Potențial beneficiu terapeutic al Cistanche în doză mică în sindromul de oboseală cronică

Sindromul oboselii cronice(ME/CFS) este un multisistemic debilitantstare cronică de etiologie necunoscută classifified ca o disfuncție imunitarăsindrom și tulburare neurologică. Descoperirea Tranzitorului larg exprimatReceptor potențial Melastatin 3 (TRPM3) ca canal nociceptor țintit în mod substanțialde anumiți receptori opioizi și implicarea acestuia în calciu (Ca2 plusNatural Killer dependent de )-Funcțiile imune ale celulelor (NK) au ridicat posibilitatea ca TRPM3 să fiețintit farmacologic pentru a trata simptomele caracteristice ME/SFC. Naltrexonaclorhidratul (NTX) acţionează ca un antagonist al mu (mreceptorul )-opioid negativ astfelfuncția sa inhibitoare asupra TRPM3. Pe baza beneficiilorraportate de pacienți pe lorsimptome, doză mică de NTX (LDN, 3.0–5. Tratamentul cu 0 mg/zi) pare să ofere un beneficiu potențialsugerând că efectul său poate fi direcționat către patomecanismul ME/CFS. Deoarece nu există literatură care să confirmeeficacitateade LDN pentru pacienții cu ME/SFCin vitro, acest studiu investighează efectul terapeutic potențial al LDN la pacienții cu ME/SFC. TRPM3Activitatea canalului ionic a fost măsurată după modulare cu sulfat de pregnenolon (PregS) și niciunul înCelulele NK pe 9 pacienți cu ME/SFC care iau LDN și 9 pacienți potriviți în funcție de vârstă și sexcontroale sănătoase folosind tehnica patch-clamp cu celule întregi. Raportăm că pacienții cu ME/SFCluând LDN, au restabilit TRPM{0}}curenții ionici în celulele NK. Curenți ionici mici cu aTRPM tipic3-ca rectificarea externăau fost măsurate după aplicarea PregS, aAgonist3-TRPM, în celulele NK de la pacienții care iau LDN. În plus, ionic evocat de PregScurenții prin TRPM3 au fost semnificativmodulat de niciunul în, un antagonist3-TRPM,în celulele NK de la pacienții cu ME/SFC care iau LDN. Aceste date susțin ipoteza căLDN poate avea potențial ca tratament pentru ME/SFC prin caracterizarea subiacentelor mecanismele de reglementare ale tratamentului cu LDN care implică TRPM3 și receptorii opioizi în NKcelule. În cele din urmă, acest studiu poate servi pentru reutilizarea medicamentelor comercializate, precum și pentru sprijinaprobarea studiilor clinice prospective randomizate privind rolul și doza de NTX întratarea pacienților cu ME/SFC.

Cuvinte cheie:cistanche în doză mică, potențial receptor tranzitoriu melastatină 3, calciu, receptor opioid, mialgicencefalomielita/sindromul oboselii cronice, celule ucigase naturale, electrofiziologie cu plasture cu cleme întregi

