Cuantificarea degenerării nevritelor cu acuratețe și eficiență sporite într-un model in vitro al bolii Parkinson, partea 1

Abstract

Degenerarea nevritelor este asociată cu stadiile incipiente ale tulburărilor neurodegenerative, cum ar fi boala Alzheimer, boala Parkinson (PD) și scleroza laterală amiotrofică. O metodă care este utilizată în mod obișnuit pentru analiza degenerării neuriților implică calcularea unui indice de degenerare (DI) în urma utilizării instrumentului de analiză a particulelor de la ImageJ pentru a detecta fragmente de neurite în micrografiile celulelor cultivate. Cu toate acestea, analizele DI sunt predispuse la mai multe tipuri de erori de măsurare, pot fi consumatoare de timp și sunt limitate în aplicare.

Neurodegenerarea se referă la schimbările care apar în sau în jurul neuronilor, care pot afecta funcția cognitivă umană, inteligența, emoția, comportamentul etc. Mulți oameni cred că neurodegenerarea este strâns legată de deteriorarea memoriei, dar acesta poate să nu fie cazul.

În primul rând, neurodegenerarea nu înseamnă neapărat că memoria scade odată cu vârsta. Unii oameni pot păstra o memorie bună și chiar pot înțelege dreptatea. Acest lucru se datorează faptului că memoria unei persoane este afectată de o combinație de factori precum exercițiile fizice, dieta și stilul de viață.

În al doilea rând, creierul uman poate restabili noi conexiuni neuronale și poate forma noi amintiri, ceea ce se numește plasticitate. Indiferent de vârstă, creierul învață constant și își formează noi amintiri. Prin urmare, neurodegenerarea este pur și simplu o schimbare naturală a creierului și nu înseamnă neapărat că memoria se va deteriora.

În cele din urmă, menținerea unei atitudini optimiste poate îmbunătăți și memoria unei persoane. Îngrijorarea și stresul pot avea efecte adverse asupra creierului, ducând la pierderea memoriei. O atitudine pozitivă poate promova sănătatea creierului și poate îmbunătăți memoria și capacitatea cognitivă.

În concluzie, neurodegenerarea nu duce neapărat la pierderea memoriei, iar o atitudine optimistă față de viață ne poate ajuta să menținem o memorie bună și o capacitate cognitivă. Prin urmare, ar trebui să menținem o atitudine optimistă și să consolidăm exercițiile fizice, dieta și gestionarea stilului de viață pentru a menține sănătatea creierului și memoria. Se poate observa că trebuie să ne îmbunătățim memoria. Cistanche poate îmbunătăți semnificativ memoria, deoarece Cistanche poate regla și echilibrul neurotransmițătorilor, cum ar fi creșterea nivelului de acetilcolină și a factorilor de creștere. Aceste substanțe sunt foarte importante pentru memorie și învățare. În plus, carnea poate, de asemenea, să îmbunătățească fluxul sanguin și să promoveze livrarea de oxigen, ceea ce poate asigura că creierul primește suficientă nutriție și energie, îmbunătățind astfel vitalitatea și rezistența creierului.

Faceți clic pe cunoașteți modalități de îmbunătățire a funcției creierului

Aici, descriem o metodă îmbunătățită pentru efectuarea analizelor DI. Precizia măsurătorilor a fost îmbunătățită prin modificarea criteriilor de selecție pentru detectarea fragmentelor de neuriți, îndepărtarea artefactelor de imagine și a materialelor non-neurite din imagini și optimizarea contrastului imaginii. Astfel de îmbunătățiri au fost implementate într-o macrocomandă ImageJ care permite analiza DI rapidă și complet automatizată a mai multor imagini. Macro-ul prezintă operații pentru îndepărtarea automată a corpurilor celulare din micrografii, extinzând astfel aplicarea analizelor DI pentru a fi utilizate în experimente care implică culturi disociate.

Prezentăm constatări experimentale care susțin că, în comparație cu metoda convențională, metoda de analiză îmbunătățită oferă măsurători cu o acuratețe sporită și necesită mult mai puțin timp pentru a efectua.

În plus, demonstrăm utilitatea metodei de investigare a degenerării neuriților într-un model de cultură celulară de PD prin efectuarea unui experiment care dezvăluie efectele kinazei c-Jun N-terminal (JNK) asupra degenerării neuritelor induse de stresul oxidativ în celulele mezencefalice umane. Această metodă de analiză îmbunătățită poate fi utilizată pentru a obține o nouă perspectivă asupra factorilor care stau la baza degenerării nevrite și a progresiei tulburărilor neurodegenerative.

