Contact:jerry.he@wecistanche.com

Lin Bai|Gui‐ying Shi|Ya‐jun Yang|Wei Chen|Lian-feng Zhang|Chuan Qin

Cistanche are efect anti-îmbătrânire

Abstract

fundal: Declinul legat de timp al capacității de regenerare și al homeostaziei organelor este o caracteristică majoră aîmbătrânire. Rehmannia glutinosa și Astragalus membranaceus au fost folosite ca medicamente pe bază de plante tradiționale chinezești pentru o imunitate sporită și o viață prelungită. Cu toate acestea, mecanismul prin care acest medicament pe bază de plante încetinește îmbătrânirea este necunoscut. În acest studiu, am investigat mecanismul plantelorefect anti-îmbătrânire.

Metode: Şoarecii au fost hrăniţi cu diete suplimentate cu R. glutinosa sau A. membranaceus timp de 10 luni; grupul de control a fost hrănit cu o dietă standard. Fenotipurile au fost evaluate folosind un sistem de notare și analiză de supraviețuire. Procentele fenotipurilor de senescență ale celulelor stem hematopoietice (HSC) au fost determinate prin analiza de sortare a celulelor activate de fluorescență. Funcția și mecanismul HSC au fost analizate prin test clonogenic și reacția în lanț a polimerazei în timp real.

Rezultate: Theefect anti-îmbătrânirea R. glutinosa se datorează funcției îmbunătățite a HSC. Șoarecii hrăniți cu R. glutinosa au prezentat caracteristici de încetinireîmbătrânireproces, inclusiv scăderea senescenței și creșterea ratei de supraviețuire. Analiza citometriei în flux a arătat un număr scăzut de celule Lin–Sca1 plus c-kit– (LSK), HSC-uri pe termen lung (LT-HSC) și HSC-uri pe termen scurt (ST-HSC) în grupul R. glutinosa. In vitro, testele clonogene au arătat o capacitate crescută de auto-reînnoire a LT-HSC-urilor din grupul R. glutinosa, precum și menținerea inactivității LSK prin expresia p18 reglată. Grupul R. glutinosa a arătat, de asemenea, niveluri scăzute ale speciilor reactive de oxigen și procentul de celule ‐gal plus prin reglarea în jos a proteinei p53 și p16 asociate senescenței celulare.

Concluzie: Rehmannia glutinosa exercităanti îmbătrânireefecte prin menținerea inactivității și scăderea senescenței HSC.

CUVINTE CHEIE: anti-îmbătrânire, celule stem hematopoietice, liniște, Rehmannia glutinosa

1|INTRODUCERE

Îmbătrânirea este definită ca declinul funcțional dependent de timp care afectează majoritatea organismelor vii.1 Longevitatea organismelor este menținută în principal de celulele stem.2 Celulele stem specifice țesuturilor au capacitatea de auto-reînnoire și se diferențiază într-o varietate de celule efectoare. 3 Cu toate acestea, în timpul procesului de îmbătrânire, această capacitate de auto-reînnoire scade, ducând în cele din urmă la acumularea de țesuturi nereparate, deteriorate în organismele îmbătrânite.4 Pierderea capacității de a menține un echilibru între repaus și diferențiere în celula stem/progenitoare. În plus, studiile recente sugerează că întinerirea celulelor stem poate inversa fenotipul de îmbătrânire.5,6 În sistemul hematopoietic, celulele stem hematopoietice (HSC) sunt responsabile de producerea celulelor sanguine. La șoarecii în vârstă, sistemul hematopoietic prezintă afectarea celulelor limfoide T și B și numărul de celule mieloide este crescut. HSC-urile îmbătrânite au arătat o activitate de auto-reînnoire redusă și o capacitate de reconstrucție redusă a hematopoiezei. În special, modificările legate de vârstă în compartimentul HSC se manifestă în gazda îmbătrânită ca anemie, tendință crescută pentru neoplasme mieloproliferative, scăderea funcției imune și creșterea incidenței cancerului.7-9 Cu toate acestea, mecanismul de îmbătrânire a HSC și efectele medicamentelor din plante asupra îmbătrânirii HSC sunt necunoscute.10

Oamenii s-au preocupat să întârzie procesul de îmbătrânire și să rămână tineri din cele mai vechi timpuri șianti îmbătrânireeste un accent curent al cercetării. Medicina tradițională chineză a primit o atenție din ce în ce mai mare pentru tratamentul diferitelor boli asociate îmbătrânirii. Multe plante medicinale utilizate în medicina tradițională chineză sunt cunoscute că oferă efecte pozitive împotriva îmbătrânirii prin diferite mecanisme. Rehmannia glutinosa și Astragalus membranaceus au fost utilizate pe scară largă în acest mod de mii de ani.