INTRODUCERE

Encefalomielita mialgică/Sindromul oboselii cronice(PE MINE/CFS) este o afecțiune multisistemică severă caracterizată prinoboseală persistentă debilitantă însoțită de o serie desimptome invalidante, inclusiv stare de rău post-efort, somndisfuncție, durere larg răspândită, precum și neuro-cognitive,autonom, cardiovascular, neuroendocrin și imunitarmanifestări (1, 2). Există o severitate variabilă a ME/SFC(ușoară până la foarte severă) (3), unde este semnificativsi consistentdisfuncție imunitară și anomalii la ucigașul natural (NK)funcțiile celulare au fost raportate pe baza severității (4). Fărăun test diagnostic stabilit clinic, diagnosticul este complex șiimprecis. Diagnosticul se bazează în prezent pe diferite simptomedefiniții de caz, cunoscut sub numele de criteriile de consens canadian(CCC, 2003) și International Case Criteria (2011), careabordează caracteristicile clinice ale ME/SFC (2, 5, 6). Theetiologie şi specificăfiziopatologia afecțiunii, careafectează 17 până la 24 de milioane de oameni din întreaga lume (7), rămân necunoscute.ME/SFC se dezvoltă potențial din cauza deficienței înCation neselectiv cu potențial receptor tranzitoriu (TRP).canale cauzate fie de factori genetici sau dobândiți (8–13). Studiile anterioare au sugerat importanța TRP Melastatin 3(TRPM3), un calciu larg exprimat (Ca2 plus)-permeabilcanal cationic neselectiv, în fiziopatologia ME/SFC(8–10). Recent, investigații electrofiziologice independentea demonstrat o pierdere a funcției canalului ionic TRPM3 dupăstimulare cu doi agonişti{0}}TRPM puternici, pregnenolonăsulfat (PregS) și nifedipină și inhibare cu un selectivși blocant puternic, deoxibezoina ononetina, în celulele NK dintrei cohorte diferite de pacienți cu ME/SFC (11–13). TRPM3 a fost identificat anteriorca chimio- şicanal nociceptor termosensibil la nivelul somatosenzorialsistem și este implicat în detectarea căldurii nocive și inflamatoriihiperalgezia termică precum și în transmiterea durerii(14). Literatura recentă sugerează că căile de semnalizareasociat cu activarea anumitor proteine ​​G cuplatereceptorii (GPCR), numiți receptori opioizi, pot inhiba TRPM3activitatea canalului ionic prin legarea directă a Gbgsubunitatea aproteinele G trimerice către canalul ionic (15–18). Fiziologic,receptorii opioizi sunt activați de peptidele opioide endogene lamodulează mecanismele dureroase și inflamatoriicăi (19). Medicamentele opioide sau opiaceele produc atât analgezie cât șireacții adverse nedorite prin atașarea la aceleași GPCR (19). Dovezile indică faptul că receptorii opioizi nu sunt doar exprimațide sistemul nervos central (SNC), dar sunt larg distribuitepe țesuturi și sisteme de organe din afara SNC, cum ar ficelule imunitare (20). Activarea receptorilor opioizi leucocitariduce la secreţia de peptide opioide endogene, careactivează ulterior receptorii neuronali opioizi și atenueazădurere (21). De asemenea, s-a demonstrat că opioidele au imunosupresiveefecte asupra sistemului imunitar înnăscut și adaptativ (22). PE MINE/Patologia CFS poate fi considerată o tulburare a canalelor ionice saucanalopatie (8–13), precum și o disfuncție imunitarăsindrom și tulburare neurologică (23, 24). Astfel, este vitalpentru a investiga mecanismele de reglementare care stau la bazaInteracțiunea receptorilor opioizi TRPM3-în celulele NK din ME/CFSpacienților pentru a înțelege mai bine patogeneza.Descoperirea TRPM3 ca canal nociceptorvizat în mod substanțial de anumiți receptori opioizi, precum și de acestaimplicare în Ca2 plus-functii imune dependente ale celulelor NKsugerează că canalul ionic TRPM3 poate fi farmacologicvizate pentru a trata ME/SFC. Clorhidratul de naltrexonă (NTX) este aîn special antagonist opioid de lungă duratăcare vizează mu-opioidulreceptor (MOR) și, într-o măsură mai mică, delta-opioidulreceptori (dSAU) (25, 26). Legarea NTX pemSAU neagăfuncția inhibitorie a acestor receptori opioizi asupra TRPM3 (15, 17, 18, 26). Am raportat anterior astain vitrotratamenta celulelor NK de la pacienții cu ME/SFC cu NTX timp de 24 de ore, restaureazăactivitatea canalului ionic TRPM3 (13). Restaurarea ionului TRPM3activitatea canalului, la rândul său, a restabilit Ca adecvat2 plussemnalizare şiîn sinecelule NK' funcţii de activare şi efectoare(13). NTX este utilizat în mod obișnuit în tratamentul opioidelor șidependență de alcool într-o doză de 50-100 mg/zi (25). La mareSe crede că NTX blochează sentimentele de euforie ale beta-endorfinelorcare sunt implicate în circuitele naturale de recompensă șiprin urmare poate susține dependența (27). O doză mică (3.0–5.0 mg/zi,doză mică de NTX, LDN) pare să aibă un efect opus,sporind efectul endorfinei pentru a reduce durerea și pentru a stimulaplăcere (28). Se crede căau relevanță în bolicum ar fi ME/CFS, unde insuficientesecretia de endogenepeptidele opioide afectează răspunsul imun sau controlul durerii (29, 30), sau eliberarea de pro-inflamatoriicitokine (25, 31). RecentStudiul a raportat că LDN este sigur și eficient pentru a atenua ME/SFCsimptome prin examinarea retrospectivă a pacientului clinicînregistrările a 218 pacienți cu ME/SFC cărora li sa administrat LDN (27). Chiar dacănoi dovezi indică faptul că LDN poate îmbunătăți funcția zilnică șicalitatea vieții la pacienții cu ME/SFC, în continuarein vitroancheta estenecesare pentru a înțelege mecanismele de reglementare subiacenteimplicând TRPM3 și receptorii opioizi în celulele NK pentru a ajutaînțelege patomecanismul ME/SFC și identificătinte terapeutice.Acest studiu de față a investigat potențialul efect terapeuticde LDN la pacienții cu ME/SFC prin restabilirea canalului ionic TRPM3funcția în celulele NK folosind tehnici de patch-clamp pentru celule întregi.Rezultatele noastre indică faptul că pacienții cu ME/SFC care iau LDN aua restabilit TRPM3-curenții ionici în celulele NK. Restaurare aFuncția TRPM3 este necesară pentru a promova Ca2 plusremodelarea semnaluluiîn celulele NK șiîn sineActivarea celulelor NK și funcțiile efectoare.Acesta este primulstudiu pentru a raporta eficacitateade LDN pentru ME/CFSpacientiiin vitro, confirmând decipotențialul său de utilizare ca atratament pentru boala.

