semmelweis, Ungaria). Kitul Phire Animal Tissue Direct PCR a fost utilizat pentru genotiparea animalelor (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului.

Morfologie microscopică ușoarăDupă ce s-au terminat toate testele cognitive, {{0}} șoareci de o lună au fost anesteziați cu o injecție intraperitoneală de ketamina (Richter, concentrație: 100 mg/ml)/xilazină (Produlab Pharma, concentrație: 20 mg/ ml) cocktail în doză de 0,1 ml/10 g greutate corporală și perfuzat transcardic cu soluție salină heparinizată rece ca gheață [28] șirinichiau fost eliminate. Probele de țesut au fost spălate în PBS de trei ori și fixate într-un amestec 4:1 de etanol absolut și 40% formaldehidă, apoi încorporate în parafină. Pentru colorarea tricrom a lui Masson (Sigma-Aldrich, MO, SUA) au fost realizate secțiuni în serie și a fost vizualizat țesut fibrotic. Protocolul de colorare a fost efectuat conform instrucțiunilor producătorului. Camera DP74 (Olympus Corporation, Tokyo, Japonia) pe microscopul Olympus Bx53 (Olympus Corporation, Tokyo, Japonia) a fost folosită pentru a realiza microfotografii.

Imunohistochimiea fost efectuat perinichiprobe de țesut de la șoareci WT, AD și șoareci TAD pentru a vizualiza localizarea Smad2, PCNA (antigen nuclear celular proliferant) și colagen de tip I (Col. I) [30].Rinichiau fost fixate într-un amestec 4:1 de etanol absolut și 40 la sută formaldehidă și s-au spălat în etanol 70 la sută. După încorporarea secțiunilor în serie, deparafinizarea a fost urmată de clătire în PBS (pH 7,4). Locurile de legare nespecifice au fost blocate cu 1% albumină serică bovină dizolvată în PBS (Amresco LLC, Solon, OH, SUA). Secțiunile au fost incubate cu Smad2 policlonal (Sigma-Aldrich, MO, SUA) la o diluție de 1:500, PCNA (Cell Signaling, Danvers, MA, SUA) la o diluție de 1:800 sau Col. I (Sigma-Aldrich, MO, SUA) anticorp la o diluție de 1:500 la 4°C peste noapte. Anticorpii primari au fost vizualizați cu adăugarea de anticorp secundar anti-iepure Alexa Fluor 555 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, SUA) a fost utilizat la o diluție de 1:1000. Probele au fost montate în mediu de montare Vectashield (Vector Laboratories, Peterborough, Anglia) care conține DAPI (4,6-Diamidino-2-diclorhidrat de fenilindol) pentru colorarea ADN-ului nuclear. Alexa Fluor 555 anti-iepure a fost folosit fără anticorpii primari pentru control negativ. Fotomicrografiile au fost realizate cu ajutorul camerei DP74 (Olympus Corporation, Tokyo, Japonia) pe microscopul Olympus Bx53 (Olympus Corporation, Tokyo, Japonia) pentru vizualizarea Col. I. Imaginile au fost obținute folosind software-ul cellSense Entry 1.5 (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japonia). ) cu setări constante ale camerei pentru a permite compararea intensităților semnalului fluorescent FL. Pentru detectarea Smad2 și PCNA, a fost utilizat un microscop confocal Olympus FV3000 (Olympus Co. Tokyo, Japonia) aplicând obiectiv de imersie în ulei de 60 × (NA: 1,42). Pentru excitare, s-au folosit linii laser de 543 nm. Durata medie a pixelilor a fost de 4Bs. Serii de imagini Z de 1 m grosime optică au fost înregistrate în modul de scanare secvențială. Imaginile Alexa555 și DAPI au fost suprapuse folosind software-ul Adobe Photoshop versiunea 10.0. Contrastul imaginilor a fost crescut în mod egal fără a modifica setările constante.