Cuvinte cheie:

Degenerescenta axonala; indicele de degenerare; degenerarea nevritelor; neurodegenerare; stresul oxidativ; Boala Parkinson.

Declarație de semnificație

Degenerarea nevrite este un eveniment celular asociat cu stadiile incipiente ale multiplelor tipuri de tulburări neurodegenerative. Factorii moleculari care reglează degenerescenta neuriților rămân prost înțeleși, iar metodele existente pentru studierea degenerării neuritice au o aplicație și o eficiență limitate. Aici, identificăm modificări la o procedură utilizată pe scară largă pentru analiza degenerării nevrite care reduce eroarea de măsurare.

Astfel de îmbunătățiri metodologice au fost încorporate într-o macro ImageJ, facilitând astfel analiza rapidă și complet automatizată a degenerării nevritelor folosind seturi mari de micrografii. Folosind un model de cultură celulară a bolii Parkinson (PD), demonstrăm că macro facilitează măsurători mai precise și mai eficiente ale degenerării nevritelor, extinzând în același timp caracterul adecvat al metodei de analiză pentru experimentele care implică culturi disociate.

Introducere

Degenerarea nevrite este un proces celular în care axonii sau dendritele suferă disfuncții progresive și modificări morfologice, ducând la o pierdere a integrității neuritelor. Degenerarea nevritelor este un proces conservat evolutiv care este esențial pentru stabilirea corectă a rețelelor neuronale în timpul dezvoltării sistemului nervos central (Neukomm și Freeman, 2014).

Cu toate acestea, procesul este declanșat și ca răspuns la diferite forme de vătămare, cum ar fi deteriorarea mecanică sau expunerea la medicamente utilizate pentru chimioterapie (Salvadores et al., 2017). Mai mult, degenerarea neuritului este asociată cu progresia unei varietăți de tulburări neurodegenerative legate de vârstă, inclusiv boala Alzheimer, boala Parkinson (PD), boala Huntington și scleroza laterală amiotrofică.

Interesant este că pentru toate aceste tulburări neurodegenerative, acumularea de dovezi sugerează că degenerarea neuritului este un eveniment cheie, în stadiu incipient, care precede moartea neuronală sau debutul simptomelor clinice (Serrano-Pozo et al., 2011; Adalbert și Coleman, 2013; Marangoni și colab. ., 2014; Suzuki et al., 2020). Astfel, studiile care explorează factorii care reglează acest proces celular pot dezvălui noi ținte pentru tratarea unei varietăți de afecțiuni neurodegenerative.

Investigarea degenerării nevrite este deosebit de importantă pentru înțelegerea PD, o boală caracterizată prin acumularea de agregate proteice care conțin a-sinucleină, pierderea progresivă a neuronilor dopaminergici în substanța nigra pars compacta (SNpc) și dezvoltarea unei varietăți de simptome motorii și cognitive. (Aarsland și colab., 2017).

Dovezile din studiile post-mortem și imagistice umane indică faptul că agregatele de a-sinucleină sunt mai abundente în fibrele neuronale decât în ​​corpurile celulare, iar degradarea axonilor dopaminergici are loc într-o măsură mai mare decât pierderea neuronilor dopaminergici în SNpc în perioada care duce la debutul clinic. (Tagliaferro și Burke, 2016).

În timp ce interacțiunile moleculare care contribuie la deteriorarea progresivă a nevritelor dopaminergice rămân incomplet înțelese, dovezile recente indică faptul că degenerarea nevritelor poate fi mediată de evenimente independente de cascadele de semnalizare care stau la baza morții neuronale (Fukui, 2016; Geden și Deshmukh, 2016). Astfel, studiile care evaluează direct bazele fiziologice ale degenerării nevrite sunt esențiale pentru dezvoltarea terapiilor care împiedică progresia precoce a PD.

Ca răspuns la dovezile unui rol central pentru degenerarea neuriților în progresia tulburărilor neurodegenerative, au fost dezvoltate o varietate de metode pentru a măsura degenerarea neuriților folosind micrografii ale neuronilor cultivați. De exemplu, au fost stabilite mai multe metode diferite pentru a măsura degenerarea neuriților folosind software-ul pentru a detecta scăderea numărului sau a lungimii neuriților (Ofengeim și colab., 2012; Johnstone și colab., 2018).