Faceți clic aici pentru a afla mai multe informații despre funcția anti-oboseală cistanche

MATERIALE ȘI METODERecrutarea participanților

Nouă pacienți cu ME/CFS și nouă sănătoși în funcție de vârstă și sexcontroale (HC) au fost recrutate folosind Centrul Național pentruPacient de neuroimunologie și boli emergente (NCNED).baza de date între septembrie 2019 și februarie 2021.Participanții aveau vârste cuprinse între 18 și 60 de ani. Toate ME/CFSpacienții primiseră anterior o confirmarediagnostic medicalși au fost verificate folosind un chestionar online cuprinzătorcorespondent cu Centrele pentru Controlul Bolilor şiPrevenție (CDC), CCC și definiții de cazuri ICC. Toate cele nouă ME/Pacienții cu CFS au fost definițide către CCC. Toți cei nouă pacienți cu ME/SFCau fost recrutați de NCNED deoarece au început anterior LDNtratament (3.0–5.0 mg/zi) timp de cel puțin 4 săptămâni ca parte a acestoraplan de management după prescripție de către medicul lor generalist.HC nu a raportat nicio incidență de oboseală și era în stare bună de sănătatefără dovezi de boală. Participanții au fost excluși din aceastastudiază dacă au fost însărcinate sau alăptează sau au raportat aantecedente de fumat, abuz de alcool sau boli cronice(de exemplu, boli autoimune, boli cardiovasculare,diabet zaharat, sindrom metabolic, boli tiroidiene, afecțiuni maligne,insomnie, oboseală cronică și tulburări psihologice primare)sau erau obezi (IMCMai mare sau egal cu30). Niciun participant nu a raportat consumul de opioidesau orice alte analgezice în ultimele 3 luni, precum șiagenţi farmacologici care influenţează direct sau indirect TRPM3 sau Ca2 plussemnalizare. Participanților li sa oferitopțiunea de a înceta orice conflictmedicamente pentru minim 14zile înainte de donarea de sânge cu aprobarea medicului lor.Toți participanții au completat un chestionar online de furnizatmediul socio-demografic, istoricul medical, medicamentele șiistoricul simptomelor pentru pacienții cu ME/SFC (tabelul 1). Elementul 36-anchetă scurtă de sănătate (SF-36) și Organizația Mondială a Sănătății(OMS) Programul de evaluare a dizabilităților (DAS) a fost folosit pentrudetermina nivelul de handicap și calitatea vieții (masa 2) (32, 33). În cele din urmă, pacienților cu ME/CFS li s-a cerut să-și raporteze singur severitateasimptome înainte și după administrarea LDN (Tabelul 3). Acestancheta a fost aprobată de GriffithUman universitarComitetul de etică a cercetării (GU2019/1005) și Gold CoastComitetul de etică a cercetării umane a Spitalului Universitar(HREC/2019/QGC/56469).

Celulă mononucleară a sângelui perifericIzolarea și Izolarea Natural Killer Cell

S-au recoltat în total 85 ml de sânge integraltuburi de acid etilendiaminotetraacetic (EDTA).prin intermediulvenopuncturăde către un calificatflebotomist de la fiecare participant între orele 8:30și la 10:30 la punctele de colectare, inclusiv GriffithUniversitate,Royal Brisbane și femei's Spitalul, Spitalul Robina, SunshineSpitalul Universitar Coast, Spitalul Calvary John James,

