Semnificația predictivă a exprimării proteinei 8 legate de mieloide renale la pacienții cu boli renale asociate cu obezitate sau diabet zaharat de tip 2

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Takashige Kuwabara¹, Kiyoshi Mori1,^2*, Masato Kasahara^1,3, Hideki Yokoi¹, Hirotaka Imamaki¹, Akira Ishii¹, Kenichi Koga¹, Akira Sugawara⁴, Shinji Yasuno³, Kenji Ueshima³, Takashi Morikawa⁵, Yoshio Konishi⁵, Masahito Imanishi⁵, Akira Nishiyama⁶, Kazuwa Nakao^1,2, Masashi Mukoyama¹

¹Departamentul de Medicină și Științe Clinice, Facultatea de Medicină a Universității din Kyoto, Kyoto, Japonia,

²Centrul de inovare medicală, Universitatea din Kyoto, Școala de Medicină, Kyoto, Japonia,

³Departamentul de Cercetare EBM, Institutul pentru Avansarea Științei Clinice și Translaționale, Spitalul Universitar Kyoto, Kyoto, Japonia,

⁴Departamentul de Nefrologie, Spitalul Crucii Roșii Osaka, Osaka, Japonia,

5 Divizia de Nefrologie și Hipertensiune, Osaka City General Hospital, Osaka, Japonia,

6 Departamentul de Farmacologie, Facultatea de Medicină a Universității Kagawa, Kagawa, Japonia

Abstract

Context și obiectiv: Am raportat că receptorul toll-like 4 (TLR4) și unul dintre liganzii săi endogeni, proteina mieloidă 8 (MRP8 sau S100A8), joacă un rol important în progresia nefropatiei diabetice la șoareci. Scopul acestui studiu a fost de a evalua semnificațiarinichiExpresia MRP8 la pacienții cuobezitatea- sau asociat diabetului de tip 2boli de rinichi. Metode: La subiecții diabetici, obezi sau de control, nivelurile de expresie a mRNA și proteinei MRP8 din probele de biopsie renală au fost determinate prin RT-PCR în timp real și imunohistochimie (n=28 și, respectiv, 65) și asocierile lor cu valoarea inițială. iar parametrii de prognostic au fost analizați. Efectele MRP8 asupra expresiilor genelor proinflamatorii au fost examinate folosind macrofage. Rezultate:RinichiNivelurile de expresie a genei și proteinei MRP8 au fost crescute la grupurile obeze sau diabetice comparativ cu grupul de control. Dintre toți subiecții, prin analiza de regresie liniară univariată, numărul de celule pozitive MRP8-glomerulare și zona MRP tubulointerstițială8-pozitivă la momentul inițial au fost ambele corelate, respectiv, nu numai cu diverși factori de risc cunoscuți pentru nefropatia diabetică (cum ar fi precum tensiunea arterială sistolică, proteinuria și creatinina serică), dar și cu extinderea glomerulosclerozei și a fibrozei tubulointerstițiale. Factorii independenți care prezic nivelurile de proteine ​​urinare un an mai târziu au fost examinați prin analiză multivariată și au inclus numărul de celule glomerulare MRP8-pozitive (b=0,59, P,0,001), proteinurie (b=0.37, P=0}.002) și tensiunea arterială sistolică (b=0 .21, P=0}.04) la momentul inițial, după ajustarea pentru riscul cunoscut factori. Expresia proteinei MRP8 a fost observată în macrofagele CD68-pozitive și în tubii atrofici. În macrofagele de șoarece cultivate, expresiile de citokine proinflamatorii induse de proteina MRP8 au declanșat, de asemenea, auto-inducerea MRP8 într-un mod dependent de TLR4-.

Concluzii: Expresia glomerulară a MRP8 pare să fie asociată cu progresia proteinuriei la pacienții obezi sau diabetici de tip 2, posibil prin inducerea unor modificări inflamatorii la macrofage prin semnalizarea TLR4.

Efectele cistanche: tratarea bolilor de rinichi

Introducere

Inflamația cronică joacă un rol important în patogeneza diabetului sauobezitateași complicațiile sale cardiovasculare [1]. A fost implicată implicarea receptorilor imuni înnăscuți și a liganzilor endogeni în procesul de inflamație cronică. Proteina 8 asociată mieloidului (MRP8, cunoscută și sub numele de S100A8 sau calgranulin A) a fost inițial identificată ca o proteină citoplasmatică care leagă calciul în neutrofile și monocite [2] și a devenit recunoscută pe scară largă ca un ligand endogen puternic pentru receptorul toll-like 4 (TLR4). ) în diverse boli, inclusiv șoc septic, tulburări vasculare și autoimune [3,4,5]. Am propus recent că semnalizarea MRP8/TLR4 joacă un rol important în progresia nefropatiei diabetice indusă de hiperlipidemie [6]. Macrofagele glomerulare și celulele ductului colector sunt surse majore de MRP8 în modelele de șoarece de nefropatie diabetică[6] și, respectiv, fibroză renală [7]. Nivelurile plasmatice ale MRP8, care formează de obicei un complex heterodimeric cu un partener de legare MRP14 în fluxul sanguin, sunt crescute la subiecții obezi [8,9]. Cu toate acestea, nu au existat rapoarte care să investigheze expresia renală a MRP8 la pacienții cu obezitate sautip2 diabetși asocierea acesteia cu prognosticul renal.

Scopul acestui studiu a fost de a determina ARNm și nivelurile de exprimare a proteinei ale MRP8 înrinichia pacienților japonezi cu nefropatie diabetică (DN),obezitatea-glomerulopatia asociată (ORG), sindromul nefrotic cu modificări minime (MCNS) sau anomalia glomerulară minoră (MGA), care au fost toate diagnosticate prin biopsie renală și pentru a evalua dacă expresia renală a MRP8 poate prezice rezultatele renale.

Cistanche poate îmbunătăți funcția rinichilor

Materiale și metode

Declarație de etică

Studiul uman a fost realizat conform principiilor exprimate în Declarația de la Helsinki și a fost aprobat de comitetele etice pentru cercetare umană ale Școlii de Medicină a Universității din Kyoto și, respectiv, Spitalul General al orașului Osaka. Toți participanții și-au dat consimțământul informat în scris. Protocolul de studiu pe animale a fost aprobat de Comitetul de Cercetare pe Animale al Școlii Absolvente de Medicină a Universității din Kyoto (Număr permis: Med Kyo 13318). Toate intervențiile chirurgicale la animale au fost efectuate sub anestezie cu pentobarbital de sodiu și s-au făcut toate eforturile pentru a minimiza suferința.

