Efectul protector al Tubuloside B pe Apoptoza indusă de TNFα în celulele neuronale

ABSTRACT

SCOP: Pentru a investiga efectul neuroprotector al tubulosidei B, unul dintre feniletanoide izolate din tulpinile deCistanche salsa, pe tumora necroză factor-alfa (TNFα)-induse de apoptoza în SH-SY5Y neuronale Celule.METODE: Viabilitatea celulară a fost analizată cu ajutorul unui test MTT. Celulele apoptotice au fost detectate cu ajutorul societății Hoechst33342 și confirmate de fragmentarea ADN-ului și analiza citometrică a fluxului. Activitatea caspase-3 a fost măsurată cu un kit special de test. Concentrația intracelulară liberă calciul a fost determinat cu sondaIndo-1 de spectrometru. Nivelul a speciilor reactive de oxigen intracelular și potențialul membrana mitocondrială a fost determinată prin scanarea cu laser confocală microscopie (LSCM) combinată cu sondă de fluorescențăH2DCFDA sau JC-1 Respectiv. REZULTATE: Celule SH-SY5Y tratate cu TNFα 100 μg/L timp de 36 h au prezentat modificări morfologice tipice ale apoptozei. Scara ADN-ului ar putea fi observată prin electroforeză cu gel de agaroză. Cel mai mare procent de celulele apoptotice s-au acumulat la 37,5 %. După 36 h tratament cu TNFα, acumularea de ROS intracelular și [Ca2+] I și scăderea în s-a observat potențialul membranei mitocondriale și caspaza-3activitatea a crescut de aproximativ cinci ori în comparație cu comenzile. Însă pretratare cu tubuloside B (1, 10 sau100 mg/L) timp de 2 ore atenuate apoptoza mediată de TNFα. Acțiunea antiapoptotică a tubulosidei Ba fost parțial dependentă de efectele stresului anti-oxidativ, menținerea funcția mitocondriilor, o scădere a concentrației de intracelular liber calciu, și inhibarea activității caspaza-3. CONCLUZIE: Tubuloside B are capacitatea neuroprotectoare de a antagoniza apoptoza indusă de TNFα în celulele SH-SY5Y și poate fi util în tratarea unor neurodegenerative Boli.

INTRODUCERE

Apoptoza joacă un rol homeostatic important în mai multe procese celulare, precum și în dezvoltarea sistemelor nervoase[1]. Moartea celulară programată poate contribui, de asemenea, la diferite afecțiuni patologice, cum ar fi ischemia cerebrală[2,3], tulburările neurodegenerative, cum ar fi boala Alzheimer, boala Parkinson, boala Huntington și scleroza laterală amiotrofică[4-7]; precum și encefalopatia întârziată după intoxicația acută cu monoxid de carbon[8]. Mai multe linii de dovezi au sugerat cu tărie că stresul oxidativ, un dezechilibru celular între producerea și eliminarea speciilor reactive de oxigen (ROS), a dus la apoptoza neuronală și la acroză[9-11]. Prin urmare, este valoros să se identifice compușii care pot antagoniza acțiunea vătămătoare a ROSand acționează ca un antioxidant pentru a proteja neuronii de apoptoza.

Tubuloside B este unul dintre feniletanoidele izolate din tulpinileCistanche salsa, un medicament chinez pe bază de plante, care este un medicament brut important utilizat atât ca agent anti-seleniu, cât și ca agent anti-oboseală[12]. S-a demonstrat că mai multe feniletanoide posedă proprietăți de curățare a radicalilor liberi și protejează leziunile toxice induse de stres oxidativ[13-15]. Factorul de necroză tumorală alfa (TNFα) este un agent toxic-interferență datorită rolului său important în bolile neurodegenerative. Moartea prin necroză sau apoptoza a fost observată ca răspuns la TNFα[16]. Multe studii sugerează că stresul oxidativ joacă un rol critic în mecanismul apoptozei celulare mediate de TNFα. Nivelurile crescute de SRO au fost documentate în celule în urma tratamentului cu TNFα[17,18] și moartea mediată de TNNFα poate fi inhibată de radicalii liberi[19]. Astfel, am studiat dacă tubuloside Bcanprotect împotriva apoptozei induse de TNFα și a stresului oxidativ în celulele neuronale sh-SY5Y cultivate.

