R. Vesicarius L. exercită efect nefroprotector împotriva stresului oxidativ indus de cisplatină
Mar 26, 2022
Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Md. Mahmudul Hasan1, Cel mai. Sayla Tasmin2, Ahmed M. El-Shehawi3, Mona M. Elseehy4, Md. Abu Reza1și Ariful Haque2*
Abstract
Fundal:Cisplatina este un medicament anticancer remarcabil, dar utilizarea sa a fost redusă remarcabil din cauza nefrotoxicității severe. R. vicarious L. este o legumă cu frunze care este evidentă cu potențial anti-angiogenic, antiinflamator, anti-proliferativ, hepatoprotector și nefroprotector. Prin urmare, acest studiu a fost conceput pentru a inspecta extractul său de metanol (RVE) pentru un posibil efect nefroprotector.
Metode:În primul rând, in vitro, activitatea antioxidantă a RVE a fost confirmată pe baza aptitudinii de captare a radicalilor liberi 2, 2-difenil{-1-picrilhidrazil (DPPH). După aceea, șoarecii masculi Swiss Albino au fost tratați cu cisplatină (2,5 mg/kg) timp de 5 zile succesive pentru a induce nefrotoxicitatea. Recuperarea de la nefrotoxicitate a fost analizată prin tratarea animalelor cu RVE (25, 50 și 100 mg/kg) intraperitoneal (ip) în următoarele 5 zile consecutive. După terminarea tratamentului, șoarecii au fost sacrificați și rinichii au fost colectați. O parte a fost omogenizată în tampon fosfat de sodiu pentru evaluarea nivelului de malondialdehidă (MDA), o altă parte a fost folosită pentru a evalua expresia genei (NQO1, p53 și Bcl-2). Mai mult, capacitatea de neutralizare a peroxidului de hidrogen (H2O2) a RVE a fost evaluată în celule HK-2 in vitro. În cele din urmă, substanțele fitochimice bioactive din RVE au fost determinate utilizând cromatografie gazoasă-spectrometrie de masă (GC-MS).
Rezultate:RVE a arătat activitate antioxidantă in vitro într-un mod dependent de doză, cu o valoare IC50 de 37,39 ± 1,89 ug/mL.
Tratamentul cu RVE (p < {{0}}.05)="" a="" scăzut="" în="" mod="" remarcabil="" conținutul="" de="" mda="" în="" țesutul="" renal.="" în="" plus,="" expresia="" genelor="" nqo,="" p53="" și="" bcl-2="" a="" fost="" atenuată="" semnificativ="" (p="">< 0,05)="" într-o="" manieră="" dependentă="" de="" doză="" datorită="" administrării="" de="" rve.="" rve="" a="" inversat="" în="" mod="" semnificativ="" (p="">< 0,05)="" nivelul="" h2o2="" din="" celulele="" hk-2="" la="" aproape="" normal.="" din="" gc-ms,="" zece="" compuși,="" inclusiv="" trei="" antioxidanți="" cunoscuți="" „4h-pyran-4-unu,="" 2,="" 3-dihidro-3,5-dihidroxi{-6-metil-"="" ,="" „acid="" hexadecanoic”="" și="" „squalen”="" au="" fost="" detectate.="" extractul="" a="" fost="" bogat="" cu="" un="" alcaloid="">
Concluzie:În general, RVE posedă un efect protector împotriva leziunilor renale induse de cisplatină.
Cuvinte cheie:Cisplatină, R. indirect, șoareci, rinichi, celule HK-2, stres oxidativ, genă NQO1
Cistanche deserticola previne bolile de rinichi, click aici pentru a obține proba
Introducere
Stresul oxidativ este rezultatul disproporției dintre formarea speciilor reactive de oxigen (ROS) și mecanismele obișnuite de apărare antioxidantă [1]. Reacțiile biochimice regulate, expunerea frecventă la mediul nefavorabil și aportul crescut de xenobiotice duc la producerea de ROS [1]. ROS interacționează cu resturile de cisteină ale moleculelor de semnalizare sensibile la redox, inclusiv factori de transcripție, protein tirozin fosfataze și protein kinaze; în consecință, oxidarea grupărilor tiol pe aceste reziduuri ghidează la modificări ale proteinelor vizate, acțiuni biologice, capacități de semnalizare, imunitate și paradigme suplimentare de celule vii/moarte [2]. Speciile chimice care conțin oxigen care au proprietăți reactive sunt cunoscute sub numele de ROS, care include radicali liberi și molecule neradicale, cum ar fi superoxidul și respectiv H2O2 [3]. Stresul oxidativ indus de ROS este legat de etiologia a numeroase boli, inclusiv cancerul. Leucemia mieloidă acută (AML) este o creștere canceroasă a celulelor sanguine din măduva osoasă. Evenimentele celulare și moleculare care stau la baza LMA includ deteriorarea ADN-ului, propagarea clonală, moartea celulară crescută și instabilitatea genetică suplimentară, care sunt rezultatul stresului oxidativ indus de ROS [4]. Fiziologia umană a fost dotată cu numeroase mecanisme care pot genera antioxidanți pentru a exercita protecție împotriva stresului oxidativ, ceea ce duce la protejarea celulelor de efectele toxice și servește la prevenirea bolilor [5]. Cu toate acestea, celulele dezvoltă mecanisme endogene pentru a contracara stresul oxidativ și pentru a conserva ROS necesar [6].