Cu toate acestea, deoarece astfel de metode nu evaluează în mod direct fragmentarea neuriților, interpretarea rezultatelor pentru a determina impactul unei variabile asupra degenerării neuriților poate fi confundată de efectele potențiale ale variabilei asupra creșterii neuriților. Anumite grupuri de cercetare au măsurat, de asemenea, degenerarea neuriților prin punctarea subiectivă a imaginilor neuriților pe baza caracteristicilor morfologice și a gradului de fragmentare aparentă (Zhai și colab., 2003; Nakamura și colab., 2016; Krishtal și colab., 2017). Cu toate acestea, această metodă alternativă necesită mult timp și poate introduce o eroare a investigatorului.

O metodă care facilitează măsurarea obiectivă și directă a fragmentării neuriților implică utilizarea algoritmului de analiză a particulelor ImageJ pentru a măsura aria fragmentelor de neurite în micrografiile celulelor cultivate. Măsurătorile sunt utilizate pentru a calcula un indice de degenerare (DI), o scară între {{0}}.0 și 1,0 care reflectă gradul de degenerare a neuritei (Sasaki și colab., 2009).

În timp ce analizele DI pot fi utilizate pentru a detecta diferite grade de fragmentare a neuritului, acuratețea măsurătorilor este în mod obișnuit limitată de mai multe surse de eroare, iar aplicarea metodei a fost limitată în primul rând la culturile explante sau la celulele crescute în dispozitive microfluidice compartimentate. Mai mult, analizele DI sunt consumatoare de timp atunci când sunt extrapolate la seturi mari de imagini. Astfel, am căutat să depășim aceste limitări prin modificarea procedurii de analiză DI pentru a facilita o mai mare acuratețe și eficiență, extinzând în același timp aplicabilitatea.

În studiul de față, identificăm câteva surse de eroare asociate în mod obișnuit cu analizele DI și raportăm revizuiri metodologice care reduc diferitele forme de eroare. Încorporăm îmbunătățirile procedurale într-o macrocomandă ImageJ numită Automated Neurite Degeneration Index (ANDI) pentru a automatiza complet analizele DI din seturi mari de imagini. Funcționarea Macro-ului ANDI necesită doar software și fișiere care sunt open source și disponibile gratuit. Măsurătorile obținute folosind ANDI beneficiază de o acuratețe sporită, reducând în același timp substanțial timpul necesar pentru efectuarea analizelor.

Mai mult, demonstrăm modul în care noua metodă de analiză poate fi aplicată pentru a efectua măsurarea precisă și rapidă a degenerării nevrite într-un model de cultură celulară de PD care implică celule disociate crescute fără compartimentare. În mod colectiv, aceste îmbunătățiri metodologice pot duce la o nouă perspectivă asupra factorilor care stau la baza unui proces celular important asociat cu neurodegenerarea.

Materiale și metode

Cultură de celule

Culturi de celule mezencefalice umane Lund (LUHMES) au fost stabilite în lamele cu camere cu opt godeuri Lab Tek II acoperite cu poli-L-ornitină (PLO) și fibronectină, poli-D-lizină (PDL) și laminină, toate cele patru substraturi sau nu substraturi, după cum este indicat. Pentru a acoperi cu PLO și fibronectină, lamele au fost incubate peste noapte la temperatura camerei cu o soluție care conține 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, catalog #P3655).

După spălări cu apă sterilă (Avantor), lamelele au fost incubate cu 2 mg/ml fibronectină (Sigma-Aldrich, catalog #F0895) timp de 3 ore la 37 de grade. Lamele au fost apoi spălate cu PBS steril (Corning Life Sciences, catalog #21-040-CV) și lăsate să se usuce la aer. Pentru a acoperi cu PDL și laminină, lamele au fost incubate la temperatura camerei cu o soluție care conține 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, catalog #P7280) și 10 mg/ml laminină (Corning, catalog #354232).

După o incubare peste noapte, lamelele au fost spălate cu PBS steril și lăsate să se usuce la aer. Pentru a acoperi toate cele patru substraturi, procedurile menționate mai sus au fost efectuate secvenţial. Celulele LUHMES (ATCC, RRID: CVCL{0}}B056) au fost placate în lamele cu camere acoperite la densitățile indicate în mediu de diferențiere constând din DMEM/F12 (Invitrogen, catalog #11330057) suplimentat cu 2 mM glutamina (VWR), 1% (v/v) supliment N-2, 1 mg/ml tetraciclină (Sigma-Aldrich, catalog #87128-25G), 1 mM N6,29-odibutiriladenozină cAMP (db-cAMP) ; Enzo Life Sciences, catalogul #BML-CN125-0100) și 2 ng/ml factor neurotrofic derivat din linia de celule gliale (GDNF; R&D Systems, catalogul #212-GD{-010).