MATERIALE ȘI METODE

Reactivi

Mediu eagle modificat (MEM) și fetale bovine ser (FBS) au fost achiziționate de la GIBCO / BRL. Colorantul cromatinei bisbenzimidă (Hoechst 33342), poli-L-lizină, 3-(4,5-dimetiltiozal-z-il)-2,5-difeniltetrazoliu (MTT), TNFα și diacetat de 2,7-diclordihidrofluoresceină (H2DCFDA) au fost obținute de la Sigma Chemical Company (St Louis, MO, SUA). Kitul de detectare a apoptozei izotiocianatului de fluoresceină anexain-V (FITC) a fost achiziționat de la Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN, Germania). 5,5',6,6'-Tetracloral-1,1',3,3'-tetraetil benzimidazol carbură de carbocianină (JC-1) și Indo-1/AM au fost achiziționate de la sonde moleculare (Leiden, TheNetherlands). Testul Caspase-3 și kiturile de extracție a ADN-ului au fost obținute de la Promega (SUA). Tubuloside B de laCistanche salsaa fost furnizat cu amabilitate de dr. Peng-fei TU (Peking University Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine). Puritatea compușilor a fost mai mare de 98 % în cazul cromatografiei lichide de înaltă performanță (HPLC). Toți ceilalți reactivi sau medicamente au fost de calitate analitică.

Cultura celulară și tratamentul

Celulele neuronale SH-SY5Y obținute din ATCC au fost menținute în memsupplemented cu 10 % FBS, 100 KU/L benzilpenicilină și 100 mg/L streptomicine într-un balon de cultură acoperit cu poli-L-lizină într-un incubator umidificat cu 5 % CO2 la37 °C. Mediul de cultură a fost reînnoit la fiecare 2 la 3d. Celulele au fost pretratate cu diferite concentrații de tubulozidă B (1, 10 sau 100 mg/l) timp de 2 ore și apoi tratate cu 100 μg/L TNFα timp de 36 de ore înainte de analiză. Celulele normale au fost considerate ca fiind de control.

Analiza viabilității celulare

Viabilitatea celulară a fost determinată de utilizarea unui test MTT[20]. Celulele au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la 1×104 celule pe godeu și cultivate la 70 % confluență în mediul de cultură. Mediul a fost înlocuit cu un mediu care conține diferite concentrații de tubulozidă B timp de 2 ore și apoi cu TNFα timp de 36 de ore. Un total de 5 g/L MTT a fost adăugat la fiecare godeu după 36 de ore, iar cultura a continuat să se incubeze pentru încă 4 ore la 37 °C. După îndepărtarea mediului, celulele și cristalele de coloranți au fost solubilizate cu dimetilsulfoxid de 200 μL (Me2SO), iar absorbanța a fost măsurată la 570 nm prin utilizarea unui cititor de testare cu microplată ELX-800 model (One Lambda Inc).

Hoechst 33342 colorare

După tratamentul cu tubuloside B și/sau TNFα, celulele au fost recoltate și fixate cu paraformaldehidă 4 % timp de 30 de minute la 25 °C, apoi spălate cu soluție salină tampon de fosfat pre-refrigerată (PBS) de trei ori și expuse la 10 mg/L Hoechst33342 la temperatura camerei în întuneric timp de 10 minute. Probele au fost observate la microscopie cu fluorescență (Olympus RX 400)[21].