Subiecte de studiu

Pacienții cu proteine ​​​​cuobezitateasau diabet de tip 2 care au suferit biopsie renală au fost înrolați în acest studiu. Pacienții cu boli infecțioase, cancer, boli hepatice sau boli de colagen au fost excluși. Proteinuria a fost definită ca proteină urinară mai mare de 0.5 g/g creatinina sau albumină urinară mai mare de 300 mg/g creatinina în cel puțin două măsurători consecutive.Obezitateaa fost definit ca un indice de masă corporală (IMC) mai mare de 25.0 (kg/m²). Diabetul de tip 2 a fost diagnosticat în conformitate cu criteriile Organizației Mondiale a Sănătății. Măsurătorile biochimice la internare pentru biopsie renală au fost utilizate ca caracteristici de bază pentru analiza transversală. Rata de filtrare glomerulară estimată (eGFR) a fost calculată utilizând o ecuație de predicție simplificată propusă de Societatea Japoneză de Nefrologie: eGFR (ml/min/1,73 m)²)=1946 [vârsta (ani)]20.287 6 [creatinina serică (mg perdl)]21.094 60.739 (pentru femei), care este o modificare locală validată a MDRD [ 10]. Concentrațiile plasmatice ale creatininei au fost măsurate folosind o metodă enzimatică.

Pentru imunohistochimie, au fost analizați 65 de pacienți japonezi cărora li s-a efectuat biopsie renală la Departamentul de Medicină și Științe Clinice, Spitalul Universitar Kyoto între 2000 și 2011. Diagnosticele dovedite prin biopsie ale tuturor pacienților în această perioadă sunt enumerate în Tabelul S1 din Fișierul S1. Subiecții examinați în această lucrare au inclus DN (n=19), ORG (n=10) și subiecți de control non-obezi și non-diabetici care au fost diagnosticați ca MGA (n=19) sau MCNS (n=17). Unele cazuri din aceste categorii au fost excluse deoarece probele reziduale disponibile au conținut mai puțin de 10 glomeruli. Definiția DN a constat în (1) o durată mai mare de 5 ani de la debutul diabetului, (2) existența micro- sau macro-albuminuriei, (3) modificări histopatologice compatibile cu DN precum îngroșarea membranei bazale glomerulare, expansiunea mezangială, nodulară. scleroza (noduli Kimmelstiel-Wilson) și/sau hialinoza arteriolară și (4) excluderea altor cauze de tulburări renale [11]. ORG a fost definită morfologic ca glomeruloscleroză segmentară focală și/sau glomerulomegalie la subiecții cu ambeleobezitateași proteinurie, ale căror definiții au fost descrise mai sus [12,13].

Pentru analiza expresiei ARNm, au fost excluse probe de calitate scăzută, în care nivelurile de ARN ribozomal (rARN) 18S au fost mai mici decât limita de sensibilitate de detecție prin RT-PCR în timp real. Subiecții înrolați au constat din 22 de pacienți cu diabet zaharat de tip 2 cărora li s-au efectuat biopsie renală la Spitalul General din Osaka City între 2000 și 2010 și 6 subiecți de control non-diabetici, cărora li s-au efectuat biopsii dovedite.

Tabelele 1 și 2 rezumă caracteristicile clinice de bază ale pacienților care au fost examinați prin analiza imunohistochimică sau, respectiv, a expresiei genice. Pentru microscopia cu lumină, mostrele de țesut au fost prelucrate conform procedurilor standard. Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină-eozină, acid periodic Schiff, argint metanamină acid periodic sau tricrom Masson (Fig. S1). Raporturile dintre numărul de glomeruli cu scleroză globală între cel al glomeruli total și zonele relative de fibroză tubulointerstițială au fost evaluate independent de doi patologi care nu cunosc diagnosticul și datele clinice.

Efectele cistanche: tratarea bolilor de rinichi

Definiția renal outcomes

Următorii doi indicatori de prognostic au fost examinați prin regresie liniară și, respectiv, analize de regresie logistică: (1) extinderea proteinuriei măsurată la un an după biopsie și (2) eveniment renal definit ca creșterea anuală a creatininei serice cu 0,50% de la momentul inițial sau inițierea dializei cronice.

Imunohistochimie

Imunohistochimia MRP8 și CD68 a fost efectuată folosindrinichisecțiuni (grosime 4 mm) fixate cu 4 procente de paraformaldehidă tamponată. După extragerea antigenului prin tampon citrat, secțiunile de rinichi au fost incubate cu ser de capră 10%, urmate de MRP8 anti-uman de șoarece (1:100; BMA biomedicals, Augst, Elveția)[14] sau anticorpi CD68 anti-uman de șoarece (1:50). ; DAKO, Ely, Marea Britanie), respectiv. Anticorpii primari au fost vizualizați cu anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean și tetraclorhidrat de 33-diaminobenzidină (Dako USA, Carpinteria, CA). Nucleii au fost contracolorați cu hematoxilină. Celulele pozitive MRP8-au fost numărate în mai mult de 10 glomeruli, iar zona MRP8-pozitivă din tubulointerstitium a fost măsurată cantitativ pentru a obține o medie pentru fiecare subiect folosind software-ul MetaMorph 7.5 (Molecular Devices, Downingtown, PA, SUA ). Colocalizarea celulelor CD68- și MRP8-pozitive a fost evaluată cu secțiuni în serie. Nu a existat nici semnal MRP8, nici CD68 în controalele negative colorate fără primul anticorp (Fig. S2). Prin preincubarea anticorpului anti-MRP8 cu 20 molar în exces de proteină MRP8 umană recombinantă (Life Technologies, Carlsbad, CA, SUA) la 4uC peste noapte, colorarea a fost redusă semnificativ, dacă nu complet, susținând în continuare specificitatea anticorpului (Fig. S3) .