Cu excepția cazului în care se indică altfel, toate culturile au fost placate la o densitate de 115,000 celule per godeu. O înlocuire de mediu de 50% volum a fost efectuată la fiecare 48 de ore până la tratament. Pentru a preveni deriva genetică, stocurile de celule care au fost trecute de șase sau mai puține ori au fost utilizate pentru toate experimentele.

Experimentele care implică culturi primare de neuroni simpatici au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Eastern Kentucky University sau de la Universitatea Virginia. Ganglionii cervicali superiori au fost disecați de la șoareci 0-6 C56Bl/6 postnatali, incubați la 37 de grade într-un tampon de disociere enzimatică și spălați cu mediu de creștere pentru a îndepărta enzimele proteolitice și triturați.

Suspensiile de celule au fost placate la o densitate de 70{00 celule per godeu în lame Lab Tek II cu opt godeuri. Mediile au fost schimbate în ziua in vitro (DIV) 1, urmată de înlocuirea mediului la două zile. Mediile au fost suplimentate cu citozină arabinofuranozidă (Ara-C, Millipore-Sigma) pe DIV1-DIV3 pentru a preveni creșterea celulelor non-neuronale, urmată de îndepărtarea Ara-C din mediu cu cel puțin 24 de ore înainte de tratament, așa cum este indicat. Pentru experimentele efectuate la Universitatea Eastern Kentucky care implică tratarea cu peroxid de hidrogen, lamelele camerei au fost acoperite cu 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, catalog #P3655), 2 mg/ml fibronectină, 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, catalog #P7280) și 10 mg/ml laminină (Corning, catalog #354232) înainte de utilizare, iar disocierea a fost efectuată prin incubare 30-min în tampon constând din DMEM (ThermoFisher, catalog #11960- 044) care conține 0,025% tripsină (Corning Life Sciences, catalog #25-053-CI) și 0,3% colagenază (Worthington Biochemical, catalog #LS004176).

Mediile de creștere pentru astfel de experimente au constat din DMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin (Invitrogen, catalog #26140-079), 2 mM L-glutamina (Corning, catalog #25-005-CI) și 40 ng/ml factor de creștere a nervilor (Fisher Scientific, catalog #13-257-019); 5 mM Ara-C (Sigma-Aldrich) a fost utilizat pentru îndepărtarea celulelor nonneuronale.

Pentru experimentele efectuate la Universitatea din Virginia care implică retragerea NGF, celulele au fost placate pe lame de cameră acoperite cu 100 ng/ml PDL (Millipore Sigma) și 10 mg/ml laminină (Invitrogen), iar disocierea a fost efectuată prin 20-min. incubare în tampon constând din DMEM/F12 care conține BSA (10 mg/ml, Sigma-Aldrich), colagenază tip 2 (4 mg/ml, Worthington Biochemical), dezoxiribonuclează 1 (Millipore Sigma) și hialuronidază (Sigma-Aldrich). Mediile de creștere pentru astfel de experimente au constat din DMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin (Invitrogen), 1 U/ml penicilină/streptomicina (Invitrogen) și 45 ng/ml NGF (purificat din glandele salivare); 10 mM Ara-C a fost utilizat pentru îndepărtarea celulelor non-neuronale.

Tratamente celulare

Celulele LUHMES diferențiate au fost expuse la concentrațiile indicate de {{0}}hidroxidopamină (6-OHDA; Sigma-Aldrich, catalog #162957) sau la soluția vehicul în a cincea zi în mediul de diferențiere. Stocurile de 6- OHDA au fost preparate în PBS răcit care conține 0,02% ascorbat (Sigma-Aldrich, catalog #A5960), iar alicote au fost depozitate în flacoane protejate de lumină sub gaz inert la 80 de grade. După 24 de ore de tratament, celulele au fost fixate prin incubare în PBS care conține 4% paraformaldehidă (PFA) timp de 25 de minute la temperatura camerei.

Pentru a determina rolul kinazei N-terminale c-Jun (JNK) în degenerarea neuritului indusă de stresul oxidativ, culturile au fost pretratate timp de 1 oră cu 10 mM SP600125 (Sigma-Aldrich, catalog #S5567) sau soluție vehicul înainte de înlocuirea completă a mediului cu medii care conțin 7,5 mM 6-OHDA, 7,5 mM 6-OHDA și 10 mM SP600125 sau soluții vehicul. Stocurile de SP600125 au fost preparate prin dizolvarea inhibitorului în dimetilsulfoxid steril (DMSO), iar alicote congelate au fost depozitate în flacoane protejate de lumină umplute cu gaz inert la 20 de grade. Tratamentele au fost efectuate astfel încât celulele au fost expuse la nu mai mult de 0,1% DMSO.