NAD(P)H: chinona oxidoreductaza 1 (NQO1) este o flavoenzimă [7] care poate cataliza reducerea cu doi sau patru electroni și utilizează această proprietate pentru a detoxifica chininele [8]. Poate proteja celulele de deteriorarea oxidativă, ținând deoparte ciclul redox și prin reducerea producției de radicali liberi [8]. Pe lângă detoxifierea xenobiotică, NQO1 este, de asemenea, implicat în neutralizarea superoxidului, modularea degradării proteazomale p53 [9], inhibarea Bcl-2 [10] și susceptibilitatea sporită la leziuni celulare [11].
Cisplatin este primul medicament anticancer pe bază de platină aprobat de Food and Drug Administration (FDA) [12]. Cisplatina exercită apoptoză prin inducerea stresului oxidativ și supraexprimarea genei supresoare tumorale p53 [12]. Mai multe efecte adverse, inclusiv nefrotoxicitatea, hepatotoxicitatea, gastrotoxicitatea, ototoxicitatea, mielosupresia și neurotoxicitatea sunt rezultatul stresului oxidativ indus de cisplatină [12]. Aceste efecte secundare au redus în mod remarcabil utilizarea cisplatinei, deși are o activitate anticanceroasă remarcabilă. Cisplatina este bine cunoscută pentru a induce stresul oxidativ și a suprima gena NQO1 la rinichii de șoareci [13]. Prin urmare, căutarea și validarea surselor naturale eficiente de antioxidanți devin o zonă de conștientizare. Aportul de antioxidanți dietetici derivați din plante, cum ar fi flavonoidele, carotenoidele și compușii fenolici, poate duce la protecție împotriva bolilor cardiovasculare, cataractei și cancerului [14].
R. vicarious (Polygonaceae) este cunoscut sub numele de „Takpalong/ Chukapalong/Amlabetom” în bengaleză [15]. Crește în zonele deșertice și semi-deșertice din Asia, Australia și Africa de Nord [16]. Este o plantă pe cale de dispariție puțin studiată în Bangladesh. În Bangladesh, oamenii consumă întreaga plantă ca legumă după ce au gătit cu sare, diferite condimente și ulei. Uneori, oamenii folosesc doar frunzele proaspete din salata mixtă ca alternativă la salata verde. Frunza crudă este ușor acrișă, dar devine foarte acru după gătire. Mai mult, un număr mic de frunze sunt de obicei amestecate în preparatele din pește în timpul gătitului pentru a avea un gust ușor acid.
Această plantă este folosită ca plantă vegetală și medicinală în întreaga lume [17]. Frunzele și semințele sunt folosite ca antidot pentru veninul de șarpe și respectiv de scorpion [17]. În tratamentul popular, R. vicarious a fost folosit de mult timp în tratarea bolilor hepatice, digestiei proaste, constipației, pile, vărsături, flatulență, tulburări cardiace, dureri, tulburări ale splinei, dispepsie, dureri de dinți, bronșită, astm, scabie, leucodermie și laxativ, stomachic, aperitiv, tonic, diuretic și analgezic [18]. Această plantă cuprinde numeroși compuși importanți din punct de vedere biologic, inclusiv flavonoide, antrachinone, carotenoide, vitamine, lipide și acizi organici, care sunt bine cunoscuți ca agenți antioxidanti, antimicrobieni și anticancer [19]. Fiecare parte a acestei plante conține quercetină (flavonoide) într-o cantitate crescută [15]. Această plantă conține 0,25 mg vitamina A, 1,33 mg vitamina C, 2,37 mg vitamina E [15], 3,38 mg flavonoide și 5,66 mg polifenoli [20] la 100 g greutate uscată.
Shahat și colegii [21] au arătat efecte anti-angiogenice și anti-proliferative ale extractului de metanol (80 la sută) din partea aeriană R. indirectă împotriva carcinomului hepatocelular într-un model de șobolan. Un alt studiu a arătat potențialul anti-angiogenic in vitro al extractului de R. vicarious [22]. Extractul metanolic din întregul R. vicarious exercită protecție împotriva hepatotoxicității induse de tetraclorura de carbon in vivo [23]. Efectul antiinflamator la iepuri a fost evident de extractul metanolic de frunze de R. vicarious [24]. Un studiu recent [25] a raportat efectul nefroprotector in vivo al extractului de R. etanolic fracționat vicarioz împotriva toxicității gentamicinei și dicromatului de potasiu.
Ținând cont de informațiile de mai sus, ne-am propus să inspectăm efectul extractelor de R. vicarious (RVE) în ceea ce privește recuperarea de la nefrotoxicitatea indusă de cisplatină prin menținerea expresiei genei NQO1 într-un model animal.
beneficii cistanche pentru sănătate: tratarea bolilor de rinichi
Materiale și metode
Produse chimice și reactivi
Cisplatină și 2, 2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) au fost achiziționate de la SIGMA-ALDRICH (SUA).