Cistanche pentru tratarea rinichilor

Evaluarea expresiei ARNm

Îngheţatrinichisecțiunile au fost separate în țesuturi glomerulare și nonglomerulare prin micro-disecție cu captură cu laser (LM200; Olympus, Tokyo, Japonia) așa cum a fost descris anterior [15]. ARN-ul total a fost extras cu mini kit RNeasy (Qiagen, Tokyo, Japonia). Nivelurile de expresie a ARNm au fost determinate prin PCR în timp real TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) [16,17]. Nivelurile de expresie ale tuturor genelor au fost normalizate prin niveluri de ARNr 18S (control intern). Consultați Tabelul S2 din Fișierul S1 pentru secvențele de primer și sondă. ARNr-ul eucariotic 18S a fost detectat cu reactivi de testare TaqMan predezvoltați (Applied Biosystems).

Tabelul 1. Caracteristicile clinice inițiale ale pacienților la biopsie renală care au fost analizați pentru exprimarea proteinei MRP8 prin imunohistochimie.

MGA: anomalie glomerulară minoră, MCNS: sindrom nefrotic cu modificări minime, ORG:obezitatea-glomerulopatie asociată, DN: nefropatie diabetică, IMC: indice de masă corporală, BUN: azot ureic din sânge, CRP: proteină C-reactivă. Datele sunt mijloace 6 SD. * Diferențele generale între grupurile MGA, MCNS, ORG și DN au fost comparate prin ANOVA.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t001

Tratamentul MRP8 al macrofagelor

Macrofagele derivate din măduva osoasă au fost generate de la șoareci de tip sălbatic sau TLR4 knockout (KO) [18] pe fundal genetic C57BL/6J (Oriental BioService, Kyoto, Japonia), așa cum a fost descris anterior [6]. Pe scurt, după liza celulelor roșii din sânge, celulele măduvei osoase au fost resuspendate într-un mediu care conținea 20% ser fetal de vițel și 50 ng/ml factor recombinant de stimulare a coloniilor de macrofage umane (Peprotech, Rocky Hill, NJ, SUA) și cultivate la 37uC în atmosferă de 5% CO2. În ziua 7, macrofagele au fost incubate cu MRP8 de șoarece recombinant (Abnova, Taipei, Taiwan) sau vehicul timp de 4 ore. Polimixină B (25 mg/ml, NacalaiTesque, Kyoto, Japonia) a fost adăugată în fiecare godeu pentru a minimiza contaminarea endotoxinei așa cum s-a descris anterior [3,19]. Noendotoxina a fost detectată la orice concentrație de MRP8 testată în continuare cu incubare cu 25 mg/ml de polimixină B de către ToxinSensorChromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (GenScript, Piscataway, NJ, SUA). ARN-ul total din celule a fost extras cu RNeasy MiniKit, iar nivelurile de expresie ARNm ale interleukinei-1 beta (IL{-1b), factorului de necroză tumorală-alfa (TNFa) și MRP8 au fost determinate de TaqMan în timp real RT-PCR. Nivelurile de expresie ale tuturor genelor au fost normalizate prin nivelurile GAPDH de rozătoare (control intern, reactivi de testare TaqMan pre-dezvoltați). Secvențele de primer și sondă pentru PCR în timp real sunt enumerate în tabelul S2 din fișierul S1.

analize statistice

Datele sunt exprimate ca medii 6 SD sau înseamnă 695 la sută interval de încredere (CI), atunci când este cazul. Pentru compararea între patru grupuri, s-a folosit ANOVA unidirecțional sau bidirecțional cu analiza post-hoc a lui Bonferroni, iar variabilele categoriale au fost comparate folosind testul x2. Testul t nepereche al elevului a fost aplicat pentru compararea între două grupuri, după caz. Coeficienții de corelație Spearman au fost estimați pentru a determina asocieri între două variabile. Pentru a examina efectele covariatelor inițiale care determină gradul de expresie glomerulară sau tubulointerstițială a MRP8 sau nivelurile de proteine ​​urinare la un an după biopsie, au fost efectuate analize de regresie liniară univariată și multivariată. Analiza de regresie logistică a fost utilizată pentru a analiza variabilele explicative care prezic apariția evenimentelor renale. Toate datele au fost analizate folosind software-ul StatView 5.0 (SAS InstituteInc., Cary, NC, SUA). Valorile P,0,05 au fost considerate semnificative din punct de vedere statistic.

Efectele cistanche: tratarea bolilor de rinichi

Rezultate

Am comparat nivelurile de expresie a proteinei MRP8 înrinichiprintre grupurile DN, ORG și non-obeze, non-diabetice de control (MGA și SNC). Analiza imunohistochimică a arătat că atât numărul de celule glomerulare MRP8-pozitive (Fig. 1A) cât și zona MRP8- tubulointerstițială pozitivă (Fig. 1B) în DN au fost semnificativ mai mari decât cele din alte grupuri, inclusiv MGA, MCNS, și ORG (P<0.01). org="" subjects="" also="" showed="" a="" tendency="" of="" elevated="" mrp8expression="" compared="" to="" mga="" and="" mcns="" (fig.="" 1a,="" 1b).="" furthermore,="" glomerular="" mrp8="" mrna="" expression="" levels="" in="" dn="" subjects="" were="" significantly="" higher="" compared="" to="" non-dm="" control="" subjects="" (p,0.01,="" fig.="" 1c).="" in="" non-glomerulus="" tissues,="" mrp8mrna="" expression="" levels="" were="" much="" lower="" than="" those="" in="" glomeruli,="" both="" in="" non-dm="" and="" dm="" groups.="" abundant="" mrp8="" protein="" expression="" in="" the="" tubulointerstitium="" of="" dn="" cases="" was="" not="" clearly="" reflected="" into="" increased="" mrna="" expression,="" which="" may="" be="" partly="" caused="" by="" deposition="" of="" blood-derived="" proteins="" in="" the="" tubulointerstitium="" as="" discussed="" in="" the="" next="" section.="" as="" shown="" in="" representative="" photos="" (fig.="" 1d–g,="" see="" fig.="" s4="" in="" detail),="" renal="" biopsy="" samples="" from="" mga="" and="" mcns="" subjects="" showed="" few="" mrp8-positive="" cells="" in="" glomeruli="" (fig.="" 1d,="" 1e="" and="" fig.="" s4).="" in="" org="" subjects,="" somemrp8-positive="" cells="" appeared="" in="" glomeruli="" and="" tubulointerstitium(fig.="" 1f="" and="" fig.="" s4).="" in="" dn="" subjects,="" a="" marked="" increase="" of="" mrp8-expressing="" cells="" in="" glomeruli="" and="" significant="" expansion="" of="" mrp8-positive="" areas="" in="" the="" tubulointerstitium="" were="" observed="" in="" a="" focal="" manner="" (fig.="" 1g="" and="" fig.="" s4).="" of="" note,="" mrp8-positive="" cells="" were="" absent="" in="" nodular="" sclerosing="" lesions="" of="" diabetic="" glomeruli="" (fig.="" s4:dn="" case="" 2,="" 3)="" as="" described="" previously="" for="" sclerotic="" lesions="" in="" anca-associated="" glomerulonephritis="" [20].="" paired="" immunohistochemistry="" for="" cd68="" and="" mrp8="" in="" serial="" sections="" suggested="" thatmrp8="" signals="" were,="" at="" least="" in="" part,="" observed="" in="" macrophages="" expressing="" cd68="" (fig.="" 2),="" as="" we="" reported="" in="" a="" mouse="" model="" of="" diabetic="" nephropathy="" [6].="" besides,="" focally="" injured="" atrophic="" tubular="" epithelial="" cells="" also="" strongly="" expressed="" mrp8,="" which="" were="" surrounded="" by="" mrp8(+)-,="" cd68(+)-positive="" macrophages="" (fig.="" 2,="" fig="" s4:="" dn="" case="" 3-5).="" in="" the="" cases="" with="" nephrotic="" range="" proteinuria,="" mrp8="" staining="" was="" also="" observed="" along="" brush="" borders="" of="" proximal="" tubules="" both="" in="" mcns="" and="" dn="" cases="" (fig.="" s4).="" since="" the="" sample="" number="" of="" mrna="" expression="" was="" too="" small="" for="" multivariate="" analysis,="" the="" following="" analyses="" were="" performed="" using="" data="" from="" patients="" studied="" by="">