Culturile primare de neuroni simpatici au fost tratate pe DIV5. Pentru experimentele care implică degenerarea neuritei indusă de peroxid de hidrogen, culturile au fost expuse la 500 mM de peroxid de hidrogen (Sigma-Aldrich, catalog #H1009-100ML) sau soluție vehicul constând din apă sterilă (Cytiva, catalog #SH30529.02) timp de 24 h.

Pentru experimentele care implică retragerea NGF, culturile SCG fie au primit o înlocuire a mediului cu medii de creștere, fie au fost supuse privării de NGF. Culturile SCG care urmează să fie private de NGF au fost clătite de trei ori cu mediu de creștere fără NGF și apoi incubate în mediu de creștere fără NGF timp de 80 de ore fără modificări ale mediului. După tratament, celulele au fost fixate prin incubare în PFA 4% în PBS timp de 30 de minute, urmată de îndepărtarea PFA prin clătire cu PBS.

Microscopie de colorare și fluorescență

Pentru experimentele cu celule LUHMES, precum și experimentele care implică neuroni simpatici tratați cu peroxid de hidrogen, lamele cu camere cu opt godeuri care conțineau celule fixe au fost permeabilizate cu 0,1% Triton X{-100 în PBS și blocate pentru 1 oră cu 10% ser normal de capră în PBS care conține 0,1% Triton X-100. Lamele au fost apoi incubate cu un anticorp primar specific pentru tubulina bI (Covance; 1:1000, RRID: AB_2313773) într-o soluție de blocare la 4 grade peste noapte. Ulterior, lamele au fost spălate cu PBS, incubate cu un anticorp secundar cuplat la Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_142495) timp de 90 de minute la temperatura camerei și supuse unor spălări suplimentare.

Pentru experimentele care implică colorarea cu tirozin-hidroxilază (TH), lamele au fost supuse unei incubații suplimentare în PBS care conține 10% ser normal de capră, 0,1% Triton X-100, un anticorp specific pentru TH (Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) la 4 grade peste noapte. Lamele au fost apoi spălate cu PBS, incubate cu un anticorp secundar cuplat la Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_1500889) și supuse la spălări suplimentare cu PBS.

După finalizarea imunomarcarii pentru b III-tubulină sau TH, lamele au fost incubate cu 5 mg/ml 49,69-diamidino{-2-fenilindol (DAPI; catalog #D9542) în PBS timp de 5 minute. Lamele au fost apoi spălate cu PBS și lamelele au fost montate folosind mediu de montare Fluoromount G (Southern Biotech, catalog #0100-01).

Pentru experimentele care implică neuroni simpatici supuși retragerii NGF, lamele au fost blocate timp de 1 oră prin incubare la temperatura camerei într-un tampon format din ser normal de capră (Life Technologies) și 0.0005% Triton X-100 în PBS, urmată de incubare în soluție de anticorp primar care conține Tuj1 anti-șoarece de șoarece (1:1000, Covance) peste noapte la 4 grade. Ulterior, lamele au fost clătite cu PBS, incubate timp de 1 oră în IgG de capră anti-șoarece Alexa Fluor 488 (1:800, Invitrogen) și 0,1 mg/ml Hoechst 33342 (Invitrogen) în tampon de blocare, supuse la clătiri suplimentare cu PBS și lăsate. să se usuce. Lamele au fost montate cu Fluoromount-G (Southern Biotech, catalog #0100-01) și depozitate la temperatura camerei.

Diapozitivele care conțin celule LUHMES au fost vizualizate cu un obiectiv 20 al unui sistem de microscop inversat Nikon Eclipse II Ti-U cu o sursă de lumină LED Lumencor Mira 4-Channel. 1280 1024-Imaginile în pixeli au fost capturate folosind o cameră CCD Nikon DSQi1Mc de 5 MP și NIS Elements 3.22.15 (Build 738). Cu excepția cazurilor în care se indică altfel, toate imaginile cu contrast de fază au fost capturate utilizând setări de intensitate a luminii și timp de expunere care au produs o intensitate medie a fundalului de 165 în imagini de 8-biți.