Analiza fragmentării ADN-ului

ADN-ul a fost extras prin utilizarea unui kit de extracție a ADN-ului (Promega) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Pe scurt, o probă de ADN de 10 μL a fost încărcată pe geluri orizontale de agaroză de 1,5 % care conțin bromură de ethidiu. Gelurile au fost rulate la 60 V timp de 1 h, iar fragmentele de ADN au fost vizualizate folosind iluminarea UV[22].

Experiment de legare anexain-V

Kitul de detectare a apoptozei AnexainV-FITC a fost utilizat pentru a lega anexaina-V, care are o afinitate puternică pentru fosfatidilserina și poate sonda pentru apoptoza[23]. Pe scurt, celulele au fost recoltate și suspendate în tampon de legare la o concentrație celulară finală de 1×106 celule/ml. Aproximativ 1×105celule au fost incubate în întuneric cu anexain-V și iodură de propidiu timp de 15 min. Apoi, suspensia a fost analizată cu ajutorul unui citometru de debit de scanare FACS (Becton Dickinson, Heidelberg, Germania). Fluorescența legată de anexain-VFITC și iodură de propidiu au fost înregistrate pe filtrele FL1-H (525 nm) și, respectiv, FL2-H (575 nm).

Caspase-3 test de activitate

Activitatea Caspase-3 a fost detectată prin utilizarea kitului de testare Apo-ONETM HomogeneousCaspase-3 (Promega). Pe scurt, celulele au fost însămânțate în plăci de 96 de godeuri la 1×104 celule/fântână. După ce au fost expuse la diferite concentrații de tubulosideB și /sau TNFα, celulele au fost spălate cu PBS rece ca gheața. Apoi, 1 μL Z-DEVD-R110 și 99 μL tampon de caspază au fost amestecate pentru a face caspaza omogenă-3reagent. În fiecare godeu s-a adăugat un total de reactiv omogen caspază-3 de 100 μL. Conținutul a fost ușor amestecat și incubat timp de 4 ore la temperatura camerei în întuneric. Intensitatea fluorescenței substratului Z-DEVD-R110 a fost măsurată la o lungime de undă de excitație de 498 nm și o lungime de undă de emisie de 521 nm cu ajutorul unui spectrofluorometru de microplată (Wallac Victor2 TM 1420 Multilabel Counter, SUA).

Determinarea nivelului intracelular al ROS intracelular

Nivelurile de SRO au fost măsurate cu ajutorul metodei de colorare fluorescentă H2DCFDA[24]. H2DCFDA este un compus nepolar care este transformat într-un derivat polar nefluorescent (H2DCF) prin esteraze celulare după încorporarea în celule. H2DCF este membrană impermeabilă și oxidată rapid la 2,7-diclorfluoresceină (DCF) foarte fluorescentă în prezența SRO intracelular[25]. Celulele cultivate pe capace de sticlă din fiecare grupă au fost incubate timp de 30 de minute la 37 °C cu H2DCFDA 20 μmo/L dizolvat în PBS. Capacele au fost apoi spălate de trei ori cu PBS și analizate sub microscopie laser confocală (Leica, Germania). DCF a fost excitat la 488 nm, iar filtrul de emisie a fost un filtru de barieră de 510 nm. Intensitatea fluorescentă și imaginile microscopice cu laser confocal au fost menținute constante pentru a permite compararea intensităților relative ale fluorescenței între celulele de control și cele experimentale.

Testul potențial al membranei mitocondriale

Potențialul membranei mitocondriale de celule a fost eu sigur cu utilizarea sondei JC-1[26]. JC-1 poate intra selectiv în mitocondrii, care apare verde la concentrații scăzute sau potențial scăzut de membrană ca monomer. Cu toate acestea, la concentrații mari, mitocondriile arată ca agregate fluorescente roșii. JC-1 este sensibil la potențialul membranei mitocondriale, iar modificările raportului dintre fluorescența verde și cea roșie pot oferi informații cu privire la potențialul membranei mitocondriale. După ce celulele tratate au fost încărcate cu JC-1 1 μmol/L timp de 10 minute la 37 °C, colorantul fluorescent a fost excitat la 490 nm, iar intensitățile fluorescenței atât ale moleculelor monomere, cât și ale moleculelor agregate au fost înregistrate la 590 nm sub o microscopie laser cu scanare confocală.