Tabelul 2. Caracteristicile clinice inițiale ale pacienților la biopsie renală care au fost analizați pentru expresia ARNm MRP8 prin RT-PCR în timp real.

Asociaţiile dintrerinichiSemnalele MRP8 și parametrii clinici de bază în momentul biopsiei renale au fost analizate transversal (Tabelul 3). Prin analiza univariată, expresia proteinei MRP8 glomerulară și/sau tubulointerstițială a fost corelată semnificativ cu vârsta, tensiunea arterială sistolica și diastolică, proteina urinară, nivelurile serice ale creatininei, colesterolul BUN și HDL, eGFR și gradul glomerulosclerozei globale și fibrozei tubulointerstițiale. Acești parametri au fost examinați în continuare prin analiză multivariată după excluderea tensiunii arteriale diastolice, eGFR și BUN din cauza coliniarității. Procentul de fibroză tubulointerstițială a fost corelat independent cu semnalele glomerulareMRP8 (b=0.62, P ajustat=0.{02) și semnalele tubulointerstitialMRP8 (b=0.85, P ajustat ,0,001), respectiv. În plus, semnalele tubulointerstițiale MRP8 au fost, de asemenea, corelate independent cu proteinuria inițială (b=0.20, P ajustat {= 0.01). Analizele grafice dispersate între semnalele MRP8 în glomeruli sau tubulointerstitiu și parametrii clinici au indicat că MCNSgroup a avut un model de distribuție distinct față de alte grupuri, în special în ceea ce privește proteinele urinare și nivelurile serice ale colesterolului LDL (Fig. S5A-D, S6A-D). Excluderea grupului MCNS a îmbunătățit corelația dintre semnalele MRP8 și proteinele urinare sau nivelurile serice de LDL-colesterol (Fig. S5E-F, S6E-F). Prin urmare, am efectuat o subanaliză excluzând pacienții cu MCNS și am constatat că proteina urinară a fost un factor independent corelat cu semnalele glomerulareMRP8 prin analiză multivariată (Tabelul 4; b=0.36, P=0.03 ajustat ).

Apoi, am efectuat analize de regresie liniară sau de regresie logistică pentru a identifica factorii explicativi care prezic rezultatele renale, care au fost amploarea proteinuriei un an mai târziu și evenimentul renal într-un an. Deoarece a existat o asociere bună între semnalele MRP8 glomerulare și tubulointerstițiale (Fig. S7; R=0.67,P,0.001), acești parametri au fost înrolați alternativ în analize ulterioare . Am evaluat asocierea dintre parametrii de referință și proteina urinară la 1 an după biopsia renală prin analiză de regresie multiplă. După cum se arată în tabelul 5, semnalul glomerular MRP8 (b=0.59, P ajustat, 0,001) a fost un factor predictiv pentru extinderea proteinuriei un an mai târziu, precum și pentru tensiunea arterială sistolică inițială (b {{13} }.21, P ajustat=0.04) și proteinuria inițială (b=0.37, P ajustat {= 0}.002) au fost. Acești parametri au fost independenți de alți factori de risc cunoscuți ai nefropatiei diabetice, inclusiv disfuncția renală (creatinina serică) și gradul de scleroză globală și fibroza tubulointerstițială [11,21–24]. Pe de altă parte, semnalul tubulointerstițial MRP8 (b=0.34, ajustat P=0.09) nu a fost un factor predictiv independent pentru nivelurile de proteine ​​urinare un an mai târziu. Evenimentele renale au apărut la 7 pacienți (6 în DN și 1 în cazurile ORG) în decurs de un an după biopsia renală. Prin analiza univariată, nu numai amploarea glomerulosclerozei și a fibrozei tubulointerstițiale și a semnalelor MRP8 glomerulare și tubulointerstițiale, dar și tensiunea arterială, disfuncția renală și nivelurile de proteine ​​urinare la momentul inițial au fost factori predictivi semnificativi pentru apariția evenimentelor renale. Cu toate acestea, prin analiza multivariată, covariatele lor au fost anulate unele de altele (Tabelul S3 din fișierul S1), probabil din cauza corelațiilor mari dintre acești parametri.

În cele din urmă, am examinat potența MRP8 ca ligand endogen pentru TLR4 utilizând macrofage cultivate. La macrofagele derivate din măduva osoasă de la șoareci de tip sălbatic, proteina MRP8 a indus reglarea în sus a genelor de citokine proinflamatorii, cum ar fi IL-1b și TNFa și, de asemenea, a declanșat auto-inducerea MRP8, într-o manieră dependentă de doză între 1{{{ 15}}–1000 ng/ml. Aceste efecte ale MRP8 au fost suprimate cu aproximativ două treimi în macrofagele obținute de la șoareci TLR4 KO (P, 0,01) (Fig. 3).