Analiza RT-PCRRinichide WT (n=5), AD (n=5) și TAD (n=5) au fost măcinate mecanic și au fost dizolvate în Tri zol (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) ), după 30 de minute de incubare la 4◦C și ARN total a fost izolat [30]. ARN-ul a fost recoltat în apă fără RNază și depozitat la –70◦C. Kitul High Capacity RT a fost utilizat pentru transcrierea inversă (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Pentru secvențele perechilor de primeri aplicate și detaliile reacțiilor în lanț a polimerazei, a se vedea tabelul 1. Amplificările au fost efectuate într-un termociclator (Labnet MultiGene™ 96-well Gradient Thermal Cycler; Labnet International, Edison, NJ, SUA) ca urmează: 95◦C, 2 min, urmat de 35 de cicluri (denaturare, 94◦C, 30 s, recoacere timp de 45 s la temperaturi optimizate conform tabelului 1; extensie, 72◦C, 90 s) și apoi 72◦C ,

7 min. Actina a fost folosită ca control intern. Produsele PCR au fost analizate folosind un gel de agaroză de 1,2 procente care conține bromură de etidio și au fost documentate cu sistemul geldocumetar FluorchemE (ProteinSimple, CA, SUA). Densitățile optice ale semnalelor produsului PCR au fost determinate utilizând programul gratuit ImageJ 1,40 g. Înainte de măsurătorile densității optice, am făcut calibrări individuale pe fiecare microfotografie. Apoi am mărit mărirea fotografiilor pentru a ajunge la dimensiunea pixelului individual și, cu metoda cu mână liberă, benzile au fost încercuite cu precizie și au măsurat densitatea integrată a zonei. Pixelii au fost măsurați în 5 experimente independente de către 3 operatori independenți. Semnalele au fost mai întâi comparate cu actina WT pentru o comparație mai bună a diferențelor de expresie la șoarecii AD și TAD. Numerele de sub benzi arată analiza statistică a experimentelor în care fiecare experiment separat (cel puțin 5) a fost normalizat pentru propriul semnal de actină și apoi au fost calculate diferențele statistice.

Analiza Western blot

Rinichide șoareci WT (n {{0}}), AD (n=5) și TAD (n=5) au fost spălate în soluție salină fiziologică N și depozitate la –7{{1 0}}◦C. Probele au fost măcinate mecanic în azot lichid și au fost colectate în 100 mL de tampon de omogenizare RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay) (150 mM clorură de sodiu; 1,0% NP40, 0,5% deoxicolat de sodiu; 50 mMTris, pH 8,0) care conține inhibitori ai proteazei (Aprotinin) 10 g/mL), 5 mM Benzamidină, leupeptină (10 ug/mL), inhibitor de tripsină (10 g/mL), 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 8 mM NaFluorură, 1 mM Na-ortovanadat). Peleții au fost sonicați prin explozie pulsatorie timp de 30 s la 40 A (ColeParmer, IL, SUA). Au fost preparate lizate celulare totale pentru analizele Westernblot [30]. 20 g de proteine ​​au fost separate în geluri SDS-poliacrilamidă 7,5% pentru detectarea TGF-1, TGF R1, TGF-R2, Smad2, Smad3, ERK1/2, P-ERK1/2, p38, P-p38,