Rehmannia glutinosa este utilizată pentru a trata diverse afecțiuni diabetice, pentru a îmbunătăți metabolismul osos în osteoporoză și pentru a inhiba inflamația și fibroza hepatice. În plus, această plantă are și alte efecte, inclusivanti oboseala, proprietăți antidepresive și neuroprotectoare. În ultimii câțiva ani, studiile farmacologice asupra R. glutinosa și a componentelor sale active s-au concentrat în principal pe acțiunile sale largi asupra sângelui, endocrinului, sistemului cardiovascular și nervos.11-14 Astfel, s-a demonstrat că R. glutinosa posedă o imunitate puternică. ‐activitate de ameliorare, care a oferit baza teoretică pentru studii ulterioare.

Astragalus membranaceus posedă proprietăți tonice, hepatoprotectoare, diuretice și expectorante15 și s-a demonstrat că prezintă imunomodulatoare,16antiinflamator,șiantioxidantefecte.17 Elucidarea mecanismelor moleculare care stau la baza efectelor medicamentelor tradiționale chineze în practica clinică este un pas cheie către aplicarea lor la nivel mondial, iar acest subiect este în prezent un subiect de intens interes de cercetare.

Astfel, în acest studiu, am hrănit diete de șoareci suplimentate cu R. glutinosa și A. membranaceus timp de 10 luni pentru a explora mecanismul care stă la baza capacității R. glutinosa de a crește longevitatea.

2|MATERIALE ȘI METODE

2.1|Gruparea și tratamentul animalelor

Șoarecii femele C57BL/6J au fost menținuți într-un mediu fără patogeni și hrăniți cu o dietă standard. Utilizarea animalelor în acest studiu a fost aprobată de Comitetele de îngrijire și utilizare a animalelor din cadrul Institutului de Știință a Animalelor de Laborator al Colegiului Medical al Uniunii Peking. Șoarecii (în vârstă de 10 luni) au fost împărțiți aleatoriu în trei grupuri (n=20/grup). Grupul de control a fost hrănit cu o dietă standard (Beijing HFK Bioscience, Beijing, China). Dietele celorlalte două loturi au fost suplimentate cu R. glutinosa măcinată și A. membranaceus (Beijing Tong Ren Tang Chinese Medicine, Beijing, China), respectiv, în doză de 200 mg/zi timp de 10 luni. Această doză a fost selectată utilizând metoda de normalizare a suprafeței corporale pentru a confirma dozele de medicament din studiile la om până la studiile la șoarece. Greutatea corporală a fost determinată la fiecare 2 luni și supraviețuirea a fost înregistrată zilnic.

2.2|Evaluarea gradului de senescență

A fost adoptat un sistem de notare pentru a evalua gradul de senescență conform criteriilor definite de Takeda și colab.18 Fiecare categorie enumerată în protocol a fost selectată din semnele clinice asociate cu procesul de îmbătrânire. Fiecare șoarece a fost punctat la vârsta de 18 luni și scorul din fiecare categorie a fost însumat pentru a determina scorul general de notare.

2.3|Citometrie în flux

Celulele au fost recoltate din timus, splină, sânge periferic (PB) și măduvă osoasă (BM). Splina și timusul au fost excizate imediat, spălate cu soluție salină și cântărite. Splinele și timusurile au fost omogenizate ușor într-un omogenizator de sticlă, iar celulele au fost suspendate în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). Celulele din PB au fost aplicate la liza celulelor roșii din sânge (BD Biosciences, San Jose, CA, SUA). Celulele din BM au fost izolate prin spălarea tibiei și a femururilor cu PBS steril. Toate celulele au fost izolate prin filtrare pe o plasă de nailon sterilă și colorate timp de 30 de minute la 4 grade cu următorii anticorpi conjugați cu fluorofor: anti-CD3 conjugat cu ficoeritrină (PE) (G4.18), anti conjugat cu aloficocianină (APC). - CD4 (OX35) și anti-CD8a conjugat cu PE-Cy7 (OX8). Pentru celulele BM, markerii de linie au fost colorați folosind CD4 anti-șoarece conjugat cu biotină (RM4-5), CD5 (53-7.3) CD8a (53-6.7), CD11b (M1/70), B220 (RA3-6B2), TER119 (TER‐119) și Gr1 (RB6‐8C5), urmate de colorarea cu anticorpul APC-eFluor 780-streptavidină conjugată a fost, de asemenea, obținută de la eBioscience (San Diego, CA, SUA). Pentru colorarea suprafeței au fost utilizați următorii anticorpi: imunoglobulina APC (Ig)M (II/41), izotiocianat de fluoresceină (FITC) IgD (11-26), PE‐Cy7 Sca‐1 (D7), PE Flt3 ( A2F10), FITC B220 (RA3-6B2), FITC CD34 (RAM34), PerCP-Cy5.5 CD127 (A7R34), PE CD16/CD32 (93) și PerCP-Cy5.5 CD3e (145-2C11). Toți anticorpii au fost obținuți de la eBiosciences (San Diego, CA, SUA). Datele au fost achiziționate de un FACS