Spitalul Regal Melbourne, Australia. Analiza de rutină a sângelui completa fost efectuat în termen de patru ore de la recoltare pentru hematiinumărul de celule albe din sânge și numărul de granulocite pentru fiecareparticipant la Spitalul Universitar Gold Cost sau Royal MelbourneSpitalul, Australia.Probele au fost furnizate laboratorului și de-identificatefolosind uncod unic de către un colector de sânge independent. Sânge perifericcelulele mononucleare (PBMC) au fost izolate din 80 ml de întregsânge prin centrifugare pe un mediu cu gradient de densitate (FicollPaque Premium; GE Healthcare, Uppsala, Suedia) ca anteriordescris (34, 35). PBMC-urile au fost colorate cu albastru tripan(Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) pentru a determina numărul de celule șiviabilitatea celulei. PBMC-urile au fost ajustate la afificoncentraţia nal de5x107 celule/ml pentru izolarea celulelor NK.Celulele NK au fost izolate prin selecție imunomagnetică folosind unKit de izolare a celulelor NK umane negative EasySep (celule stemTechnologies, Vancouver, BC, Canada). Purificarea celulelor NK a fost determinat folosindflflow citometrie. Celulele NK au fost incubatetimp de 20 minute la temperatura camerei în prezenţa CD56FITC ({{0}},25µg/5µl) și CD3 PE Cy7 (0,25µg/20µl) monoclonalanticorpi (BD Bioscience, San Jose, CA, SUA) ca anteriordescris (10). 7-amino-actinomicină (7-AAD) (2,5 µl/test) (BDBioscience, San Jose, CA, SUA) a fost folosit pentru a determina celulaviabilitate. Celulele au fost spălate și resuspendate în 200ml detampon de colorare (BD Bioscience, New Jersey, SUA) și achiziționatla 10,000 evenimente folosind LSRFortessa X-20 (BD Biosciences,San Diego, CA, SUA). Folosind împrăștierea înainte și laterală,Populația de limfocite a fost închisă în timpul obținerii probei.Populația de celule NK a fost apoi identificatăca CD3− CD56la care se adaugacelule.

Înregistrare electrofiziologică a celulelor întregi

Înregistrările electrofiziologice au fost efectuate cu borosilicatelectrozi capilari din sticlă cu diametrul exterior de 1,5 mm și andiametru interior de 0.86 mm (Harvard Apparatus, Holliston, MA,STATELE UNITE ALE AMERICII). Rezistența la pipetă când este umplutăcu soluție cu pipetă a fost 8-12 MW. Pipetele au fost montate pe un head-stage CV203BU(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, SUA) conectat la o cale 3-manipulator grosier și un micro-manipulator (Narishige, Tokyo,Japonia). Semnalele electrice au fost amplificateși înregistrate folosind unAmplificator Axopatch 200Bși software-ul PClamp 10.7 (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, SUA). Datele au fost filtratela 5 kHz șieșantionat digital la 10 kHzprin intermediulo Digidata 1440A analog laconvertor digital (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, SUA). Theprotocolul de rampă de tensiune a fost un pas de la un potențial de menținere de plus 10mV la−90 mV, urmat de o rampă de 0,1 s la plus 110 mV, înainterevenind la plus 10 mV (repetat la fiecare 10 s). Joncțiunea lichidăpotențialul dintre soluțiile de pipetă și de baie (−10 mV) a fostcorectat. O componentă a curentului de scurgere nu a fost scăzutăcurentii inregistrati. Electrodul a fost umplutcu intracelularsoluție pipetă care conține 30 mM CsCI, 2 mM MgCl2, 110 mMAcid L-aspartic, EGTA 1 mM, HEPES 10 mM, ATP 4 mM,0.1 mM GTP, pH-ul ajustat la 7,2 cu CsOH și osmolalitatea

290 mOsm/L cu D-manitol. Soluția cu pipetă a fost filtrată folosind un 0.22mm filtru membranar(Sigma-Aldrich, St. Louise, MO,SUA), împărțit în alicote și depozitat la−20 de grade. Soluție de baieconținut: 130 mM NaCI, 10 mM CsCl, 1 mM MgCl2, 1,5 mMCaCl22H2O, 10 mM HEPES, pH-ul ajustat la 7,4 cu NaOH șiosmolalitate 300 mOsm/L cu D-glucoză. Toți reactivii au fostcumpărat de la Sigma-Aldrich, cu excepția ATP și GTP careau fost achiziționate de la Sapphire Bioscience. TRPM3 ioniccurenții de pe celulele NK au fost stimulați prin adăugarea a 100mM PregS(Tocris Bioscience, Bristol, Marea Britanie) la soluția de baie, întrucâtCurenții TRPM3 induși de PregS au fost blocați prin adăugarea a 10mM ononetin (Tocris Bioscience, Bristol, Marea Britanie). Pentru fiecare participant,Au fost realizate 10 înregistrări diferite. Prin urmare, N se referă la numărul departicipanții din fiecare grup (pacienți cu ME/CFS sau HC) și n, lanumărul de citiri sau dimensiunea eșantionului. Toate măsurătorile au fostefectuat la temperatura camerei. Autorii au eliminatposibilitatea implicării curentului de clorură în TRPM3evaluare prin utilizarea acidului L-aspartic în pipeta intracelularăsoluţie. Au fost excluse și celulele care au curenți instabilidin analiză.Analize statisticeAu fost identificate populații de limfocitede către colegutilizând citometrieîmprăștiere înainte și laterale grafice cu puncte. Puritatea CD3- CD56la care se adaugaau fost determinate limfocite. Datele de citometrie au fost exportate de laFacsDiva v8.1 și analizat folosind SPSS v24 (IBM Corp, Versiunea24, Armonk, NY, SUA) și GraphPad Prism v7 (GraphPadSoftware Inc., Versiunea 7, La Jolla, CA, SUA). Electrofiziologicdatele au fost analizate folosind software-ul pCLAMP 10.7 (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, SUA). Origin 2018 (OriginLabCorporation, Northampton, MA, SUA) și GraphPad Prismv7 (GraphPad Software Inc., Versiunea 7, La Jolla, CA, SUA) au fostutilizat pentru analiza statistică și prezentarea datelor. vizuale şiau fost folosite metode calculate pentru a determina normalitateadate independente.