JNK, PP2A, PP2B, p21, PCNA, caspaza clivată3, MMP9, colagen tip I (Col. I) și actină. Kitul de detectare PhosphoSer/Thr (Millipore, Billerica, MA, SUA) a fost utilizat pentru a detecta nivelul de fosforilare al lanțurilor laterale de aminoacizi Ser/Thr. Proteinele au fost tamponate pe membrane de nitroceluloză și expuse la anticorpii primari peste noapte la 4°C în diluția prezentată în tabelul 2. Incubarea a fost urmată de spălare PBST de 30 de minute, apoi membranele au fost acoperite cu anticorpul secundar IgG de iepure conjugat cu peroxidază într-un 1 :1500 (Bio-Rad Laboratories, CA, SUA) sau IgG anti-șoarece în diluție 1:1500 (Bio-Rad Laboratories, CA, SUA). Pentru detecție a fost utilizată chemiluminiscența îmbunătățită (Advansta Inc., Menlo Park, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Actina a fost folosită ca control intern. Semnalele au fost captate cu o cameră răcită pe un sistem documentar cu gel (Fluorchem E, ProteinSimple, CA, SUA). Densitățile optice ale semnalelor au fost măsurate utilizând programul gratuit ImageJ 1.40g. Înainte de măsurătorile densității optice, am făcut calibrări individuale pe fiecare microfotografie. Apoi am mărit mărirea fotografiilor pentru a ajunge la dimensiunea pixelului individual și, cu metoda cu mână liberă, benzile au fost încercuite cu precizie și au măsurat densitatea integrată a zonei. Pixelii au fost măsurați în 5 experimente independente de către 3 operatori independenți. Semnalele au fost mai întâi comparate cu actina WT pentru o comparație mai bună a diferențelor de expresie în AD și TAD. Numerele de sub benzi arată analiza statistică a experimentelor în care fiecare experiment separat (cel puțin 5) a fost normalizat la propriul semnal de actină și apoi au fost calculate diferențele statistice.

analize statisticeToate datele sunt reprezentative pentru cel puțin cinci experimente independente. Pentru toate figurile, probele din aceleași animale WT, AD și TAD au fost alese cu controlul lor interior pentru o comparație mai bună. În fiecare figură a fost folosită o singură fotografie demonstrativă din același grup de animale. Analiza statistică a fost efectuată prin analiza unidirecțională a varianței (ANOVA), urmată de testul post-hoc al lui Tukey HSD. Pragul pentru diferențele semnificative statistic în comparație cu eșantioanele de control a fost stabilit la ∗p < 0.05="" și="" la="" eșantioanele="" ad="" #p="">< 0,05.="" ∗="" indică="" diferențele="" wt="" față="" de="" ad="" și="" tad,="" #="" indică="" diferențele="" ad="" față="" de="">

REZULTATE

Activitatea fizică a normalizat calea de semnalizare canonică a TGF în rinichii șoarecilor ADExprimarea elementelor căii de semnalizare canonice TGFB a fost investigată în detaliu. Expresia proteinei și ARNm a TGFB1 nu a arătat nicio diferență semnificativă cândrinichide șoareci WT și AD au fost comparați, dar expresia crescută a fost găsită în probele TAD (Fig. 1A, B). Expresia TGFRI a scăzut în AD, dar activitatea fizică a normalizat-o (Fig. 1A, B), în timp ce expresia TGFBRII a crescut înrinichide șoareci AD, dar a scăzut după activitatea fizică (Fig. 1A, B). În conformitate cu aceste observații, expresia Smad2 a crescut în probele de AD și a fost normalizată după fizică.activitate (Fig. 1A, B). Dimpotrivă, expresia lui Smad3 a arătat o scădere moderată arinichide șoareci AD care a fost compensat în probele TAD (Fig. 1A, B). Creșterea semnalelor pozitive Smad2 a fost observată în sistemul tubular al cortexului, dar nu și înrenalcorpusculi la șoarecii AD. Această creștere a fost redusă în tubulii animalelor TAD (Fig. 1C).

Căile de semnalizare non-canonice au fost modificate în rinichii șoarecilor AD după activitate fizicăMAPK-urile, cum ar fi ERK, p38 și JNK, formează o parte importantă a semnalizării TGF non-canonice [22]. Expresia ARNm a ERK nu a fost modificată înrinichide șoareci AD, dar au arătat o scădere a probelor TAD (Fig. 2A). Expresia proteinei acestei kinaze nu a fost în corelație cu expresia ARNm și a fost detectată o reducere puternică înrinichide șoareci AD cu o normalizare moderată după o activitate fizică crescută (Fig. 2B). Forma activă, fosforilată a fost interesant de crescută în probele de AD și a arătat o scădere similară arinichide șoareci TAD (Fig. 2B). Expresia ARNm a p38 nu a fost modificată semnificativ în nicio probă (Fig. 2A). Expresia proteinei p38 a crescut puternic înrinichide șoareci AD care a fost parțial compensat de activitatea fizică (Fig. 2B). În mod interesant, forma fosforilată mai activă a arătat o reducere a probelor AD care