Kitul de testare colorimetrică a creatininei (ID produs – 700.460) a fost achiziționat de la Cayman Chemical (SUA). Mediul de Eagle modificat Dulbecco (DMEM), serul fetal bovin (FBS) și antibioticul (10,000 U/mL penicilină și 10,{000 ug/mL streptomicina) au fost achiziționate de la Gibco (Gibco Laboratories, STATELE UNITE ALE AMERICII). Trusa de testare ROS-Glo™ H2O2 și amestecul principal GoTaq® qPCR au fost obținute de la Promega (SUA). Kitul de transcripție inversă TIAN-Script M-MLV a fost achiziționat de la TIANGEN (China) și primeri de la IDT (Integrated DNA Technologies, Malaezia). Toate celelalte substanțe chimice și reactivi utilizați în acest experiment au fost de calitate analitică.
Colectarea probelor de plante și pregătirea extractului
Plantele proaspete de R. au fost achiziționate de la o piață locală din Sonadighi, Rajshahi, Bangladesh. Specimenul de plantă a fost identificat și autentificat de Dr. Ahmad Humayan Kabir, Departamentul de Botanică, Universitatea Rajshahi, Bangladesh. Un exemplar sub bonul nr. 00095 a fost depozitat în herbarul Departamentului de Botanică, Universitatea din Rajshahi. Părțile aeriene ale plantei au fost curățate, uscate la 37 de grade, măcinate până la o pulbere grosieră folosind un uscător electronic și depozitate într-un recipient sigilat la 4 grade. Pulberea fină (10 g) a fost dizolvată în metanol (500 ml). Conținutul a fost sonicat (Soniprep 150, China) la 20 kHz timp de 10 minute. Filtrarea extractului a fost efectuată utilizând hârtie de filtru cu fibră de sticlă (Macherey NAGEL, GmBH, germană) cu aparat de filtrare DURAN (germană). În cele din urmă, filtratul a fost concentrat utilizând un uscător prin congelare (VirTis Benchtop Pro, SP SCIENTIFIC, SUA). Extrasul a fost numit în cele din urmă RVE.
Test de activitate antioxidantă in vitro
Capacitatea antioxidantă in vitro a RVE a fost realizată pe baza eliminării DPPH așa cum s-a descris anterior [26] cu puține modificări. Capacitatea de captare a radicalilor DPPH a RVE a fost evaluată pe baza conversiei culorii violet a DPPH în culoarea galbenă. Amestecul de reacție din fiecare tub de microcentrifugă (2 mL) a constat 950 μL soluție metanolică de radicali DPPH (0,1 mM) și 50 μL RVE din cinci concentrații diferite (200, 500, 1000, 2000 și 4000 ug). /mL metanol) pentru a obține concentrații finale de 10, 25, 50, 100 și 200 ug/mL. Un alt tub care conține 50 μL metanol și 950 μL soluție metanolică de DPPH a fost păstrat ca control. Eprubetele au fost lăsate timp de 30 de minute într-un loc întunecat. Absorbanța amestecurilor a fost luată la 517 nm utilizând spectrofotometrul UV-VIS GENESYS 10S (Thermo SCIENTIFIC, SUA). În cele din urmă, procentul activității de captare a radicalilor (RSA) a fost calculat pe baza decolorării DPPH folosind următoarea formulă procent RSA=[(ADPPH − ARVE)/ADPPH] × 100 unde ADPPH este absorbanța soluției de DPPH (martor) și ARVE este absorbanța soluției de RVE. Concentrația la care RVE a dus la 50 la sută RSA a fost denumită valoare IC50 și a fost calculată folosind un grafic care plasează procentul RSA față de diferite concentrații RVE utilizate.
Animale experimentale și design experimental
Șoarecii masculi albinoși elvețieni de 42 de zile (30–32 g greutate corporală) au fost aclimatizați timp de 1 săptămână înainte de a începe experimentul într-o cameră (temperatura de aproximativ 25 ± 2 grade și ~ 50 la sută umiditate, ciclu întuneric/luminos de 12 ore). Apa potabilă și mâncarea au fost furnizate ad libitum.
Șoarecii au fost separați aleatoriu în opt grupuri (n {{0}}). Primul grup (de control) a fost tratat cu 0,2 mL de 0,9 procente NaCl. Următoarele patru grupuri au fost tratate cu cisplatină la 2,5 mg/kg timp de 5 zile la un interval de 24 de ore. După administrarea de cisplatină, un grup (al doilea grup) a fost lăsat fără niciun tratament suplimentar și a fost desemnat ca grup de control stresat. Al treilea, al patrulea și al cincilea grup au fost tratați în continuare cu RVE la 25, 50 și 100 mg/kg, respectiv timp de 5 zile. Alte trei grupuri au fost tratate cu RVE numai la 25, 50 și 100 mg/kg, respectiv timp de 5 zile. Cisplatina și RVE au fost dizolvate în apă distilată. Toate tratamentele au fost administrate intraperitoneal. După 24 de ore de la ultimul tratament, animalele au fost eutanasiate în urma luxației cervicale [25]. Apoi peritoneul a fost deschis cu foarfecele, sângele a fost recoltat după puncția inimii și rinichii au fost colectați cu pense. Sângele a fost supus verificării nivelului de creatinine din ser. Rinichii au fost supuși evaluării nivelului de malondialdehidă și a expresiei genelor.