Figura 1. Analize imunohistochimice și ARNm pentru MRP8 înrinichiprobe de biopsie. Cuantificarea MRP{{0}}numărului de celule pozitive glomerulare (A) și a zonei pozitive MRP{8-tubulointerstițiale (B). Expresia ARNm a MRP8 în fracțiile glomerulare și neglomerulare (C). Bare deschise: controale non-obeze, non-diabetice care sunt MGA sau MCNS, bare închise: ORG sau DN (A–C). Imagini reprezentative ale grupurilor MGA, MCNS, ORG și DN (D–G). MGA: anomalie glomerulară minoră, MCNS: sindrom nefrotic cu modificări minime, ORG: glomerulopatie legată de obezitate, DN: nefropatie diabetică. *P,0.01.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g001

Discuţie

Studiul de față a demonstrat că MRP8 este exprimat abundent în glomeruli și tubulointerstitiul pacienților cu ADN în comparație cu ORG și controlul non-obez, non-diabetic (MGA și MCNS). În plus, la subiecții ORG, nivelurile de expresie MRP8 au avut tendința de a fi mai mari decât subiecții MGA sau MCNS. În investigația transversală inițială, incluzând toți subiecții, prin analiza de regresie liniară univariată, numărul de celule pozitive MRP8-glomerulare și zona MRP8-pozitivă tubulointerstițială au fost ambele corelate nu numai cu diverși factori de risc cunoscuți pentru nefropatia diabetică (cum ar fi tensiunea arterială sistolică, proteinuria și creatinina serică), dar și cu extinderea glomerulosclerozei și a fibrozei tubulointerstițiale. Prin analiza multivariată, zona tubulointerstițială MRP8-pozitivă a fost corelată semnificativ cu proteinuria și fibroza tubulointerstițială. Numărul de celule glomerulare MRP8-pozitive a fost corelat semnificativ cu fibroza tubulointerstițială în analiza primară și cu proteinuria într-o subanaliză, excluzând grupul MCNS. Imunohistochimia a indicat că MRP8 a fost exprimat, cel puțin parțial, de către macrofagele care exprimă CD68(plus) și tubulii atrofici. Aceste constatări ridică posibilitatea carinichiSemnalele MRP8 în glomeruli sau tubulointerstitium pot servi ca noi markeri ai nefropatiei diabetice.

Figura 2. Localizarea exprimării proteinei CD68 și MRP8 în secțiuni seriale ale cazurilor de nefropatie diabetică. Exprimarea exprimării CD68 (A, B) și MRP8 (C, D) în specimene renale pereche (A și C, sau B și D). Săgețile indică colocalizarea semnalelor CD68 și MRP8.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g002

În studiul de prognostic, analiza multivariată a arătat că nivelurile de proteine ​​urinare la un an după biopsia renală au fost asociate independent cu numărul de celule glomerulare MRP8-pozitive, proteinele urinare și tensiunea arterială sistolica la momentul inițial. De notat, expresia glomerulară MRP8 a arătat cea mai puternică corelație cu proteina urinară un an mai târziu (b= 0.87), chiar mai puternică decât proteina urinară inițială (b=0}.78), prin analiza univariată. Parțial, se datorează faptului că expresia glomerulară a MRP8 nu este în mare măsură crescută în formele „benigne” de proteinurie, cum ar fi cele observate la pacienții cu MCNS, ale căror niveluri de proteinurie sunt extrem de ridicate la diagnosticul prin biopsie renală, dar sunt de obicei rezolvate în decurs de un an de la inițierea terapiei imunosupresoare. Aceste descoperiri sugerează că expresia glomerulară a MRP8 poate avea o natură predictivă unică ca marker al bolii, care nu poate fi înlocuită cu proteinurie de bază sau analize patologice de rutină care evaluează glomeruloscleroza globală și fibroza tubulointerstițială. Mai mult, speculăm că expresia glomerulară MRP8 nu este un simplu marker sau spectator, ci un jucător activ în leziunea glomerulară, așa cum se discută mai jos.

Coeficientul de determinare (R2) calculat cu parametrii explicativi înscriși în analiza de regresie multiplă a fost 0,52* și, respectiv, 0,74#. y, ani; TA, tensiunea arterială; gCr, g creatinină; T-chol, colesterol total; HDL-Chol, HDL colesterol; LDL-col, colesterol LDL; GS, glomeruloscleroza; TI, tubulointerstitial.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t003

Tabelul 4. Subanaliză a relației dintre parametrii clinici de bază și semnalele MRP8, după excluderea grupului MCNS.

Tabelul 5. Analiza de regresie multiplă pentru identificarea factorilor care prezic nivelurile de proteine ​​urinare la 1 an după biopsia renală

Figura 3. Efectele MRP8 asupra macrofagelor derivate din măduva osoasă. Macrofagele derivate din măduva osoasă (BMDM) au fost stimulate cu MRP8 de șoarece recombinant timp de 4 ore. Barele de eroare indică 95% CI și analizele statistice au fost efectuate cu valori transformate în log. ANOVA bidirecțională a evidențiat efecte semnificative ale genotipurilor, concentrațiilor MRP8 și interacțiunilor acestora pentru exprimarea tuturor celor 3 gene (P,0.001 pentru toate comparațiile). n=4. WT, de tip sălbatic; KO, knockout; IL-1b, interleukina 1 beta; TNFa, factor de necroză tumorală-alfa. *P,0.01 printre diferite concentrații, #P,0.01 printre genotipuri.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g003

Într-o altă încercare a unui studiu longitudinal, analiza de regresie logistică nu a reușit să afle niciun predictor independent pentru apariția unui eveniment renal în decurs de un an. Speculăm că acest lucru se datorează parțial pentru că expresia tubulointerstițială MRP8 și fibroza tubulointerstițială au fost doi predictori potenți ai evenimentului renal în analiza univariată, dar semnificațiile lor au fost anulate una de cealaltă în analiza multivariată. Acești doi parametri au arătat o corelație puternică (R=0.68, P,0.001) (Fig. S8), sugerând că acești doi parametri ar putea fi echivalenti cu prezicerea evenimentelor renale. Într-adevăr, expresia interstițială MRP8 a arătat un model destul de similar cu fibroza interstițială evaluată prin colorarea tricrom Masson. Cantitatea de MRP8 interstițial depinde în mare măsură de semnalele pozitive din tubii atrofici, mai degrabă decât de cele din macrofage, a căror caracteristică diferă de cea a MRP8 glomerulară într-o distribuție punctată. În plus, o dimensiune mică a eșantionului, o perioadă scurtă de observație și puțini subiecți care au dezvoltat evenimente renale ar fi putut reduce puterea de detectare. Deoarece expresia MRP8 în celulele epiteliale tubulare joacă un rol cauzal în progresia inflamației tubulointerstițiale într-un model de șoarece de fibroză renală[7], vor fi necesare analize suplimentare pentru a clarifica rolul MRP8 tubulointerstițial în DN.