a fost normalizat la animalele TAD (Fig. 2B). Expresia ARNm a JNK a fost redusă atât în ​​probele AD și TAD (Fig. 2A). Expresia proteinei a celor 2 izoforme ale JNK a fost detectată prin analiza Western blot. Au fost dezvăluite funcții neredundante pentru JNK1 și JNK2 [34] și s-a detectat o scădere semnificativă a izoformei de 57 kDa și a izoformei de 46 kDa în probele AD (Fig. 2B). Izoformele de 57 kDa și 46 kDa au prezentat o creștere după activitatea fizică înrinichide șoareci TAD (Fig. 2B).

Expresia alterată a fosfatazelor Ser/Thr și fosforilarea proteinelor modificată în ADExpresia și funcția proteinei fosfatazei specifice Ser/Thr modificate au fost demonstrate în AD [35, 36]. Am detectat o expresie crescută a PP2B înrinichide șoareci AD, dar a fost redusă de activitatea fizică (Fig. 2A, B). Dimpotrivă, expresia celeilalte fosfataze specifice Ser/Thr celulare majore, PP2A, a apărut cu o reducere puternică arinichide șoareci AD (Fig. 2A, B). În probele TAD, expresia ARNm și a proteinei subunității catalitice PP2A a crescut (Fig. 2A, B). Investigarea fosforilării proteinelor pe reziduurile Ser/Thr a arătat un semnal puternic la 55 kDa înrinichia șoarecilor AD, reprezentând greutatea moleculară a tau (Fig. 2C). O altă bandă crescută a apărut la 10 kDa care corespunde greutății moleculare a C-terminalului scindat al APP (Fig. 2C). Fosforilarea ambelor aceste proteine ​​a fost redusă la exercițiu (Fig. 2C).

Semnalizarea TGF a afectat ciclul celular și apoptozaCa markeri ai proliferării celulare au fost monitorizate nivelurile de expresie p21 și PCNA. Se știe că activarea TGFB induce expresia p21 [37]. În plus, activarea TGFB1 are ca rezultat o proliferare celulară alterată [38]. Prin urmare, a fost investigată expresia antigenului nuclear celular proliferant (PCNA). Nivelul de proteină al p21 a fost semnificativ crescut în AD, dar a fost redus în probele TAD (Fig. 3A, B). PCNA a răspuns diferit: AD a provocat o reducere a expresiei proteinei, în timp ce proteina PCNA a crescut la exercițiu (Fig. 3A, B). Imunohistochimia a fost efectuată pentru a identifica celulele pozitive PCNA și a dus la o imunoreactivitate redusă în celulele tubulare din rinichii șoarecilor AD. În mod interesant, a fost demonstrată o pozitivitate PCNA normalizată în celulele tubulare la șoarecii TAD. Nu au fost detectate celule pozitive PCNA înrenalcorpusculi (Fig. 3C). Deoarece semnalizarea TGF1 poate afecta apoptoza [39], a fost investigată forma activă a caspazei proapoptotice. Deși a fost detectată o ușoară expresie de ARNm a caspazei3 în probele WT, nu a fost prezentată nicio capază activă scindată. Dimpotrivă, un ARNm puternic și caspaza 3 scindată au apărut în probele de AD, în timp ce creșterea activității fizice a redus expresia proteinei proapoptotice (Fig. 3A, B).