Măsurarea creatininei serice
Creatinina serică a fost măsurată utilizând Kitul de testare colorimetrică a creatininei-700,460 (Cayman Chemical, SUA) urmând protocolul producătorului furnizat împreună cu trusa.
Măsurarea peroxidării lipidelor renale
Malondialdehida (MDA) este un produs final al peroxidării lipidelor în țesutul renal și este de obicei măsurată ca un indicator al producției de ROS. Cu toate acestea, nivelul MDA a fost măsurat în țesutul renal conform unui studiu anterior [27]. La început, țesutul renal a fost omogenizat în tampon fosfat de sodiu (0,1 M, pH 7,4). O soluție de reacție cuprinzând 0,8 procente acid tiobarbituric (1,5 ml), 8,1 procente SDS (200 μL), 20 procente (pH 3,5) acid acetic (1,5 ml) și dH2O (600 μL) a fost adăugată la 100 ml. μL de țesut omogenizat, iar amestecul a fost apoi incubat la 95 de grade timp de 1 oră. După răcire, amestecurile au fost centrifugate la 10,000 g timp de 10 minute la 4 grade și absorbanța supernatantului a fost măsurată la 532 nm cu standard 1, 1, 3, 3- tetrametoxi propan. Cantitatea de proteină totală a fost măsurată utilizând kitul Bradford Protein Assay (BIO-RAD, SUA) și comparând-o cu albumina serică bovină standard (BSA). Intensitatea peroxizilor lipidici a fost articulată ca nanomoli (nM) de MDA per miligram (mg) de proteină.
Reacție în lanț a polimerazei în timp real (PCR în timp real)
PCR în timp real a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [28, 29]. ARN total din țesutul renal a fost izolat folosind reactiv TRIzol® (Invitrogen) conform protocolului furnizat de producător. ARN-ul izolat (1 ug) a fost apoi transformat în cADN. În primul rând, 2 μL hexamer aleatoriu (10 μM), 2 μL dNTPs (10 mM), 1 ug ARN și HO fără nuclează până la 15 μL au fost prelevați și incubați timp de 5 minute la 70 de grade. Amestecul a fost pus instantaneu pe gheață timp de 2 minute. Apoi s-au adăugat 4 μL de tampon primar (5x) și 1 μL de transcriptază inversă M-MLV în fiecare tub și s-au incubat timp de 10 minute și 50 de minute.
min la 25 de grade, respectiv 42 de grade. În cele din urmă, enzima de transcriptază inversă M-MLV a fost inactivată prin incubarea amestecului la 95 de grade timp de 5 minute. Produsele cADN sintetizate au fost supuse la PCR în timp real pentru cuantificarea expresiei genelor NQO1, p53 și Bcl-2 folosind primeri specifici (Tabelul 1). Fiecare reacție (10 μL) a fost efectuată în trei exemplare, cuprinzând 5 μL GoTaq qPCR Master Mix (2x) (Promega, SUA), 0,5 μL (10 mM) din fiecare primer, 3 μL apă fără nuclează și 1 μL ADNc în plăci de reacție 48-godeuri. Ciclul termic a fost efectuat folosind o mașină PCR în timp real (Eco™ Real-Time PCR System, Illumine®, SUA) cu următoarele condiții de ciclism: 95 de grade timp de 10 minute, urmate de 40 de cicluri de 95 de grade timp de 30 de secunde, 50 de grade pentru 30 de secunde și 72 de grade pentru 25 de secunde. Specificitatea reacțiilor PCR a fost confirmată prin analiza curbei de topire la 95 grade timp de 15 s, 45 grade timp de 15 s și 95 grade timp de 15 s. Specificitatea reacțiilor PCR a fost confirmată prin analiza curbei de topire la 95 grade timp de 15 s, 45 grade timp de 15 s și 95 grade timp de 15 s. Cuantificarea relativă a expresiei genei a fost efectuată folosind gena GAPDH endogenă ca control pe baza metodei ΔΔCq.
Cultură și tratament celular
Linia celulară epitelială a tubului renal proximal uman, celulele HK-2, a fost menținută în DMEM suplimentat cu 10% FBS și antibiotice (50 U/ml de penicilină și 50 ug/ml streptomicina) într-un incubator cu 5% CO2 și 95%. procent de umiditate la 37 de grade.
Test de măsurare a H2O2
Nivelul de H2O2 din celulele HK-2 a fost estimat utilizând kitul de testare ROS-Glo™ H2O2 (Promega, SUA) conform protocolului furnizat de producătorul trusei. Celulele HK-2 (1000 de celule) în 70 μL DMEM au fost plasate în godeurile plăcii de microtitrare 96-godeurilor. După ce a permis atașarea celulelor pe suprafața peretelui, 10 μL DMEM din godeurile plăcii de microtitrare au fost înlocuiți cu 10 μL cisplatină (25 μM în DMEM) și s-au păstrat într-un incubator timp de 12 ore. Apoi, s-au adăugat 10 μL RVE pentru a obține concentrațiile finale de 125, 250 și 500 ug/mL în DMEM și s-au incubat încă 12 ore. După aceea, în fiecare godeu s-au adăugat 20 μL de soluție de substrat H2O2 și 100 μL de soluție de detectare ROS-Glo™. Reacția a fost incubată la temperatura camerei timp de 20 de minute. În cele din urmă, luminiscența a fost măsurată folosind luminometrul GloMax (Promega, SUA).