În conformitate cu studiul nostru anterior [6], ARNm MRP8 a fost suprareglat predominant în fracția glomerulară a subiecților DN umani, în comparație cu subiecții de control cu ​​MGA. Pe de altă parte, expresia proteinei MRP8 a fost observată nu numai în glomerul, ci și în tubulointerstitium. În acest sens, trebuie remarcat faptul că au existat două modele distincte de colorare MRP8 în tubulointerstitiul DN. Una a fost colorarea intensă și focală în tubii sever atrofici. Cealaltă a fost o colorare ușoară distribuită de-a lungul marginii periei a tubilor proximali, care a fost găsită și în ORG și MCNS. Aceste din urmă semnale reprezintă probabil proteina MRP8 derivată din sânge și reabsorbită de tubulii proximali, care nu ar trebui să fie însoțită de o expresie crescută a ARNm MRP8. În ceea ce privește alte proteine ​​decât MRP8, noi și alții am raportat recent fenomene similare de detectare a proteinelor imunoreactive în tubii proximali cauzate de reabsorbție, dar nu de sinteza renală [25,26]. Pe de altă parte, din moment ce puțină colorare cu MRP8 a rămas în testul de absorbție a anticorpilor, în special în leziunile glomerulare exsudative și leziunile fibrotice sever cicatrice în jurul tubilor atrofici, prezența semnalelor nespecifice nu poate fi complet anulată (Fig. S3).

Semnalele glomerulare MRP8 au arătat în principal modele punctuate la subiecții DN (Fig. 1, Fig. S4). Deoarece ambele CD68 și MRP8 au fost detectate de anticorpi monoclonali de șoarece, localizarea acestor molecule a fost evaluată prin secțiuni în serie, nu prin imunocolorare dublă. Modelele de colorare ale MRP8 au fost compatibile cu cele din alte tulburări inflamatorii renale, inclusiv IgAnefrita [27], glomerulonefrita membranoproliferativă [14] și glomerulonefrita asociată ANCA [20], în care macrofagele au fost sugerate ca o sursă majoră de MRP8, așa cum am raportat în un model de rozătoare [6]. În plus, neutrofilele ar putea fi considerate ca o altă sursă de MRP8 care afectează complicațiile vasculare [28]. În prezent, investigăm mecanismul molecular pentru care MRP8 este predominant suprareglat în celulele mieloide care infiltrează glomeruli. Studiul in vitro a arătat că MRP8 a indus expresia inflamatorie a citokinelor și, de asemenea, a potențat expresia MRP8 în sine în macrofage într-un mod dependent de TLR4-. În plus, celulele MRP8-pozitive au fost absente în leziunile sclerozante nodulare, ceea ce sugerează că MRP8 glomerular ar putea reflecta leziuni glomerulare în curs [20]. Foarte important, un studiu uman la scară largă a raportat că expresia genei MRP8 în celulele mononucleare din sânge ale pacienților cu diabet zaharat de tip 1 este semnificativ crescută la subiecții cu complicații diabetice, inclusiv nefropatie [29].

Deoarece inhibarea sistemului renină-angiotensină (RAS) este un determinant important al rezultatelor renale, am examinat efectele blocării RAS asuprarinichiExpresia MRP8. Nu am găsit nicio diferență semnificativă în expresia ARNm MRP8 renală între pacienții cu DN tratați cu sau fără blocaj RAS (Fig. S9), probabil pentru că cazurile tratate cu blocare RAS au avut tendința de a avea hipertensiune arterială și proteinurie mai severă decât cazurile fără blocare RAS.

La oamenii obezi și la șoareci, complexul MRP8/14 plasmatic crescut poate reflecta un grad deobezitateași provin din adipocite, precum și din leucocite [8,9]. Cazurile noastre ORG au avut o colorare ușoară a MRP8 în tubii proximali, ceea ce sugerează niveluri plasmatice crescute de MRP8. În schimb, nu a existat o corelație semnificativă între expresia tubulointerstițială MRP8 și indicele de masă corporală (Fig. S6G). Prin urmare, expresia locală MRP8 înrinichipoate servi mai bine ca marker pentru leziunea renală decât pentruobezitatea[8,9].

Cistanche pentru ameliorarea disfuncției renale

Studiul nostru are mai multe limitări. Numărul de eșantion al fiecărui grup studiat a fost mic. Subiecții non-identici au fost înrolați în ARNm și analizele imunohistochimice. Deoarece am analizat doar pacienții cărora li s-a efectuat biopsie renală, este posibil ca compoziția pacienților investigați aici să nu le reflecte pe cei de la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 general sau în general cronici.rinichisubiecti de boala. Deși vârsta nu a fost reținută ca un factor independent asociat cu semnalele MRP8 în datele noastre (Tabelul 3), se știe că îmbătrânirea asociată cu inflamația cronică [30]. Efectele vârstei nu pot fi complet neglijate. Deși majoritatea semnalelor MRP8 s-au pierdut în testul de absorbție a anticorpilor, au rămas unele semnale pozitive, care ar putea fi cauzate de legarea nespecifică a primului anticorp. După cum sa discutat mai sus, investigarea exprimării MRP8 renale prin biopsie renală ne ajută să înțelegem fiziopatologia și prognosticul bolilor cronice de rinichi, în special asociate cuobezitateași diabet, dar are un dezavantaj pentru utilizarea de rutină și repetată în clinicile de ambulatoriu