Fibroza renală a fost reglată în jos de activitatea fizicăRezultatele anterioare indică o posibilă fibroză la rinichii animalelor AD. În primul rând, a fost investigată expresia MMP9, care poate fi reglată prin activarea TGFB1 [21]. ARNm al MMP9 a fost exprimat în toate probele, dar a arătat o creștere semnificativă numai în rinichii șoarecilor TAD. Expresia proteică a metaloproteinazei matricei a fost la limita de detectare în probele WT, dar a arătat o creștere semnificativă la animalele AD. În mod surprinzător, exercițiul fizic activ a crescut dramatic expresia MMP9 (Fig. 4A, B). Cealaltă componentă a proceselor fibrotice este depunerea crescută de colagen de tip I înrinichi[40]. În probele WT, ARNm scăzut și expresia proteinei de colagen de tip I au fost detectate, dar a fost observată o creștere puternică la animalele cu AD. Mișcarea fizică activă a normalizat atât expresia ARNm, cât și a proteinei a colagenului de tip I (Fig. 4A, B). Colagenul de tip I înconjoară în mod normal tubii și este localizat și în interstițiu. Cu colorația patohistologică de rutină a tricromului lui Masson, culoarea albastră reprezintă prezența oricărui tip de colagen, care era vizibil în jurul tubilor,renalcorpusculi și o cantitate mică în interstițiul din rinichii WT. În probele AD a fost vizibilă o acumulare puternică în interstițiu și în unii tubuli. După activitatea fizică, cantitatea de colagen a fost redusă și nu a fost detectată nicio acumulare în interstițiu (Fig. 4C). S-a efectuat imunohistochimia colagenului de tip I pentru a specifica colagenul acumulat. În WTrinichi, similar colorării lui Masson, au apărut semnale în jurul tubilor,renalau fost de asemenea vizibili corpusculii si un semnal interstitial slab. În probele de la șoareci AD, a fost demonstrată o imunopozitivitate puternică în interstițiu și în jurul sistemului tubular. În mod surprinzător, o reducere a fost vizibilă în țesutul interstițial, dar un semnal semnificativ a apărut în partea apicală a celulelor epiteliale tubulare la animalele TAD (Fig. 4D).

CISTANCHE VA Ameliora DURILE DE RINCHI/RENALI

DISCUŢIE

Deși procesul de formare a AD este discutat pe scară largă în SNC, modificările și posibilele patologii periferice însoțitoare nu sunt investigate în detaliu. Ipoteza noastră majoră a fost cărinichifibroza este un posibil proces care afectează manifestarea AD și acumularea A. Pe de altă parte, antrenamentul fizic pe termen lung are un efect pozitiv asupra AD, care poate avea o corelație cu calea de semnalizare a TGFB de alterare sistemică. S-a demonstrat că organele periferice sunt implicate în patogeneza AD, deoarece, printre altele, a fost detectată o activitate metabolică alterată a enzimelor la pacienții cu AD [41], iar acumularea a fost demonstrată în pancreas [42] și înrinichi[30]. Această boală sistemică care afectează diferite organe face dificilă diagnosticarea precoce și vindecarea AD. Clearance-ul AD din SNC este parțial reglat de astrocite și microglia, dar o parte după trecerea prin bariera hemato-encefalică poate fi îndepărtată la periferie [43]. Acest clearance periferic este considerat una dintre posibilele ținte ale medicamentului pentru reducerea concentrației AD în plasmă [44]. Secreția de molecule mici de către tubii proximali ai rinichilor reprezintă o funcție homeostatică vitală și poate participa la secreția de toxine sau proteine ​​în urină [45]. S-a demonstrat că AD este secretată în urină și poate fi un semn de diagnostic al demenței [46]; în plus, disfuncția renală la vârstnici poate crește riscul de demență [47] și s-a constatat că nivelurile serice de AD au fost semnificativ mai mari la pacienții cu BRC [10]. Aceste date indică o posibilă funcție arinichiîn clearance-ul AD în periferie. Exercițiul fizic s-a dovedit a avea efecte pozitive asupra funcției rinichilor, deoarece menține morfologia glomerulară adecvată și protejează secreția tubulară [48]. S-a demonstrat că creșterea activității fizice scade semnalizarea TGFB în rinichi și exercițiul fizic poate fi o bună strategie antifibrotică [32]. În total, activarea TGF poate avea o legătură directă cu semnalizarea legată de activitatea fizică, care poate menține clearance-ul AD la periferie. Prin urmare, am investigat calea de semnalizare a TGFB la șoarecii AD, AD și WT antrenați pe termen lung.