Analiza GC-MS
Analiza GC-MS a RVE (dizolvată în metanol) a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [30] utilizând GCMS-QP202{0 (SHIMADZU) care cuprinde un auto-sampler (AOC{ {5}}s), un auto-injector (AOC-20i) și un cromatograf de gaze (GC{-2010 Plus) interfațate cu un spectrometru de masă echipat cu un SH-Rxi{{1{{ 37}}}}Coloană capilară Sil MS (30 m × 0,25 μm ID × 0,25 μm DF). Gazul purtător Heliul a fost menținut la un debit constant de 1,72 ml/min și un volum de injecție de 5 μL a fost supus cu un raport de împărțire de 10:1. Temperatura injectorului a fost menținută la 220 de grade, temperatura sursei de ioni a fost de 280 de grade, temperatura cuptorului a fost programată de la 80 de grade (țin 2 minute), cu o creștere de 5 grade/min la 150 de grade (timp de menținere 5,0). min), apoi 5 grade/min până la 280 grade, terminând cu o izotermă de 8 min la 280 grade. Spectrele de masă au fost luate la 1,5 kV cu un interval de scanare de 0,5 s și proba a fost rulată într-un interval de 45-350 m/z. Întârzierea solventului a fost de la 0 la 3 minute, iar timpul total de rulare GC-MS a fost de 55 de minute. Concentrația relativă a compușilor detectați a fost măsurată prin compararea zonei sale medii de vârf cu suprafața totală. Interpretarea spectrului de masă în GC-MS a fost efectuată utilizând bazele de date ale Institutului Național de Standarde și Tehnologie (NIST), inclusiv NIST08, NIST08s și NIST14.
analize statistice
Analizele statistice au fost efectuate prin ANOVA în urma testului T3 al lui Dunnett folosind software-ul IBM SPPS (versiunea 20). Datele sunt articulate ca medii ± abaterea standard (SD). Comparația semnificativă a fost luată în considerare la p<0.05. all="" of="" the="" graphs="" were="" prepared="" using="" microsoft="" excel="" (version="">
Rezultate
Test de activitate antioxidantă in vitro
Deși anterior RVE a fost raportat ca având activitate antioxidantă, am verificat din nou activitatea antioxidantă a extractului nostru folosind capacitatea de captare a radicalilor liberi DPPH. RVE a neutralizat DPPH în funcție de doză (Fig. 1). RVE a evidențiat o activitate antioxidantă considerabilă in vitro și valoarea IC50 calculată a RVE a fost de 37,39 ± 1,89 ug/mL.
Măsurarea creatininei serice
Nivelul creatininei serice la șoareci a fost semnificativ crescut (p <{{0}},05) după="" administrarea="" de="" cisplatină="" (tabelul="" 2).="" tratamentul="" cu="" rve="" a="" ameliorat="" în="" mod="" remarcabil="" (p="">< 0,05)="" nivelul="" creatininei="" într-un="" mod="" dependent="" de="" doză="" (tabelul="">
Măsurarea peroxidării lipidelor renale
Comparativ cu controlul, cisplatina a crescut considerabil (p < {{0}},05)="" conținutul="" de="" mda="" în="" țesutul="" renal="" al="" șoarecilor="" (tabelul="" 3).="" în="" schimb,="" tratamentul="" cu="" rve="" a="" readus="" în="" mod="" considerabil="" mda="" la="" normal="" (p="">< 0,05),="" într-un="" mod="" dependent="" de="" doză="" (tabelul="">
PCR în timp real
Cisplatina a scăzut semnificativ (p <{{0}}.05) expresia="" arnm="" nqo1="" de="" 0.15-ori="" și="" a="" crescut="" arnm="" p53="" și="" bcl{-2="" expresie="" cu="" 24,="" respectiv="" 4.2-ori="" (fig.="" 2).="" rve="" a="" atenuat="" considerabil="" (p=""><0.05) expresia="" arnm="" a="" nqo1,="" p53="" și="" bcl{-2="" într-un="" mod="" dependent="" de="" doză="" (fig.="" 2).="" în="" comparație="" cu="" singurul="" grup="" tratat="" cu="" cisplatină,="" expresia="" arnm="" nqo1="" a="" fost="" crescută="" de="" 3,57,="" 6,36="" și="" 9,28-ori="" la="" 25,="" 50="" și="" 100="" mg/kg="" rve,="" respectiv="" (fig.="" 2a).="" din="" nou,="" expresia="" arnm="" p53="" a="" fost="" scăzută="" de="" 0,63,="" 0,46="" și="" 0,21-ori="" la="" 25,="" 50="" și,="" respectiv,="" 100="" mg/kg="" rve="" (fig.="" 2b).="" expresia="" arnm="" bcl-2="" a="" fost,="" de="" asemenea,="" redusă="" de="" 0,71,="" 0,40="" și="" 0,32-ori="" la="" 25,="" 50="" și,="" respectiv,="" 100="" mg/kg="" rve="" (fig.="" 2c).="" dar,="" nu="" s-au="" găsit="" modificări="" semnificative="" (p=""> 0,05) în nivelul de expresie al genelor NQO1, p53 și Bcl-2 din cauza tratamentului cu RVE (Fig. 3).