[Măsurători ca2+]i

Concentrația intracelulară liberă de calciu ([Ca2+]i) a celulelor SHSYY a fost determinată cu sonda Indo-1 urmând metoda descrisă de Rego et al[27]. După tratamentul cu TNFα (în prezența sau absența tubulozidei B), celulele SHSYY au fost încărcate cu 3 μmol Indo-1/AM în MEM timp de 45min, la 37 ° C și incubate în continuare timp de 15 minute în MEMto permit hidroliza precursorului esterului de acetoximetil al sondei. După clătirea cu soluție salină de sodiu (cu 1,5 mmol/L CaCl2), fluorescența celulară a fost măsurată la 37 °C într-un spectrometru de luminescență, cu excitație la 335 nm și emisie la 410 nm. [Ca2+] I a fost calculat în conformitate cu ecuația:

[Ca2+]i=250 nmol/L×[(F-Fmin)/(Fmax-F)] (nmol/L),

unde 250 nmol/L corespunde constantei de disociere a complexului Indo-1-Ca2+, Fmax este fluorescența maximă obținută la adăugarea a 3 ¦Ìmol/Lionomicină, iar Fmin este fluorescența minimă determinată în urma ecuației: Fmin=AF+1/12(Fmax-AF), unde AF este autofluorescența obținută la adăugarea a 3 mmol/L MnCl2.

Analiza statistică

Rezultatele au fost exprimate asmean±SD de valori triplicate pentru fiecare experiment. Comparațiile statistice au implicat utilizarea testului Student-S. P<0.05 was="" considered="" to="" be="" statistically="">

REZULTATELE

Efectul tubulosidei B asupra morfologiei nucleare celulare

Colorarea societății Hoechst 33342 sensibilă la ADN a fost utilizată pentru a evalua modificările morfologiei nucleare în urma tratamentului cu tubulozide B și TNFα. Nucleele din celulele normale au fost normale și au prezentat colorarea difuză a cromatinei (Fig. 1A). Cu toate acestea, după expunerea la TNFα 100 μg/L timp de 36 de ore, sh-SY5Ycells a suferit modificări morfologice tipice ale apoptozei, cum ar fi cromatina condensată și nucleul micșorat (Fig. 1B). O scădere semnificativă a fost observată în celulele pretratate cu tubuloside B (Fig. 1C-1E).

Efectul neuroprotector al tubulosidei B asupra viabilității celulare

După incubarea cu TNFα, aproximativ45,6 % din celule au suferit moartea apoptozei. Pretratarea cu tubulozidă B (1, 10 sau 100 mg/L) a scăzut rata mortalității celulare într-un mod dependent de doză (rata mortalității celulare a fost de 30 %, 19,5 % și, respectiv, 6,2 %; Fig. 2), dar tubulosidul B singur nu a provocat nici o citotoxicitate aparentă (datele nu au fost prezentate).

Efectul tubulozidei B asupra fragmentării ADN-ului

După expunerea celulelor SH-SY5Y cu TNFα timp de 36 de ore, s-a observat o scară adn de obicei pronunțată. Cu toate acestea, celulele de pretratare cu tubuloside B au inhibat scara ADN-ului mediatTNFα, în special la concentrația de 100 mg/l, care inhibă complet fragmentarea ADN-ului (Fig. 3).