Pentru a reduce umbrirea fundalului sau alte inconsecvențe, înainte de fiecare sesiune de microscopie, o imagine a unui godeu gol a fost capturată și utilizată pentru corectarea fundalului în timpul imagistică a celulelor LUHMES. Diapozitivele care conțin neuroni simpatici cultivați la Eastern Kentucky University sau la Universitatea Virginia au fost fotografiate folosind un sistem de microscop Zeiss LSM 800 sau, respectiv, un sistem de microscop Zeiss LSM 980. Imaginile au fost capturate la o mărire de 20 și la rezoluție 1024 1024 folosind software-ul Zen (Carl Zeiss Microscopy).

Analiza viabilității celulare

Culturile de celule LUHMES diferențiate au fost stabilite pe lame de cameră cu opt godeuri Lab Tek II care au fost acoperite așa cum este indicat cu diferite substraturi. O schimbare de mediu de 50% a fost efectuată la fiecare 48 de ore, iar celulele au fost fixate cu 4% PFA în PBS în a șasea zi de diferențiere. Lamele care conțin celule fixe au fost supuse colorării cu DAPI, iar imaginile colorării nucleare au fost capturate cu un sistem de microscop inversat Nikon Eclipse II Ti-U și o cameră CCD Nikon DS-Fi1 5 MP.

Celulele au fost calificate ca fiind sănătoase sau nesănătoase de către un investigator orb pe baza aspectului nucleelor. Celulele cu arie nucleară scăzută sau fragmentare nucleară au fost calificate ca nesănătoase. Numărul de celule sănătoase per imagine a fost punctat pentru cel puțin cinci câmpuri de vedere per condiție în fiecare experiment.

măsurători DI

Măsurătorile DI tradiționale au fost efectuate folosind un pachet Fiji Is Just ImageJ (FIJI) care conține ImageJ 1.52p printr-o metodă care implică parametri larg citați pentru analiza DI (Shin și colab., 2012; Di Stefano și colab., 2015; Sasaki și colab., 2016; Loreto și colab., 2020; Shin și Cho, 2020). Imaginile de opt biți ale celulelor LUHMES diferențiate cu tracturi axonale bine separate au fost supuse binarizării folosind algoritmul de binarizare implicit, cu opțiuni binare configurate pentru a produce o imagine cu celule negre în prim plan și un fundal alb.

Instrumentul de desen cu mâna liberă a fost folosit pentru a trasa manual toate regiunile imaginii cu corpuri celulare, iar toți pixelii negri au fost convertiți în alb în regiunile urmărite. Instrumentul Măsurare al ImageJ a fost aplicat pentru a măsura suprafața neagră totală a imaginilor binarizate care prezintă exclusiv neuriți. Instrumentul Analizați particule a fost apoi aplicat folosind o setare de dimensiune de 20–10,000 pixeli și o setare de circularitate de 0,2–1,0 pentru a detecta fragmente de neurite. Suprafața însumată a tuturor fragmentelor de neurite a fost apoi împărțită la aria neagră totală pentru a calcula DI a imaginii.

Pentru experimentele legate de optimizarea parametrilor de dimensiune pentru identificarea fragmentelor de neurite, au fost utilizate criteriile de circularitate de {{{0}}.2–1.00 pentru toate măsurătorile de particule. Pluginul Particle Remover (versiunea 20{{10}}4/02/09), dezvoltat de Wayne Rasband, a fost obținut de la https:// imagej.nih.gov/. Acolo unde a fost indicat, aplicarea pluginului Particle Remover folosind parametrii de dimensiune de 0–9 pixeli și parametrii de circularitate de 0,0–1,0 a fost efectuată pentru a elimina obiectele mici, non-neurite din imaginile binarizate obținute din micrografii cu contrast de fază.

În mod similar, parametrii de dimensiune de {{0}}-4 pixeli și parametrii de circularitate de 0-1,0 au fost utilizați pentru a elimina obiectele mici din imaginile binarizate obținute din micrografii cu fluorescență reprezentând imunocolorarea b III-tubulină. Dacă nu se indică altfel, înainte de analiza DI, toate imaginile cu contrast de fază au fost supuse îmbunătățirii contrastului prin utilizarea ImageJ pentru a aplica un tabel de căutare (LUT) cu minimum 90 și maxim 205.

Măsurarea fragmentării artificiale

Culturile care conțin celule LUHMES sănătoase au fost fixate cu 4% PFA în a șasea zi de diferențiere și imunomarcate pentru b III-tubulină. Folosind un obiectiv de 20 de obiective, au fost capturate micrografii cu contrast de fază de pixeli și micrografii cu fluorescență, fiecare ilustrând câmpuri vizuale identice, din regiuni prelevate aleatoriu. Un total de zece seturi de imagini au fost capturate din nouă culturi separate.