H2O2test de măsurare
În testul de măsurare a H2O2, H2O2nivelul a fost considerat proporțional cu luminiscența. Administrarea de cisplatină în mod semnificativ (p < {{0}}.05)="" a="" crescut="" nivelul="" h2o2="" de="" 2,2-ori="" (fig.="" 4).="" tratamentul="" cu="" rve="" a="" scăzut="" considerabil="" (p="">< 0.05)="" nivelul="" h2o2="" de="" 0,25,="" 0,38="" și="" 0,49-ori="" la="" 125,="" 250="" și="" 500="" ug/ml,="" în="" mod="">
Analiza GC-MS
Un total de 10 compuși (Tabelul 4 și Fig. 5) inclusiv „Izoborneol, pentametildisilanil eter (alcool sesquiterpenic)”, „Timină (nucleobază pirimidină)”, „4H-Py-ran-4-unu, 2,{{{ 8}}dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil- (saponină)", „Acid hexadecanoic, ester metilic (ester metilic al acizilor grași)”, „9,12- Acid octadecadienoic, ester metilic (ester metilic al acizilor grași)", „9-Acidul octadecenoic (Z)-, ester metilic (ester metilic al acizilor grași)", „Stearat de metil (ester metilic al acizilor grași)", „Ftalat de diizooctil (ester)”, „13-Docosenamidă, (Z)- (alcaloid)” și „Squalen (triterpenă)” au fost detectate în RVE.
beneficii cistanche tubolosa: scaderea lipidelor din sange
Discuţie
Antioxidanții naturali și sintetici au fost studiați cuprinzător și s-au dovedit a fi funcționali fie pentru prevenirea, fie pentru ameliorarea toxicității în fiziologia animală [31]. Suplimentele antioxidante sunt componenta dezvoltată fie prin sinteză chimică, fie prin extracție din alimente naturale, dar acestea nu sunt identice ca compoziție cu antioxidanții disponibili în alimente [5]. Prin urmare, opiniile sunt separate în timp, dacă antioxidanții sintetici oferă sau nu beneficii similare pentru sănătate ca și antioxidanții naturali [32]. Apare nevoia de a reduce utilizarea suplimentelor antioxidante sintetice și de a căuta surse alternative, ieftine, regenerabile, naturale și, eventual, mai sigure de antioxidanți naturali eficienți.
Unul dintre cele mai importante mecanisme este calea factorului nuclear eritroid-2 factorul-2 (Nrf2) care protejează în general celulele de stresul oxidativ indus de factorii de stres exogeni sau endogeni [27]. Antioxidanții eficienți induc expresia Nrf2, care se deplasează în continuare în nucleu și se leagă de elementul de răspuns antioxidant (ARE) care provoacă expresia genei de detoxifiere și antioxidante de faza II NQO1 [33, 34]. NQO1 este exprimat pe scară largă și diferențial într-o manieră specifică țesutului. NQO1 este o flavoproteină antioxidantă citosolică care catalizează 2-reducerea de electroni a chinonelor la hidrochinone, ducând la detoxifierea electrofililor și anticiparea ciclului redox [35]. Conform unui studiu anterior [36], -lapachona activează NQO1, care crește în continuare nivelul intracelular de NAD plus și protejează rinichiul de leziunile acute induse de cisplatină.
Se știe că cisplatina a indus deteriorarea membranei de filtrare glomerulară prin stres oxidativ, inflamație și apoptoză, care duc în total la reducerea ratei de filtrare glomerulară și la pierderea permeabilității normale a membranei [37]. Prin urmare, nivelul creatininei serice a fost crescut. Creatinina serică este unul dintre potențialii markeri ai funcționalității renale. Tratamentul cu cisplatină a crescut conținutul de MDA în țesutul renal, care este un produs secundar al peroxidării lipidelor și acest raport este constant cu studiile anterioare [27, 35, 37, 38]. Tratamentul cu RVE a redus semnificativ conținutul de MDA în țesutul renal. În același timp, nivelul creatininei a fost, de asemenea, scăzut, indicând efectul de ameliorare al RVE.
În plus, expresia NQO1 a fost semnificativ scăzută, iar expresia p53 și Bcl-2 a fost semnificativ crescută după expunerea la cisplatină. În ceea ce privește expresia NQO1 și p53 in vivo, rezultatul nostru este în concordanță cu un studiu anterior [13]. Un studiu recent [39] a arătat că cisplatina a scăzut semnificativ expresia Bcl-2 în rinichiul șoarecilor, dar, în mod surprinzător, am găsit o expresie crescută. Această diferență poate fi rezultatul diferenței de doză [40], deoarece Mohamed și colegii [39] au folosit 8 mg/kg timp de 12 zile, în timp ce noi am folosit 2,5 mg/kg doar 5 zile. Un alt studiu [41] a afirmat că cisplatina poate crește expresia Bcl-2 la o doză când este necitotoxică. Din nou, expresia crescută a Bcl-2 sensibilizează celulele față de stresul oxidativ [40].