Efectul tubulosidei B asupra expunerii fosfolipidelor la phosphatidylserine

Acțiunea antiapoptotică a tubulosidei B a fost, de asemenea, confirmată prin măsurarea prezenței fosfatidilserinei pe membrana celulară exterioară. În cadrul controlului, aproximativ 96,3 % din celule sunt sănătoase. Figura 4 a arătat rezultatele experimentelor de legare anexain-V pentru a măsura prezența fosfatidilserinei pe membrana celulară exterioară. Procentul de apoptoză a fost de 37,5 % după tratamentul cu TNFα (Fig. 4B), dar proporția a scăzut la 28,2 %,19,29 % și la 7,9 % cu pretratarea tubulosideB de 1, 10 sau, respectiv, 100 mg/L (Fig. 4C-4E).

Efectul inhibitor al tubulozidei B asupra formării ROS

În studiul de față, micrografele laser confocale tipice au fost obținute din celule SH-SY5Y timp de 36 de ore în absența sau prezența TNFα și tubulosideB. Nivelul de SRO generat în celulele induse de TNFα a crescut semnificativ în comparație cu controalele (Fig. 5B). Cu toate acestea, intensitatea fluorescenței în celulele tratate cu tubulozidă B a scăzut cu 16,2 %, 56,4 % și cu 89,7 % în cazul tratamentului cu 1,10 sau, respectiv, cu 100 mg/L cu tubulozidă B în comparație cu celulele tratate cu TNFα (Fig. 5C-5E).

Efectul tubulosidei B asupra potențialului membranei mitocondriale

Celulele de control netratate au prezentat numeroase mitocondrii viu colorante care emiteau fluorescență roșu-portocalie și raport roșu/verde a fost5,97±0,21, ceea ce indica un potențial normal al membranei ridicate (Fig. 5A). TNFα-tratament induse de o tranziție în permeabilitatea mitocondriilor și o pierdere semnificativă a potențialului membranei (raportul roșu/verde a fost 0.35±0.02) (Fig. 5B). Tratamentul tubulosideB a inhibat colapsul potențialului membranei mitocondriale induse de TNFα în SH-SY5Ycells cu creșterea dozei. Tubuloside B a reluat treptat potențialul membranei mitocondriale cu concentrații în creștere, așa cum este indicat prin reapariția colorării mitocondriale roșii (Fig6C-6E).Efectul tubulosidei B asupra activității caspază-3

Activitatea caspază-3 a fost crescută de aproximativ cinci ori în comparație cu controalele după expunerea la TNFα (Fig. 7). În schimb, celulele SH-SY5Y care au fost pretratate simultan cu tubuloside B 1, 10 sau 100 mg/L au arătat o scădere semnificativă a activității caspază-3 în comparație cu celulele create de TNFα în același moment (Fig. 7).

Efectul tubulosidei B la nivelul [Ca2+]i

Nivelul de [Ca2+] I în celulele induse de TNFα a crescut semnificativ în comparație cu controalele (control: 105,5±11,2nmol/L; 100 μg/L TNFα: 238,4±18,9 nmol/L), care a fost parțial redus prin pretratarea cu tubuloside B(10 sau 100 mg/L) (Fig. 8).

DISCUȚIE

CistanchesSalsa(CA Mey) G Beck, o specie deCistanchescare aparține familiei Orobanchaceae, este o plantă parazitară originară din nord-vestul Chinei. Tulpina acestei plante este un important medicament tradițional chinez și este utilizat pentru deficit de rinichi, infertilitate feminină, leucoree morbidă, neurastenia, și constipație senilă din cauza inerției colonice. Constituenții activi majore din aceasta planta sunt feniletanoide glicozide[28]. În ultimii ani, rezultatele mai multor studii au evidențiat funcția tubulozidei B în promovarea diferitelor activități farmacologice și biologice[13-15]. Cu toate acestea, mecanismele celulare și moleculare care stau la baza acțiunilor nu sunt pe deplin înțelese. Studiul de față a demonstrat că tubulozida B a avut efecte neuroprotectoare semnificative asupra apoptozei induse de TNFα în celulele SH-SY5Yneuronal prin menținerea funcției mitocondriale, scăderea generării de SRO, reducerea nivelului de calciu intracelular și inhibarea activității caspază-3 printr-un mecanism de antioxidare. Aceste mecanisme pot fi prin efectul neuroprotector individual al tubulosidei B sau prin interacțiunea acestuia cu alți factori și apoi pot duce la scăderea raportului de apoptoza în celule.