În studiul actual, s-a demonstrat că expresia TGFFRII a fost crescută în rinichii șoarecilor AD și parțial normalizată în probele TAD. TGFBRII crescut indică o activare îmbunătățită a căii de semnalizare a TGFB în AD [49]. Scăderea expresiei TGF RI a arătat că TGF se leagă cu afinitate mai mare la TGFBRII și formarea homodimerului este probabilă în AD [50]. Similar cu aceste rezultate, formarea homodimerului TGFFRII a fost demonstrată la macrofage înrenalfibroză [51]. Pe de altă parte, antrenamentul pe termen lung a egalat expresia receptorilor TGFB sugerând o formare a complexului receptor heterodimer care poate fi stabilizat prin expresia crescută a TGFB1 [50]. Mai mult, expresia Smad2 și Smad3 a fost modificată în mod controversat în AD. Se știe că Smad2 este activat în mod clasic de receptorii TGF și translocat în nucleu, în timp ce Smad3 are o funcție distinctă [52]. S-a publicat că reglarea în jos a Smad3 afectează fibroza [53]. Expresia normalizată a factorilor de transcripție Smad în probele TAD indică

că activitatea fizică a reechilibrat semnalizarea TGFB și a redus activarea sa patobiochimică. Familia protein kinazei activate de mitogen (MAPK) care conține p38MAPK, JNK și ERK are o interacțiune cu semnalizarea TGF [54]. Expresia crescută a p38 a fost demonstrată în celulele epiteliale tubulare care induc fibroza renală și blocarea acesteia poate fi o țintă bună a tratamentului fibrozei [55]. La șoarecii AD a fost detectată o expresie crescută a proteinei p38, ceea ce susține în continuare formarea fibrozei. Dimpotrivă, fosforilarea p38 a fost redusă în rinichii AD, indicând o activare dependentă de stadiul de fibroză a p38 MAPK [56]. Pe de altă parte, activitatea fizică crescută a normalizat parțial atât forma p38, cât și forma fosforilată prezentă în rinichi, sugerând o funcție de echilibrare a antrenamentului în formarea fibrozei mediate de p38-. Similar cu p38 kinaza, inhibarea JNK poate suprima formarea fibrozei [57]. Activarea JNK are diverse funcții în diferite părți ale rinichiului, cum ar fi filtrarea glomerulară și procesele fibrotice interstițiale [58]. Extractul proteic din experimentele noastre derivat din lizat total de rinichi indică faptul că în timpul dezvoltării AD JNK are probabil o funcție distinctă în părțile tubulare și glomerulare cu activare a izotipului specific celulei în rinichii afectați de AD. Activarea MMP indusă de TGFB1 a fost raportată în funcție de funcția p38 [59], în timp ce inhibarea activității ERK a redus fibroza interstițială [60]. Aceste date susțin puternic funcțiile distincte ale membrilor familiei MAPK în patogeneza fibrozei renale în AD. Am detectat o expresie scăzută a ERK în rinichii șoarecilor AD, în timp ce cantitatea din forma sa activă fosforilată a crescut semnificativ. În grupul experimental de șoareci care au participat la antrenamentul fizic pe termen lung, am detectat expresia normalizată a ERK și a fosfo-ERK și un efect benefic asuprafunctie renala.Aceste observații susțin contribuția ERK la transformarea fibrotică a rinichilor în AD și demonstrează o influență pozitivă surprinzător de evidentă a antrenamentului fizic asupra morfologiei și funcției rinichilor șoarecilor AD. Recent, laboratorul nostru a dovedit implicarea ERK în mecanotransducția celulelor cartilajului în curs de dezvoltare [61].