În rezumat, prezentul studiu sugerează că expresia MRP8 înrinichireflectă starea patologică actuală și, de asemenea, prezice rezultatele renale la pacienții cuobezitateasaudiabet zaharat de tip 2. Investigații suplimentare care studiază nivelurile urinare de MRP8 la pacienții obezi sau diabetici la scară largă pot fi justificate

informatii justificative

Figura S1 Fotografii reprezentative care arată secțiuni de biopsie renală ale unui pacient DN colorate cu (A) acid periodic Schiff, (B) argint metanamină cu acid periodic sau (C) tricrom Masson. Raportul dintre numărul de glomeruli cu scleroză globală (săgeți) dintre cel al glomeruli total și aria relativă a fibrozei tubulointerstițiale a fost de 33%, respectiv 65% la acest pacient. (TIFF)

Figura S2 Imunohistochimia pentru proteinele MRP8 și CD68 la pacienții cu DN. Fotografiile din coloana din dreapta arată experimente de control negativ fără primul anticorp. (TIF)

Figura S3 Test de absorbție a anticorpilor pentru colorarea cu MRP8. PBS: soluție salină tamponată cu fosfat, rhMRP8: recombinant umanMRP8.(TIF)

Figura S4 Fotografii reprezentative ale expresiei MRP8 în grupuri MGA, MCNS, ORG și DN. (TIF)

Figura S5 Corelația dintre numărul de celule pozitive MRP8-glomerulare și parametrii clinici. Au fost utilizate valorile transformate în log ale semnalelor MRP8. Corelațiile au fost analizate folosind toate cele 4 grupuri (A-D, G) sau 3 grupuri, excluzând grupul MCNS (E, F). Cercuri deschise: anomalie glomerulară minoră (MGA), cercuri închise: sindrom nefrotic cu modificări minime (MCNS), triunghiuri deschise:obezitatea-glomerulopatie asociată (ORG), triunghiuri închise: nefropatie diabetică (DN).(TIF)

Figura S6 Corelația dintre zona MRP8-pozitivă tubulointerstițială și parametrii clinici. Au fost utilizate valorile transformate în log ale semnalelor MRP8. Aceste corelații au fost analizate folosind toate cele 4 grupuri (A-D, G) sau 3 grupuri, excluzând grupul MCNS (E, F). (TIF)

Figura S7 Corelația dintre expresia MRP8 glomerulară și tubulointerstițială. Au fost utilizate valorile transformate în log ale semnalelor MRP8. (TIF)

Figura S8 Corelația dintre zona MRP8-pozitivă tubulointerstițială și fibroza tubulointerstițială. Au fost utilizate valorile transformate în log ale semnalelor MRP8. (TIF)

Figura S9 Expresia ARNm renală a MRP8 la pacienții DN cu sau fără blocaj renină-angiotensină.NS: nu este semnificativ. n=15 (Da), 6 (Nu). Dintre cele 22 de cazuri DN, informațiile despre medicație nu au fost disponibile la un pacient.(TIF)

Fișierul S1 Tabele suport.

Tabelul S1, Diagnosticele patologice ale tuturor cazurilor care au suferit biopsie renală la Departamentul de Medicină și Științe Clinice, Spitalul Universitar Kyoto între 2000 și 2011. Tabelul S2, Secvențe de primer și sondă pentru RT-PCR în timp real TaqMan. Tabelul S3, Analiza de regresie logistică pentru apariția unui eveniment renal într-un an. (DOC) Mulțumiri Mulțumim cu recunoștință lui S. Tanaka pentru sfatul statistic, Y. Ogawa, N.Igarashi și C. Kimura pentru asistența tehnică și A. Yamamoto și SOgino pentru asistența de secretar. Contribuții autor Au conceput și proiectat experimentele: TK KM MK HY MI AN KNMM. Au efectuat experimentele: TK HI AI KK TM YK MI AN. S-au analizat datele: TK KM MK HY AS SY KU KN MM. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: TK KM. A scris lucrarea: TK KMMM.

Efectele cistanche: tratarea bolilor de rinichi

Referințe

1. Donath MY, Shoelson SE (2011) Diabetul de tip 2 ca boală inflamatorie.Nat Rev Immunol 11: 98–107.

2. Odink K, Cerletti N, Bruggen J, Clerc RG, Tarcsay L, et al. (1987) Twocalcium-binding proteins in infiltrating macrophages of rheumatoid artrite.Nature 330: 80–82.

3. Vogl T, Tenbrock K, Ludwig S, Leukert N, Ehrhardt C, et al. (2007) Mrp8 șiMrp14 sunt activatori endogeni ai receptorului Toll-like 4, promovând șocul letal, indus de endotoxină. Nat Med 13: 1042–1049.

4. Croce K, Gao H, Wang Y, Mooroka T, Sakuma M și colab. (2009) Proteina mieloidre-8/14 este critică pentru răspunsul biologic la leziunile vasculare. Circulation 120: 427–436.

5. Loser K, Vogl T, Voskort M, Lueken A, Kupas V, et al. (2010) Liganzii receptorului Toll-like 4 Mrp8 și Mrp14 sunt cruciali în dezvoltarea celulelor CD8 plus T autoreactive. Nat Med 16: 713–717.

6. Kuwabara T, Mori K, Mukoyama M, Kasahara M, Yokoi H, et al. (2012) Exacerbarea nefropatiei diabetice prin hiperlipidemie este mediată de receptorul Toll-like 4 la șoareci. Diabetologia 55: 2256–2266.

7. Fujiu K, Manabe I, Nagai R (2011) Celulele epiteliale ale canalului colector renal reglează inflamația în deteriorarea tubulointerstițială la șoareci. J Clin Invest 121: 3425–3441.

8. Sekimoto R, Kishida K, Nakatsuji H, Nakagawa T, Funahashi T și colab. (2012) Niveluri circulante ridicate ale complexului S100A8/A9 (calprotectină) la masculi japonezi cu adipoziție abdominală și expresie dereglată a S100A8 și S100A9 în țesuturile adipoase ale șoarecilor obezi. Biochem Biophys Res Commun 419: 782–789.

9. Mortensen OH, Nielsen AR, Erikstrup C, Plomgaard P, Fischer CP și colab. (2009) Calprotectin-un nou marker alobezitatea. PLoS One 4: e7419.

10. Matsuo S, Imai E, Horio M, Yasuda Y, Tomita K, et al. (2009) Ecuații revizuite pentru RFG estimat din creatinina serică în Japonia. sunt JRinichiDis53: 982–992.

11. Gross JL, de Azevedo MJ, Silveiro SP, Canani LH, Caramori ML, et al. (2005) Nefropatia diabetică: diagnostic, prevenire și tratament. Îngrijirea diabetului 28:164–176.