Studiile anterioare au arătat că oxidanții sau prooxidanții sunt regulatori importanți ai apoptozei și pot induce apoptoza[29,30]. Stresul oxidativ este un element comun al apoptozei induse de diverși stimuli, cum ar fi TNFα și expunerea la toxine din mediu, care de obicei nu exercită o acțiune oxidantă directă. Rolul central al stresului oxidativ în apoptoza este puternic susținut de capacitatea diferiților antioxidanți celulari de a bloca apoptoza indusă de diverși agenți[31]. Compușii cu proprietăți antioxidante ar putea avea un efect protector în diferite situații de disfuncție celulară prin curățarea radicalilor liberi[32]. În plus, mai multe glicozide phenylpropanoid au fost raportate să posede proprietăți de coridoarele radicalilor liberi și de a proteja leziunile toxice induse de stres oxidativ. În conformitate cu această idee, am descoperit că tubuloside B a scăzut nivelul de ROS indusă de TNFα, s-ar putea proteja neuronii împotriva apoptozei prin curățarea directă a speciilor de oxigen reactiv intracelular.

Multe dovezi au sugerat că modificările majore ale funcției mitocondriale au fost implicate critic în procesul apoptotic[33]. S-a constatat că tulburările homeostaziei calciului și modificările potențialului membranei mitocondriale promovează deschiderea porilor de tranziție cu permeabilitate mitocondrială (MPTP) sau induc eliberarea citocromului c prin mecanisme independente de MPTP, fiind direct responsabile de activarea cascadei apoptotice și pot preceda semnele nucleare ale apoptozei[34]. Aceste modificări biochimice pot rezulta din alternanțe în funcția mitocondriilor[35]. Faptele că tubulosidul B a inhibat reducerea potențialului membranei mitocondriale și a redus creșterea calciului intracelular indus de TNFα sugerează că tubulosidul B poate avea capacitatea de a contracara toxicitatea TNFα prin inhibarea deschiderii MPTPand suprimând disfuncția mitocondriilor.

Stimulii exteriori pot iniția apoptoza prin mecanismele de mai sus și pot converge pe calea caspază pentru a executa faza finală a procesului apoptotic[36]. Familia de proteaze caspază este formată din cel puțin 14 membri ai mamiferelor care sunt exprimați constitutiv în aproape toate tipurile de celule ca proenzime inactive (zimogeni) care devin procesați și activați ca răspuns la o varietate de stimuli pro-apoptotici[37]. Caspase-3 este un membru din aval al cascadei caspase și acționează ca efector central în faza de execuție. Când proteina precursoare caspază-3 CPP32 este activată de semnale din amonte, cum ar fi eliberarea citocromului mitocondrial c, caspaza activă-3cleaves reziduuri aspartate specifice în proteine cu diferite funcții structurale, de menaj și de reglementare[38-40]. Aceste evenimente proteolitice pot duce la apoptoza celulară și pot contribui la fragmentarea ADN-ului și la modificările morfologice nucleare. Astfel, substanțele care pot inhiba activitatea caspazei-3 ar putea proteja celulele de apoptoza[2,31]. Deoarece tubulosidul B a inhibat semnificativ activitatea caspază-3 în celulele tratate cu TNFα, are capacitate neuroprotectoare.

În concluzie, tubulosidul B a avut un efect protector multifuncțional asupra neuronilor deteriorați. Din cauza sale puternice anti-apoptoza si activitatile de stres antioxidative, ar putea fi pentru uz clinic în neurodegenerative și neurologice handicap care implică neuron apoptoza.