Fosforilarea TGFBRII, Smad, JNK, p38 și ERK are loc pe resturile Ser [62] care propun o posibilă activare a fosfatazelor Ser/Thr. Dereglarea PP2B a fost demonstrată în AD [35, 63]. Pe de altă parte, PP2B nu reglează în mod semnificativ fosforilarea tau în creier, deși este capabil să o defosforileze în mai multe locuri de fosforilare [35]. Cealaltă fosfatază celulară majoră Ser/Thr, PP2A, defosforilează, de asemenea, proteinele de pe reziduurile Ser și activitatea sa este redusă în AD și este capabilă să regleze fosforilarea tau cu o afinitate mai mare decât PP2B [64]. A fost demonstrată o PP2A redusă, dar o expresie crescută a PP2B în rinichii șoarecilor AD, în mod similar cu SNC. Fosforilarea crescută a resturilor Ser, ca rezultat al scăderii expresiei PP2A, poate induce hiperfosforilarea proteinei tau sau APP așa cum a fost prezis la rinichii șoarecilor AD. Defosforilarea JNK și p38 poate fi reglată direct de PP2B [65], prin urmare, scăderea activării acestor kinaze în AD poate fi consecința exprimării crescute a PP2B. Pe de altă parte, defosforilarea kinazei ERK se poate întâmpla în mod dominant prin activarea PP2A [66], expresia redusă ulterior a PP2A poate duce la o fosforilare crescută a ERK în AD. Antrenamentul pe termen lung al șoarecilor AD a acționat spre normalizarea expresiei PP2B și PP2A, care, la rândul său, părea să schimbe nivelul de fosforilare Ser/Thr al enzimelor MAPK mai aproape de normal. Sarcina mecanică a exercitat un efect de echilibrare asupra fosforilării reversibile prin implicarea PP2B și PP2A și în diferențierea condrocitelor [61].

Activarea căii de semnalizare non-canonice TGFB reglează proliferarea celulară și apoptoza. Similar cu rezultatele noastre, celulele p21 pozitive au fost arătate în sistemul tubular al rinichiului [67] și am demonstrat, de asemenea, expresia lor crescută în AD. Această creștere sugerează o oprire a ciclului celular în AD mediată de activarea MAPK, în timp ce p21 interacționează cu PCNA și blochează celulele în faza S a ciclului celular [68]. Am detectat activarea p21 și, probabil, o reducere puternică a PCNA în sistemul tubular al șoarecilor AD. Similar cu descoperirile noastre anterioare, activitatea fizică îmbunătățită a normalizat ciclul celular în celulele sistemului tubular. Pe de altă parte, p21 are, de asemenea, o legătură cu activarea caspazei și JNK, în timp ce ERK induce și clivajul caspazei3 [69, 70]. S-a identificat că activarea caspazei3 joacă un rol important în patogeneza AD prin acumularea de A și tulburările sinoptice induse de clivaj ABPP mediate de caspază [71]. În rinichii șoarecilor AD, am detectat expresii de caspază 3 cu scindare ridicată, indicând apoptoză crescută și pierderea funcției celulelor tubulare și glomerulare. Aceste procese pot promova acumularea de AD în interstițiul renal, așa cum am arătat mai devreme [30].