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, SUA) și analizată folosind software-ul FlowJo (Three Star, Ashland, OR, SUA).

2.4|Analiza ciclului celular

Pentru analiza ciclului celular, celulele BM totale au fost colorate pentru markeri de suprafață ale celulelor stem (Lin–Sca‐1 plus c‐KitHigh; LSTKs), apoi fixate și permeabilizate (00‐5123‐43; Becton Dickinson; ) înainte de colorarea cu FITC Ki‐

67 anticorp și 7-aminoactinomicina D (7-AAD). Achiziția datelor a fost efectuată pe FACS Aria II (Becton Dickinson). Datele au fost analizate folosind software-ul FlowJo.

2,5|Colorarea ‐gal asociată senescenței

Activitatea asociată senescenței (SA)--gal a fost de asemenea testată prin citometrie în flux utilizând C12FDG așa cum este descris de producător (Molecular Probes, Eugene, OR, SUA). Pe scurt, celulele stem au fost mai întâi colorate pentru markeri de suprafață celulară și apoi incubate cu 100 nmol L-1 bafilomicina A1 timp de 1 oră la 37 de grade pentru a induce alcalinizarea lizozomală. După spălare cu PBS, celulele au fost incubate cu 2 mmol L-1 C12FDG timp de 1-2 ore la 37 de grade și apoi analizate folosind un FACS Aria I (Becton Dickinson).

2,6|Determinarea producției de specii reactive de oxigen (ROS).

Celulele au fost incubate cu diacetat de dicloro-dihidro-fluoresceină (DCFH-DA; Beyotime, Shanghai, China) la 37 de grade timp de 20 de minute. DCFH-DA difuzează pasiv în celule, unde este deacetilat de esteraze pentru a forma 2′,7′-diclorofluoresceină nefluorescentă (DCFH). Cantitatea de fluorescență emisă se corelează cu cantitatea de ROS din celulă. Datele au fost achiziționate pe un FACS Aria I (Becton Dickinson) și analizate folosind software-ul FlowJo.

2,7|Analiza în timp real a reacției în lanț a polimerazei (PCR).

ARN-ul total a fost extras din celule folosind reactiv TRIzol (Invitrogen, San Diego, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Genele de interes au fost amplificate din ARN-urile totale tratate cu DNază I folosind transcriptază inversă M-MLV (Promega, Madison, WI, SUA)

și primeri poli-dT. Primerii utilizați pentru PCR au fost următorii: p21 (5′‐TCCAGACATTCAGAGCCACA‐3′ și 5′‐CGAAGAGACAACGG- CACACT‐3′, grad Tm=60, 30 de cicluri), p53 (5′‐CATGAACCGCCGACC-TATC‐ 3′ și 5′‐TCCCGGAACATCTCGAGGC‐3′, Tm=62 grad, 35 de cicluri), p16 (5′‐CGAACTCTTTCGGTCGTACCC‐3′ și 5′‐ CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC‐3′, Tm=62 grad, 35 cicluri), p57 (5′‐ AGGAGCAGGACGAGAATCAA‐3′ și 5′‐ TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT‐3′, Tm=61 grad, 30 de cicluri), p19 (5′‐ATGGGTCGCAGGTTCTTGGT‐ 3′ și 5′‐GTAGTGTGGGGTCCTC ′, Tm=61 grad, 35 cicluri), p18 (5′‐GGGACCTAGAGCAACTTACT‐3′ și 5′‐TGACAGCAAAAC- CAGTTCCA‐3′, Tm=61 grad, 30 cicluri), gliceraldehidă 3‐fosfat dehidrogenază (5′‐GAGCGAGACCCCACTAACAT‐3′ și 5′‐TTCACACCCATCACAAACAT‐3′, grad Tm=60, 25 de cicluri). PCR în timp real (RT) a fost efectuată folosind SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo, Kyoto, Japonia) pe sistemul de detectare ABI StepOne™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA).