Cu toate acestea, expresia p53 este scăzută în condiții fiziologice normale, dar se așteaptă să fie reglată în sus odată tratată cu cisplatină, deoarece acest agent chimioterapeutic pe bază de platină activează calea apoptotică dependentă de p53. Odată ce am tratat șoarecii cu cisplatină, p53 a crescut semnificativ la rinichii șoarecilor, comparativ cu controlul. O altă proto-oncogenă Bcl-2 este, de asemenea, corelată cu nivelul de expresie NQO1. Imitând expresia p53, am constatat, de asemenea, că nivelurile Bcl- 2 au fost crescute cu tratamentul cu cisplatină, dar s-au recuperat semnificativ după tratamentul cu RVE. Acest lucru este posibil, ca răspuns la stresul oxidativ, gena p53 să fie activată și are ca rezultat oprirea ciclului celular, senescența sau apoptoza [6]. Odată cu detoxifiere, supraexpresia NQO1 este adesea considerată a fi corelată cu apoptoza în celulele canceroase [10], deși mecanismul de bază al apoptozei și supraexpresia NQO1 este încă controversat. Mai mult, în carcinomul hepatocelular, supraexpresia NQO1 scade expresia Bcl-2 [10]. Proto-oncogene Bcl- 2 are, de asemenea, p53 ca și corelația cu expresia NQO1. p53 este un factor de transcripție specific secvenței care este activat de numeroase tipuri de stres celular [42], în timp ce supraexpresia Bcl-2 a acționat ca stabilizator mitocondrial al porilor pentru a facilita eliberarea citocromului-c la stresul oxidativ [12]. În cazul nostru, am verificat ambele răspunsuri ale genelor cu tratament cu cisplatină în țesutul renal normal și am găsit expresia crescută a acestora. Tratamentul RVE a revenit expresiei p53 și Bcl-2 la aproape normal într-un mod dependent de doză. Acest tip de abrogare a expresiei Bcl-2 a fost, de asemenea, prezentat utilizând ROS scavenger Trolox [43]. Mai mult, nivelul de H2O2 a fost, de asemenea, crescut semnificativ în celulele HK-2 datorită tratamentului cu cisplatină in vitro. După tratamentul cu RVE, nivelul H2O2 a fost restabilit semnificativ la normal. Acest lucru se datorează probabil efectului tratamentului RVE care a crescut expresia NQO1 [44], care exercită protecție împotriva stresului oxidativ [6].
Cromatograma GC-MS a confirmat existența a zece compuși în RVE. Printre acestea, „4H-Pyran- 4-unu, 2, 3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-”, „Acid hexadecanoic” și „ Squalene” sunt antioxidanți bine-cunoscuți[45–47]. Acești trei compuși au exercitat în totalitate un efect nefroprotector sinergic. Studiile anterioare au raportat, de asemenea, despre inducerea exprimării NQO1 de către vitamina A [48], vitamina C [49], vitamina E [50], flavonoide [51] și polifenoli [50]. Prin urmare, acest raport sugerează elucidarea dacă acest extract special conține ceva dintre vitamina A, vitamina C, vitamina E, flavonoide și polifenoli sau nu.
Concluzie
Constatarea generală sugerează că RVE este eficientă din punct de vedere fiziologic în protejarea rinichilor de deteriorarea indusă de cisplatină. Prin urmare, este crucial să se elucideze compușii exacti responsabili pentru atenuarea nefrotoxicității induse de cisplatină, care poate deveni benefică pentru aplicarea umană.
Mulțumiri
Autorii sunt recunoscători Consiliului de Cercetare Științifică și Industrială din Bangladesh (BCSIR), filiala Rajshahi pentru că a oferit suport de laborator pentru cuantificarea ARN.
Contribuții ale autorilor
MMH a efectuat design experimental, experimentare, analiza și pregătirea datelor, scrierea și editarea manuscrisului, revizuirea și redactarea manuscrisului; MST & MME au efectuat experimente și analize de date; AME & MAR au contribuit în supraveghere și resurse; AH a fost responsabil pentru conceptualizare, supraveghere, resurse și editarea manuscriselor. Toți autorii
a revizuit manuscrisul. Autorii au citit și au aprobat manuscrisul final.
Finanțarea
Lucrarea actuală a fost finanțată de către Cercetătorii Universității Taif, numărul proiectului de sprijin (TURSP - 2020/75), Universitatea Taif, Taif, Arabia Saudită.
Disponibilitatea datelor și materialelor.
Toate datele relevante sunt disponibile și pot fi furnizate la cererea autorului corespunzător.
Declarații
Aprobarea etică și acordul de participare
Etica pentru realizarea acestui experiment a fost aprobată de Comitetul instituțional pentru animale, etică medicală, biosecuritate și biosecuritate (IAMEBBC), Institutul de Științe Biologice (IBSc), Universitatea din Rajshahi și a fost furnizată sub nota numărul 31/{{1} }IAMEBBC/IBSc. Toate metodele au fost efectuate conform ghidurilor și reglementărilor furnizate de comitetul de etică menționat mai sus. Acest studiu a fost realizat în conformitate cu ghidurile ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). „Consimțământul pentru participare” nu se aplică pentru acest studiu.