Mai exact, diagramele histogramei șiS-au folosit testul de normalitate Shapiro-Wilk, asimetrie și curtozăpentru a determina distribuția datelor și normalitatea. Depindela normalitate, s-a efectuat o comparație statistică folosindtestul U Mann-Whitney neparametric independent sautest t parametric independent. Testul exact Fishers a fost obișnuitdetermina sensibilitatea celulelor NK la ononetină. Semnificaţiea fost setatla p<0.05 and="" the="" data="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" sem="" unless="">altfel spus.REZULTATECaracteristicile participantului șiParametrii de sângeAu fost incluși optsprezece participanți de vârstă și sexaceastă anchetă. Datele demografice pentru pacienți suntrezumat întabelul 1. Nu a fost semnificativdiferenta invârsta sau sexul dintre pacienții cu ME/SFC și HC. SF-36 șiSondajele WHODAS au fost utilizate pentru a determina starea de sănătate a participanțilorcalitatea vieții asociată (masa 2) (36, 37). 

Așa cum era de așteptat, a fost un semnificativdiferența dintre scorurile SF-36 și WHODASPacienții cu ME/SFC și HC. În plus, hemoleucograma completăparametrii au fost măsurați pentru fiecare participant sănătos șiPacienți cu ME/SFC (masa 2). În timp ce am raportat o semnificativă diferența pentru eozinofile între participanții sănătoși și ME/Pacienții cu CFS, toate rezultatele au fost în limitele specificatereferinţăvariază așa cum este oferit de Spitalul Universitar Gold CoastUnitatea de Patologie, laborator acreditat NATA. Fara importanta au fost raportate diferențe în alți parametri. În cele din urmă, ME/CFSpacienții au raportat îmbunătățiri ale tulburărilor de gândire,concentrare și supraîncărcare cognitivă precum și alte sisteme imunitaresimptome tulburări (dureri în gât, limfa mărită sau sensibilăganglioni și susceptibilitate la răceli/gripă) după tratament cuLDN (Tabelul 3), așa cum este descris mai înainte (27, 38). 

Puritatea celulelor ucigașe naturale

Celula NKpuritate (CD3- /CD56la care se adauga) a fost de 92,42 la sută ± 1,849 pentru HC și82,20 la sută ± 9,409 pentru pacienții cu ME/SFC care iau LDN așa cum s-a determinatdeflflow citometrie (Figura 1A). Nu a fost semnificativ diferența de puritate a celulelor NK la pacienții cu ME/CFS care iau LDNcomparativ cu HC (Figura 1B).

Activitatea canalului ionic TRPM3 DupăStimularea pregnenolonei în celulele NKDe la pacienții cu ME/SFC care iau LDNÎn comparație cu celulele NK din HC

Activitatea canalului ionic TRPM3 a fost înregistrată în NK uman izolatcelule de la pacienții cu ME/SFC care iau LDN (3.0–5.0 mg/zi) șicomparativ cu celulele NK umane izolate de la potrivire în funcție de vârstă și sexHC, folosind tehnica patch-clamp cu celule întregi.Funcția canalului ionic TRPM3 endogen a fost rapid șiactivat reversibil prin aplicarea lui 100mM PregS, asteroid neuronal. Stimularea cu măsurare activată PregSa unui mic curent de redresare exterior sub clemă de tensiunecondițiile și observarea unei forme tipice a curentului-tensiune TRPM3relatie (I–V) (Figura 2). Noi, prin urmare,a măsurat un curent ionic mic cu un TRPM{0}}obișnuitrectificare exterioarăîn celulele NK izolate din HC dupăadaos de PregS (Figurile 2A, B). Interesant, PregSaplicare în celulele NK de la pacienții cu ME/SFC care iau LDNa imitat creșterea indusă de PregS a celulelor NK din HC(Figurile 2C, D). Astfel, stimularea PregS a indus o creșterea rectificatului exterioramplitudini de curent în celulele NK dinPacienții cu ME/SFC care au LDN la același nivel cu celulele NK dinHC (Figura 2E). Mai mult, curenții evocați de PregS prezintă atipicI–V de TRPM3 (Figura 2D). Datele sugerează că ME/Pacienții cu CFS care iau LDN nu mai au o insuficiențăActivitatea canalului TRPM3 așa cum a fost raportată anterior (11–13), șiprin urmare, LDN poate avea un potențial beneficiu terapeuticpentrupatologia.