ImageJ a fost folosit pentru a genera copii binarizate ale micrografiilor originale cu contrast de fază și fluorescență, precum și copii ale micrografiilor cu contrast de fază care au fost binarizate după îmbunătățirea contrastului prin aplicarea unui LUT cu minimum 90 și maxim 205. Pentru fiecare set de imagini, un investigator orb a identificat o regiune mică de 150 150-pixeli a micrografiei originale cu contrast de fază, prezentând exclusiv neurite sănătoase și intacte.

Mărimea regiunii și coordonatele au fost apoi stocate în managerul regiunii de interes (ROI) al ImageJ și utilizate pentru a efectua măsurători DI în regiuni analoge ale imaginilor binarizate din același set de imagini. Măsurătorile DI au fost efectuate folosind metoda tradițională, cu parametrii de dimensiune a fragmentului de 20 -10,000 pixeli. Deoarece toate regiunile măsurate conțineau exclusiv neuroni intacți, orice fragmente detectate au fost considerate fragmente artificiale.

ANDI Macrocomandă

Macro-ul ANDI a fost scris folosind limbajul ImageJ Macro. Macro-ul prezintă o serie de operații care permit utilizatorului să selecteze căi pentru trei directoare, un director care conține imagini ale neuronilor imunomarcați pentru un marker neuronal, cum ar fi b III-tubulină, un al doilea director care conține imagini corespunzătoare care ilustrează colorarea nucleară și un al treilea director. desemnat pentru salvarea fișierelor cu rezultate. Zonele de fragment și zonele totale de neurite ale imaginilor din directoarele selectate sunt apoi calculate printr-o serie de operații ImageJ. Pe scurt, o imagine care prezintă etichetarea nucleară este deschisă, supusă îmbunătățirii contrastului și binarizată. Pluginul de îndepărtare a particulelor este folosit pentru a elimina artefacte mici, nenucleare, din imaginea binarizată, iar imaginea binarizată este supusă unei serii de dilatări și eroziuni.

O imagine corespunzătoare a celulelor imunomarcate pentru b III-tubulină (sau alt marker neuronal) este deschisă și supusă îmbunătățirii contrastului. Imaginea binarizată care prezintă nuclei celulari măriți este apoi scăzută din imaginea cu celule imunomarcate pentru tubulina b III, generând astfel o imagine care prezintă exclusiv neurite. Imaginea de neurită este apoi binarizată și supusă eliminării particulelor între 0 și 4 pixeli. Aria fragmentului Neurite este calculată prin aplicarea algoritmului Analiză particule pentru a măsura particulele cu o circularitate între 0.2 și 1.0 și dimensiunea între 5 și 10,0000 pixeli. Suprafața totală de neurite este calculată prin aplicarea instrumentului Măsurare pentru a calcula suprafața neagră totală. O imagine care înfățișează zona de neurită binarizată cu fragmente evidențiate este salvată într-un director desemnat de utilizator, împreună cu fișierele .csv care raportează zona de neurită fragmentată și măsurătorile totale ale zonei de neurite.

În plus față de operațiunile menționate mai sus, mai multe operațiuni suplimentare sunt incluse în macro pentru a sprijini ușurința în utilizare și pentru a limita erorile utilizatorului. Acestea includ funcții care elimină informațiile de scară din imagini și asigură că măsurătorile sunt obținute în unități de pixeli; configurați setările de culoare ImageJ și opțiunile binare pentru scăderea și binarizarea corespunzătoare a imaginii; verificați dacă directoarele selectate pentru imaginile cu colorarea b III-tubulină și colorarea DAPI conțin un număr egal de imagini; închideți imaginile utilizate anterior pentru a îmbunătăți timpul de procesare; rezultate clare din analizele anterioare înainte de efectuarea unor noi analize; și preveniți erorile asociate cu crearea fișierului .ini de către Windows 10.

Pentru experimentele care implică analize ale neuronilor simpatici, Macro-ul ANDI a fost revizuit pentru a include o operație care prezintă o casetă de dialog care permite utilizatorului să controleze numărul de ori în care imaginile binarizate ale nucleelor ​​vor fi dilatate. Versiunea ANDI care include această revizuire a fost numită ANDI v1.1. Schimbarea valorii din caseta de dialog la un număr mai mare crește dimensiunea de eliminare a somei, în timp ce schimbarea valorii la un număr mai mic scade dimensiunea de îndepărtare a somei. Valoarea implicită este 12, care este numărul de dilatări utilizate pentru toate experimentele care implică celule LUHMES. O valoare de 16 a fost utilizată pentru a elimina regiunile mai mari ale corpului celular în timpul analizelor neuronilor simpatici.