CISTANCHE VA AMUNĂȚI INFECȚIA RENICALE/RENALE

S-a demonstrat că semnalizarea mediată de TGFB crește expresia și acumularea de colagen în interstițiu [40]. Conform acestor rezultate la rinichii șoarecilor AD, am demonstrat o expresie semnificativ crescută a colagenului de tip I acumulat în interstițiu. Aceste date sugerează cu tărie că alterarea semnalizării TGFB canonice și non-canonice în AD joacă un rol crucial în fibroza renală [18, 72]. Dimpotrivă, antrenamentul pe termen lung a redus localizarea colagenului interstițial de tip I, cel puțin parțial, prin reechilibrarea semnalizării TGFB. Fibroza redusă poate induce clearance-ul AD și scăderea acesteiarenalacumulare, așa cum am demonstrat mai devreme [30]. Această ipoteză a fost susținută de descoperirile noastre, deoarece antrenamentul fizic a dus la acumularea de colagen de tip I în celulele epiteliale tubulare, ceea ce a fost demonstrat în rinichii șoarecilor TAD implicând procesul de degradare a colagenului. MMP9 poate fi activată prin semnalizarea TGFB în rinichi [73] și are ca rezultat degradarea fibrilelor matricei. Deși MMP-urile au atât rol inhibitor, cât și stimulator în fibroză, MMP9 este considerat un agent profibrotic mediat de activarea TGFB [74]. Dimpotrivă, s-a demonstrat că MMP9 poate juca un rol reglator în degradarea colagenului de tip I în rinichi [75]. La rinichii șoarecilor AD, am arătat o expresie crescută a MMP9 care sugerează funcția sa în procesul fibrotic controlat de cascada de semnalizare TGFB. Pe de altă parte, înălțarea ulterioară a fost măsurată după antrenament pe termen lung, ceea ce poate fi motivul reducerii puternice a expresiei și a aspectului tubular al colagenului de tip I. În stimulul mecanic, laboratorul nostru a arătat că expresia MMP9 a fost crescută în culturile condrogenice primare. [76] și rezultate similare au fost publicate în formarea țesutului cicatricial în care compresia mecanică a crescut expresia MMP9 [77]. În leziunea renală acută, creșterea MMP9 are funcție anti-apoptotică și protejează partea S3 a tubilor proximali [78]. În plus, calea de semnalizare a TGFB activată de forfecare și scăderea formării fibrozei au fost de asemenea detectate în plămâni [79]. Mai mult, stresul mecanic în celulele epiteliale pulmonare a indus remodelarea ECM prin activarea MMP9 și a modificat expresia colagenului [80]. Prin urmare, putem concluziona că activitatea fizică crescută induce remodelarea producției de matrice prin modularea semnalizării TGFB nu numai local, ci și sistemic. Limitările muncii noastre sunt că șoarecii transgenici pot avea o formare mai rapidă a AD și funcția rinichilor nu este investigată în detaliu. Trebuie investigat în continuare că numai producția de matrice indusă de TGFB este alterată în rinichii fibrotici ai șoarecilor AD sau reglarea echilibrului de sodiu și potasiu și clearance-ul AD este, de asemenea, implicat în antrenamentul pe termen lung. În plus, acumularea de colagen de tip I în urină poate fi urmărită în continuare pentru a îmbunătăți faptul că antrenamentul fizic pe termen lung în AD duce la reducerea fibrozei renale. Pe de altă parte, am demonstrat in vivo că antrenamentul fizic pe termen lung are un efect sistemic asupra semnalizării TGFB canonice și non-canonice. In vivo am demonstrat că antrenamentul fizic a redus formarea de fibroză renală în AD, ceea ce are un efect pozitiv asupra manifestării bolii. În concluzie, datele noastre sugerează că activarea căilor de semnalizare TGFB joacă un rol cauzal în transformarea fibrotică a rinichilor șoarecilor AD. Ca o abordare foarte simplă pentru a obține modificări pozitive în această afecțiune, recomandăm antrenamentul fizic pe termen lung, deoarece a reușit să normalizeze expresia și fosforilarea membrilor căilor de semnalizare TGFB canonice și non-canonice și a dus la îmbunătățirea fibrozei renale. Mai mult, exercițiul fizic care inhibă fibroza poate reechilibra funcția rinichilor și poate induce un clearance crescut al AD sistemică în AD.