Modularea Curenților Evocați PregSCu Ononetin în celulele NK din ME/CFSPacienții care iau LDN în comparație cu NKCelulele din HC

Ca indus de PregS2 plus-influxși curenți ionici prin TRPM3canalele ionice pot fi inhibate eficient de un compus natural,deoxibezoin ononetin (39). Prin urmare, pentru a confirmacă TRPM3activitatea este implicată în curenții ionici evocați de PregS în celulele NK, noifolosit în continuare 10mM ononetin pentru modularea canalului ionic TRPM3activitate (Figura 3). După cum sa arătat anterior (11–13), cel ioniccurenţii evocaţi de aplicarea PregS au fost efectivinhibată de aplicarea simultană a nici unul în în izolatcelule NK din HC (Figurile 3A–C). Mai mult, celI–V decurenții sensibili la ononetină au fost rectificați în exteriorsi tipicpentru TRPM3 (Figura 3B). Interesant, curenții ionici evocațiprin aplicarea PregS au fost de asemenea inhibate eficient deaplicarea simultană a 10mM ononetin în NK izolatcelule de la pacienții cu ME/SFC care iau LDN (Figuri 3D–G). Într-adevăr, curentul ionic dependent de TRPM3-a fost anteriorraportat a fi rezistent la ononetină în celulele NK izolate dinPacienți cu ME/SFC (11–13). Cu toate acestea, celulele NK din ME/CFSpacienții care iau LDN sunt sensibili la ononetin în același intervalca celule NK din HC (Figura 3G). Mai mult, celI–V de ononetincurenții sensibili au fost rectificați în exteriorși tipic pentru TRPM3

(Figura 3E). In cele din urma,Figura 3Hraportează curentul TRPM3amplitudini după stimularea PregS și modularea ononetineiîn cadrul HC și ME/CFS luând grupuri LDN și numaiau fost incluse înregistrări sensibile la ononetin. Un semnificativ scăderea amplitudinii curentului TRPM3 a fost raportată dupămodularea cu ononetin atât la pacienții cu ME/SFC care iauGrupuri LDN (p=0.0336) și HC (p=0.0205). Acest grafic confirmăCanalul ionic TRPM3 funcționează similar în ME/CFSpacienții care iau LDN în comparație cu HC ca același curentsunt raportate intervalele de amplitudine (Figura 3H). În mod colectiv, acestearezultatele confirmăcă pacienții cu ME/SFC care iau LDN nu au unactivitatea canalului ionic TRPM3 afectată, care este raportată a ficaracteristica bolii (11–13). În concluzie, tratamentcu LDN permite restabilirea funcției canalului ionic TRPM3 în ME/pacienților cu CFS și are, prin urmare, un potențial efect terapeutic.

DISCUŢIE

În studiul de față, am folosit clema de plasture cu celule întregitehnică de măsurare a canalului ionic endogen TRPM3funcția în celulele NK de la pacienții cu ME/SFC care iau LDN. Noiraport pentru primatimpul pe care îl au pacienții cu ME/SFC care iau LDNa restabilit TRPM3-curenții ionici în celulele NK. Într-adevăr, celaplicarea PregS a permis măsurarea ionilor micicurenți cu un TRPM tipic3-cum ar fi rectificarea exterioarăîn NKcelule de la pacienții care iau LDN. În plus, PregS-a evocat ioniccurenții prin TRPM3 au fost semnificativmodulat deononetină în celulele NK de la pacienții cu ME/SFC care iau LDN cadescrise în mod similar în HC. Aceste rezultate reflectăconstatările noastre anterioareraportând o restabilire a funcției canalului ionic TRPM3in celulele NK de la pacientii ME/SFC dupain vitrotratament cuNTX (13). Aceste rezultate sunt, de asemenea, în concordanță cu cele anterioareinvestigațiile care sugerează ME/SFC pot fi considerate acanalopatie indusă de pierderea funcției TRPM3 șicaracterizată printr-o scădere a curenților ionici induși de PregSprecum și o rezistență la ononetină în celulele NK din ME/CFSpacienti (8–13). Pierderea funcției TRPM3 poate fi responsabilăpentru Ca afectat2 plussemnalizare şi Ca2 plus-functiile celulare mediate,inclusiv funcțiile imune ale celulelor NK (11–13). Studiul nostru actual este primul in vitrostudiu care confirmă eficacitateași beneficii terapeuticede LDN pentru pacienții cu ME/SFCprin caracterizarea mecanismelor de reglementare care stau la baza LDNtratament care implică TRPM3 și interacțiunea receptorilor opioiziîn celulele NK. LDN a fost raportat anterior ca fiind beneficpentrutratamentul unei varietăți de boli, cum ar fi scleroza multiplă,Crohn'boala s, fibromialgie, cancer, inflamatorintestinboala și ME/SFC (40–44). Mai exact, înstudiu preliminar realizat de Polo et al. asupra siguranţei şieficacitatea tratamentului LDN, 73,9 la suta dintre pacientii ME/CFSa raportat un răspuns pozitiv la tratament (27). Majoritatea paciențilora experimentat vigilență/vigilență îmbunătățită și fizic îmbunătățitși performanța cognitivă. Unii pacienți au raportat, de asemenea, mai puțină durereși febră, demonstrând că LDN poate prezenta un anumit potențialatenuează un spectru larg de simptome ME/SFC (27). În mod similar,Bolton și colab. a descris trei rapoarte de caz compilate de ME/CFSpacienții care au luat LDN și au raportat gama de răspunsuri,de la schimbarea vieții la reducerea doar a unor simptome (38).