Detalii autor
1 Laboratorul de biologie moleculară și știință a proteinelor, Departamentul de Inginerie Genetică și Biotehnologie, Facultatea de Științe ale Vieții și Pământului, Universitatea Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladesh. 2Laboratorul de patologie moleculară, Institutul de Științe Biologice, Universitatea Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladesh. 3Departamentul de Biotehnologie, Colegiul de Științe, Universitatea Taif, PO Box 11099, Taif 21944, Arabia Saudită. 4Departamentul de Genetică, Facultatea de Agricultură, Universitatea Alexandria, Alexandria 21545, Egipt.
Referințe
1. Bagchi K, Puri S. Radicali liberi și antioxidanți în sănătate și boală: o revizuire. East Mediterr Health J. 1998;4:350–60.
2. Koh EM, Lee EK, Song CH, Song J, Chung HY, Chae CH și colab. Ferulatul, o componentă activă a germenilor de grâu, ameliorează dezechilibrul PTK/PTP indus de stresul oxidativ și inactivarea PP2A. Toxicol Res. 2018;34(4):333–41.
3. Hassan AI, Ibrahim RY. Unele profiluri genetice în ficatul șoarecilor purtători de tumori de ascită Ehrlich sub stresul iradierii. J Radiat Res Appl Sci. 2014;7(2):188–97.
4. Zhou FL, Zhang WG, Wei YC, Meng S, Bai GG, Wang BY și colab. Implicarea stresului oxidativ în recidiva leucemiei mieloide acute. J Biol Chem. 2010;285(20):15010–5.
5. Pham-Huy LA, He H, Pham-Huy C. Radicali liberi, antioxidanți în boală și sănătate. Int J Biomed Sci. 2008;4:89–96.
6. Srijiwangsa P, Na-Bangchang K. Rolurile NAD (P) H-chinona oxidoreductazei 1 (NQO1) asupra progresiei cancerului și a chimiorezistenței. J Clin Exp Oncol. 2017;6:1–6.
7. Siegel D, Yan C, Ross D. NAD (P) H: chinona oxidoreductaza 1 (NQO1) în sensibilitatea și rezistența la chinone antitumorale. Biochem Pharmacol. 2012;83(8):1033–40.
8. Dinkova-Kostova AT, Talalay P. NAD (P) H: oxidoreductaza acceptor de chinonă 1 (NQO1), o enzimă antioxidantă multifuncțională și citoprotecție excepțional de versatilă. Arch Biochem Biophys. 2010;501(1):116–23.
9. Cullen JJ, Hinkhouse MM, Grady M, Gaut AW, Liu J, Zhang YP și colab. Inhibarea dicumarolului NADPH: chinona oxidoreductaza induce inhibarea creșterii cancerului pancreatic printr-un mecanism mediat de superoxid. Cancer Res. 2003;63(17):5513–20.
10. Zhang X, Han K, Yuan DH, Meng CY. Supraexprimarea NAD (P) H: chinona oxidoreductaza 1 inhibă proliferarea celulelor de carcinom hepatocelular și apoptoza indusă prin activarea căii AMPK/PGC-1. ADN Celulă Biol. 2017;36(4):256–63.
11. Zeekpudsa P, Kukongviriyapan V, Senggunprai L, Sripa B, Prawan A. Suprimarea NAD (P) H-chinona oxidoreductazei 1 a crescut susceptibilitatea celulelor colangiocarcinomului la agenți chimioterapeutici. J Exp Clin Cancer Res. 2014;33(1):1– 13.
12. Dasari S, Tchounwou PB. Cisplatina în terapia cancerului: mecanisme moleculare de acțiune. Eur J Pharmacol. 2014;740:364–78.
13. Zhu X, Jiang X, Li A, Zhao Z, Li S. S-Alylmercaptocysteine atenuează nefrotoxicitatea indusă de cisplatină prin suprimarea apoptozei, a stresului oxidativ și a inflamației. Nutrienți. 2017;9(2):166.
14. Matkowski A. Cultură de plante in vitro pentru producția de antioxidanți — o revizuire. Biotechnol Adv. 2008;26(6):548–60.
15. El-Bakry AA, Mostafa HAM, Alam EA. Activitatea antioxidantă a Rumex vicarious L. în stadiul vegetativ de creștere. Asian J Pharm Clin Res. 2012;5:111–7.
16. Rechinger KH. Rumex (Polygonaceae) în Australia: o reconsiderare. Nuytsia. 1984;5:75–122.
17. Shahat AA, Alsaid MS, Alyahya MA, Higgins M, Dinkova-Kostova AT. NAD (P) H: Activitatea inductoră a chinonă oxidoreductazei 1 a unor plante medicinale din Arabia Saudită. Planta Med. 2013;79(06):459–64.
18. El-Hawary SA, Sokkar NM, Ali ZY, Yehia MM. Un profil al compușilor bioactivi ai Rumex vicarious L. J Food Sci. 2011;76(8): C1195–202.
19. Barbosa-Filho JM, Alencar AA, Nunes XP, Tomaz AC, Sena-Filho JG, Athayde- Filho PF, et al. Surse de caroteni alfa, beta, gamma, delta și epsilon: o revizuire a secolului al XX-lea. Rev Bras. 2008;18(1):135–54.
20. Laouini SE, Ouahrani MR. Screening fitochimic, activitate antioxidantă și antibacteriană in vitro a extractului Rumex vicarious L.. Science Study Res: Chem Chem Engi Biotech Food Ind. 2017;18:367–76.