12. Kambham N, Markowitz GS, Valeri AM, Lin J, D'Agati VD (2001)Obezitatea-glomerulopatia asociată: o epidemie în curs de dezvoltare.RinichiInt 59: 1498–1509.

13. Praga M, Morales E (2006)Obezitatea, proteinurie și progresia insuficienței renale. Curr Opin Nephrol Hypertens 15: 481–486.

14. Kawasaki Y, Hosoya M, Takahashi A, Isome M, Tanji M și colab. (2005) Expresiile proteinei mieloidre 8 pe macrofage sunt un marker de prognostic util pentru disfuncția renală la copiii cu MPGN tip 1. Am JRinichiDis 45: 510–518.

15. Nishiyama A, Konishi Y, Ohashi N, Morikawa T, Urushihara M, et al. (2011) Angiotensinogenul urinar reflectă activitatea sistemului intrarenal renină-angiotensină la pacienții cu nefropatie IgA. Nephrol Dial Transplant 26: 170–177.

16. Ogawa Y, Mukoyama M, Yokoi H, Kasahara M, Mori K și colab. (2012) Receptorul peptidei natriuretice guanilil ciclaza-A protejează podocitele de leziunile glomerulare induse de aldosteron. J Am Soc Nephrol 23: 1198–1209.

17. Yokoi H, Mukoyama M, Mori K, Kasahara M, Suganami T și colab. (2008) Supraexprimarea factorului de creștere a țesutului conjunctiv în podocite agravează nefropatia diabetică la șoareci.RinichiInt 73: 446–455.

18. Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, Sanjo H, Ogawa T și colab. (1999) De vârf: Șoarecii cu deficiență de receptor 4 de tip Toll-like (TLR4) sunt hiporesponsivi la lipopolizaharide: dovezi pentru TLR4 ca produs al genei Lps. J Immunol162: 3749–3752.

19. Suganami T, Tanimoto-Koyama K, Nishida J, Itoh M, Yuan X și colab. (2007) Rolul căii receptorului Toll-like 4/NF-kappaB în modificările inflamatorii induse de acizi grași saturati în interacțiunea dintre adipocite și macrofage. Arterioscler Thromb Vasc Biol 27: 84–91.

20. Pepper RJ, Hamour S, Chavele KM, Todd SK, Rasmussen N, et al. (2013) Expresia leucocitelor și a serului S100A8/S100A9 reflectă activitatea bolii în vasculita și glomerulonefrita asociate ANCA.RinichiInt 83: 1150–1158.

21. Ravid M, Brosh D, Ravid-Safran D, Levy Z, Rachmani R (1998) Principalii factori de risc pentru nefropatie în diabetul zaharat de tip 2 sunt nivelurile de colesterol plasmatic, tensiunea arterială medie și hiperglicemia. Arch Intern Med 158: 998–1004.

22. Adler AI, Stratton IM, Neil HA, Yudkin JS, Matthews DR, et al. (2000) Asocierea tensiunii arteriale sistolice cu complicațiile macrovasculare și microvasculare ale diabetului de tip 2 (UKPDS 36): un studiu observațional prospectiv.BMJ 321: 412–419.

23. Ruggenenti P, Remuzzi G (1998) Nefropatia diabetului zaharat de tip-2. J Assoc Nephrol 9: 2157–2169.

24. Taft JL, Nolan CJ, Yeung SP, Hewitson TD, Martin FI (1994) Corelații clinice și histologice ale declinului funcției renale la pacienții diabetici cu proteinurie. Diabet 43: 1046–1051.

25. Matsusaka T, Niimura F, Shimizu A, Pastan I, Saito A, et al. (2012) Liverangiotensinogenul este sursa primară de angiotensină II renală. J Am Soc Nephrol23: 1181–1189.

26. Kuwabara T, Mori K, Mukoyama M, Kasahara M, Yokoi H, et al. (2009) Nivelurile de lipocalină asociate cu gelatinaza neutrofilelor urinare reflectă deteriorarea glomerulilor, a tubilor proximali și a nefronilor distali.RinichiInt 75: 285–294.

27. Kawasaki Y, Suyama K, Go H, Imamura T, Ushijima Y, et al. (2009) Acumularea de macrofage care exprimă proteina 8 asociată mieloidului asociată cu progresia modificărilor sclerotice la copiii cu nefropatie IgA. Tohoku J Exp Med 218: 49–55.

28. Nagareddy PR, Murphy AJ, Stirzaker RA, Hu Y, Yu S, et al. (2013) Hiperglicemia promovează mielopoieza și afectează rezoluția aterosclerozei. Cell Metab 17: 695–708.

29. Jin Y, Sharma A, Carey C, Hopkins D, Wang X și colab. (2013) Expresia genelor inflamatorii este suprareglată în sângele periferic al pacienților cu diabet zaharat de tip 1. Îngrijirea diabetului.

30. Longo VD, Finch CE (2003) Medicină evolutivă: de la sisteme model pitic la centenarii sănătoși? Știința 299: 1342–1346.

Citate: Kuwabara T, Mori K, Kasahara M, Yokoi H, Imamaki H, et al. (2014) Semnificația predictivă aRinichiExprimarea proteinei 8 mieloide la pacienții cuObezitatea- sau Boli de rinichi asociate diabetului zaharat de tip 2. PLoS ONE 9(2): e88942. doi:10.1371/journal.pone.0088942

Editor: Utpal Sen, Universitatea din Louisville, Statele Unite ale Americii

Primit 11 septembrie 2013; Acceptat 14 ianuarie 2014; Publicat 18 februarie 2014

Copyright: 2014 Kuwabara et al. Acesta este un articol cu ​​acces liber distribuit în conformitate cu termenii licenței de atribuire Creative Commons, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea fără restricții pe orice mediu, cu condiția să fie creditate autorul și sursa originală.

Finanțare: Această lucrare a fost susținută parțial de Grant-in-Aid pentru Cercetarea Nefropatiei Diabetice și Nefrosclerozei de la Ministerul Sănătății, Muncii și Bunăstării din Japonia (către KM), granturi de cercetare de la Ministerul Japonez al Educației, Culturii, Sportului, Științei , și Tehnologie (către TK, KM și MM), de la Fundația Japoneză pentru Enzimologie Aplicată (către TK) și de la Fundația de Cercetare a Fumatului (către MM). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

* E-mail: keyem@kuhp.kyoto-u.ac.jp