Pe baza beneficiilorraportate de pacienți cu privire la simptomele lor,Tratamentul LDN poate fi utilizat ca tratament potențial și poatevizați patomecanismul ME/SFC.Patogenia ME/CFS este necunoscută, dar ion anormalcanale și mai precisfuncția TRPM3 afectată aua apărut recent ca o trăsătură caracteristică a bolii (8–13). Am raportat anterior pierderea funcției TRPM3 dupămodulare cu agonişti şi antagonişti TRPM3-putenţi în NKcelule din trei cohorte diferite de pacienți cu ME/SFC (11–13). TRPM3 a fost descris ca fiind un actor central al Ca2 plus- căi de semnalizare dependente, atât excitabile cât și neexcitabilecelule, unde Ca2 plussemnalele conduc diferitele celulareprocese (45). Papanikolaou et al, identificatTRPM3 ca uncomponentă importantă a'Ca2 plustrusa de instrumente' care stă la baza operate de magazinCa2 plusintrarea și sustenabilitatea Ca2 plussemnaland inSNC substanță albă glia (46). În mod similar, sa demonstrat că TRPM3 conducela o creștere de Ca2 plus afluxîn celulele beta pancreatice rezultând îneliberarea ulterioară de insulină (47). Fiecare tip de celulă prezintă un unicfenotip de semnalizare capabil să livreze strâns reglatspatiotemporal Ca2 plussemnale pentru a-și modula funcția particulară(48). În consecință, orice dereglare subtilă a Ca2 plussemnalele potinfluențează puternic funcțiile celulare și duc la boli (48, 49). Celulele NK necesită, de asemenea, Ca2 pluspentru eficientstimulare şifuncții inclusiv citotoxicitatea celulelor NK (50–53). CompromisFuncția citotoxică a celulelor NK este bine documentată și consecventăcaracteristica ME/CFS (54). Prin urmare, pierderea funcției TRPM3 poatecontribuie la simptomatologia ME/SFC prin afectareaCa2 plussemnalizare şi Ca2 plus-funcţiile celulare mediate, inclusiv NKfuncțiile imune celulare.O funcție bine caracterizată a TRPM3 în literatură este earol în detectarea căldurii nocive (durere acută), precum și a inflamațieihiperalgezie (durere acută și cronică) (14). Se sintetizează opioidele endogenein vivopentru a modularăspunsuri analgezice fiziologice în inflamatoriișidurere neuropatică. Opioidele endogene și exogene se leagă deRUP-urile, aflate la periferie, la presinaptic și postsinapticlocuri în cornul dorsal al măduvei spinării și în trunchiul cerebral,talamus și cortex, în ceea ce constituie durerea ascendentăsistem de transmisie (55). Studii recente au raportat căreceptorii opioizi sunt, de asemenea, exprimați de celulele imune pentru a efectuaanalgezie opioide mediată de celule imune prin producerea endogenăpeptide opioide, care implică Gai/o–Gbg–fosfolipaza C(PLC)–receptorul de inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3R)– intracelularCa2 pluscalea. Peptidele opioide eliberate se activează ulteriorreceptorii opioizi neuronali periferici și atenuează durerea (21). De asemenea, s-a demonstrat că opioidele modulează direct funcțiilelimfocitele şi alte celule implicate în apărarea gazdei şiimunitatea care duce la efecte imunosupresoare (56, 57). Mai exact, activarea OR de către alcaloizi opioizi șipeptide precum morfina și peptidele endogene,inclusiv beta-endorfina și peptidele dinorfină, conducând la ascăderea numărului de macrofage, scăderea leucocitelorproliferare și migrare către inflamatoriesite-uri, a scăzutactivitatea fagocitotică a macrofagelor, scăderea chimiotaxiei șiproducția de superoxid de către neutrofile și macrofage,apoptoza accelerată a macrofagelor, microbiologic slăbitprotecție și aderență redusă a leucocitelor și endoteliuluicelule (58). Au fost descrise și alte efecte negative înrelație cu mastocite, celule dendritice și celule NK cu areducerea citotoxicității celulelor NK și a producției de citokine (22, 56, 59, 60). Celulele imunitare, glia și neuronii formează, prin urmare, unrețea integrată care coordonează răspunsurile imune șimodulează excitabilitatea căilor durerii (61). Vizândreceptorii opioizi de pe celulele imune pot duce la modificări înrăspunsuri imune pentru a promova rezoluția inflflammaţie caprecum și modularea durerii la pacienții cu ME/SFC.Interesant este că moleculele care se leagă și activează opioidereceptori în mod semnificativreduce durerea3-dependentă de TRPM. Înrăspuns la activarea acută de către agonişti, receptori opioizicuplu la Gi/o proteine, care se disociază în Gai/o si Gbgsubunitățile să interacționeze cu efectorii intracelulari (62). TRPM3activitatea este puternic inhibată de activarea µOR prininteracțiunea directă cu Gbgca TRPM3-dependent de Ca2 plusintrările sunt puternic și reversibil inhibate atunci când celulamembrana esteflflushed cu purificat Gbg(15–18). NTX este o durată lungăîn special antagonist opioidinhibareamSAU, astfelnegând funcţia inhibitorie a acestui receptor opioid peTRPM3 (22, 26). În studiul nostru anterior, am raportat căin vitrotratamentul cu NTX restabilește canalul ionic TRPM3activitate în celulele NK izolate din ME/CFS (13). În mod similar, înstudiul curent, celulele NK izolate de la pacienții care iau LDN au făcut-onu prezintă nicio activitate alterată a canalului ionic TRPM3. LDNtratamentul la pacienții cu ME/SFC pare să restabilească ionul TRPM3funcția canalului în celulele NK, rezultând Ca2 plussemnaleremodelare pentru a contribui la refacerea integrităţiiși stabilitatea celulei NK specificesisteme de semnalizare (10–13). Interesant, s-a raportat că efectul de antagonism alNTX activatmSAU perturbă, de asemenea, regularea feedback-ului negativdSAU, crescând astfeldfuncția SAU.