Macro-ul ANDI este open source și disponibil gratuit pentru utilizare sau modificare prin următoarea adresă URL: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. Funcționarea exactă a ANDI a fost verificată folosind mai multe computere personale cu sistemul de operare Windows 10. Un set de imagini cu culturi de celule LUHMES care prezintă diferite grade de degenerare a nevritelor este, de asemenea, disponibil la adresa web menționată mai sus și poate fi utilizat pentru a investiga execuția precisă a macro-ului de către alte tipuri de computere. Adresa web oferă, de asemenea, acces la un protocol care descrie modul de utilizare a macrocomenzii.

Estimări de timp

Pentru a evalua timpul necesar pentru efectuarea manuală a măsurătorilor DI, micrografii cu contrast de fază care ilustrează celule LUHMES care au fost tratate cu soluție vehicul, 2,5 mM 6-OHDA, 5.0 mM 6-OHDA sau 7,5 mM 6-OHDA au fost supuse punctajului DI folosind metode stabilite anterior (Kraemer et al., 2014). Fiecare imagine a fost supusă îmbunătățirii contrastului și binarizării. Instrumentul cu mână liberă a ImageJ a fost apoi folosit pentru a elimina digital toate corpurile celulare reprezentate din imaginile binarizate. Instrumentul Analizați particule a fost folosit pentru a măsura fragmente cu o circularitate între 0,2 și 1,0 și o dimensiune între 20 și 10,000 pixeli, iar instrumentul Măsurare a fost folosit pentru a determina suprafața totală de neurite.

Valorile despre zona de neurită fragmentată și zona totală de neurite au fost transferate într-o foaie de calcul în Microsoft Excel și a fost utilizată o operație matematică în Excel pentru a calcula scorurile DI. După ce o imagine a fost deschisă cu ImageJ, a fost măsurat timpul necesar pentru a efectua manual fiecare dintre aceste proceduri. Timpul mediu de analiză a fost calculat din 36 de imagini totale. Imaginile au fost obținute din nouă preparate independente de cultură celulară și analizele au fost efectuate folosind o imagine per condiție de tratament din fiecare preparat de cultură celulară. Pentru a determina viteza măsurătorilor DI efectuate folosind Macro-ul ANDI, aceleași seturi de imagini au fost utilizate pentru a determina timpul necesar pentru a deschide macro-ul în ImageJ, a rula operațiunile macro, a transfera datele într-o foaie de calcul Excel și a calcula DI.

Statistici

Comparațiile cantitative sunt prezentate sub formă de diagrame cu casete și mustăți, unde linia din mijloc reprezintă mediana, casetele se extind până la percentilele 25 și 75, iar mustățile reprezintă percentilele 5 și 95. Mediile au fost comparate statistic în GraphPad Prism 9.1.2 prin măsuri repetate ANOVA cu comparații post-hoc folosind o corecție Sidák. Normalitatea datelor cantitative a fost testată folosind testul Shapiro-Wilk din IBM SPSS 26.

Când ipoteza de normalitate a fost încălcată (Fig. 1C, 3D), comparațiile de grup au fost efectuate prin testul Friedman neparametric cu testul Dunn efectuat pentru comparații post-hoc. Analizele corelaționale sunt descrise ca diagrame de dispersie și includ linii de cea mai bună potrivire. Astfel de relații au fost analizate folosind corelațiile produs-moment Pearson sau r-ul lui Spearman atunci când ipoteza normalității a fost încălcată. Normalitatea reziduurilor pentru analiza corelațională a fost evaluată prin inspecția vizuală a graficelor QQ corespunzătoare.

Coeficienții de corelație produs-moment Pearson au fost comparați între ei folosind testul z asimptotic al lui Steiger (Steiger, 1980; Lee și Preacher, 2013). Nu au fost excluse valori aberante. Semnificația statistică a fost acceptată la p, 0,05. Valorile P sunt rotunjite la patru zecimale și raportate în textul principal. Mărimile efectului și intervalele de încredere de 95% sunt, de asemenea, raportate pentru analizele parametrice, cu dimensiunile efectului descrise în textul principal și intervalele de încredere enumerate în Tabelul 1.

Disponibilitatea datelor

Date suplimentare despre acest articol vor fi partajate la cerere rezonabilă.

Accesibilitatea codului

Codul/software-ul descris în lucrare este disponibil gratuit online la https://github.com/kraemerb/kraemerlab. Codul este disponibil ca date extinse 1.

For more information:1950477648nn@gmail.com