ÎmbunătățireadSAUactivitatea promovează citotoxicitatea celulelor NK ca răspuns la beta-endorfine in vitrope splenocite de șobolan, sugerând potențialulutilizarea NTX în tratamentul deficienței imune (63). Mecanismul care stă la baza LDN'eficacitatea luipentru oboseală,Crohn'boala s, fibromialgie, și scleroza multiplă, prin urmare,implică blocarea intermitentă a receptorilor opioizi urmată deCa2 plus producția dependentăși upregularea endogeneopioide. Ludwig et al. a raportat că serul [Met5 ]-encefalinanivelurile au fost mai mici la oamenii cu scleroză multiplă comparativ cupacienții care nu suferă de scleroză multiplă și LDN și-au restabilit nivelurile.În mod similar, la șoarecii experimentali cu encefalomielita autoimună,[Întâlnit5 Nivelurile de ]-encefalină au fost scăzute înainte de aparițiede boală clinică și au fost restaurate cu tratament LDN(28). Prin urmare, se pare că tratamentul cu LDN are ca rezultatintensificarea efectelor analgezice și poate fi relevantă înME/CFS, acolo unde este insuficientsecreţia de peptide opioide afecteazărăspunsul imun sau controlul durerii (29, 30), sau eliberarea de proinflamatoriicitokine (25, 31). Într-adevăr, beta-endorfinele reduseconcentrația a fost raportată în ME/SFCpacienţii care suferă de dereglarea termoreglatoarerăspunsuri și durere generalizată severă sau de lungă durată (64). În concluzie, acest studiu pentru primatimp evaluat și identificatefectul LDN asupra funcției canalului ionic TRPM3 înCelulele NK la pacienții cu ME/SFC. Acest nou studiu raporteazărestaurarea de bază a canalului receptorului opioid TRPM3-interacțiunea în celulele NK de la pacienții cu ME/SFC care iau LDN.În plus, distribuția largă a canalelor ionice TRPM3 înorganismul sugerează că funcția lor compromisă poate contribui lasemne și simptome de ME/SFC și deci tratament cuLDN poate avea un rol terapeutic. În cele din urmă, acest studiu servește lasprijină planificarea și aprobarea prospectelor randomizatestudii clinice privind rolul și doza de NTX în tratarea ME/Pacienții cu CFS.