2,8|Teste clonogene

HSC-urile pe termen lung (LT) au fost sortate prin sortare celulară activată prin fluorescență (FACS) și apoi cultivate în plăci de celule cu 96 de godeuri folosind un mediu pe bază de metilceluloză (HSC007; R&D Systems, Minneapolis, MN, SUA) . Au fost pregătite zece godeuri replicate pentru fiecare probă. Am folosit o placă de cultură celulară cu 96 de godeuri, trei celule per godeu. La două săptămâni după placare, numărul și dimensiunile coloniilor au fost numărate la microscop.

2,9|analize statistice

Datele au fost analizate prin ANOVA unidirecțională utilizând software-ul Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, SUA) și GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, SUA). Datele au fost prezentate ca medie ± SD. P < 0.05="" a="" fost="" considerat="" a="" indica="" semnificație="">

3|REZULTATE

3.1|R. glutinosa și A. membranaceus au exercitat efecte anti-îmbătrânire

Pentru a confirmaefecte anti-îmbătrâniredin R. glutinosa și A. membranaceus, am investigat efectele administrării ca supliment alimentar (200 mg/zi). Ulterior, am înregistrat greutatea corporală, gradul de senescență și rata de supraviețuire a șoarecilor. Greutatea corporală a șoarecilor care se hrănesc cu R. glutinosa sau A. membranaceus a fost normală în comparație cu cei din grupul de control, deși a existat o scădere a greutății corporale a grupului R. glutinosa și A. membranaceus la 20 de luni (Figura 1A). Analiza gradului de senescență a relevat o creștere constantă și ireversibilă a scorului de gradare odată cu înaintarea în vârstă la loturile R. glutinosa și A. membranaceus comparativ cu cea din grupul martor, deși creșterea a fost mai accentuată la A. membranaceus. grup (Figura 1B). Scorul de calificare mare s-a datorat unui debut mai devreme al pierderii pasivității și reactivității, pierderii luciului pielii și a grosierului crescut, căderii părului, leziunilor perioftalmice, lordocifoză crescută a coloanei vertebrale și creșterii mai marcate a severității acestora.18 Șoarecii din A. Grupul de șoareci membranaceus a prezentat caracteristici ale fenotipului senescenței mai marcate, inclusiv pierderea strălucirii pielii și căderea părului. Curbele de supraviețuire au arătat că durata de viață a șoarecilor din grupurile R. glutinosa și A. membranaceus a fost puțin mai lungă decât cea din grupul de control (Figura 1C). Aceste date au confirmatefecte anti-îmbătrânireatât pentru R. glutinosa, cât și pentru A. membranaceus, deși R. glutinosa s-a dovedit a fi mai eficient în încetinirea procesului de îmbătrânire.

FIGURA 1 Rehmannia glutinosa și Astragalus membranaceus au avutefecte anti-îmbătrânire. Șoarecii au fost hrăniți cu diete suplimentate cu R. glutinosa sau A. membranaceus măcinat (200 mg/zi); grupul de control a fost hrănit cu o dietă standard. A, Modificări ale greutății corporale la șoareci măsurate la fiecare 2 luni. B, Modificări ale scorului de gradare a senescenței la șoareci cu vârsta. C, curbe de supraviețuire. Datele reprezintă media ± SD; n=20 șoareci/grup. Datele reprezintă media ± SD; n=5 șoareci/grup.*P <0,05, ***p=""><>

3.2|R. glutinosa a redus numărul de celule stem hematopoietice

Se crede că epuizarea celulelor stem este consecința integratoare a mai multor tipuri de leziuni asociate îmbătrânirii și una dintre cauzele majore ale îmbătrânirii țesuturilor și a organismului.1 Studii recente sugerează că întinerirea celulelor stem poate inversa fenotipul îmbătrânirii la nivel de organism. a emis ipoteza căefecte anti-îmbătrânirede R. glutinosa sunt mediate de îmbunătățirea funcției celulelor stem. Prin urmare, am efectuat analiza citometrică în flux a numărului de celule stem/progenitoare hematopoietice izolate de la șoareci (în vârstă de 20 de luni) alimentați cu diete suplimentate cu R. glutinosa sau A. membranaceus (200 mg/zi) timp de 10 luni (Figura 2A) . Procentul de LSK a fost redus în grupurile R. glutinosa și A. membranaceus (Figura 2B). Numărul de HSC LT și pe termen scurt (ST) a fost redus de aproximativ două ori în grupul R. glutinosa comparativ cu numărul din grupul de control (Figura 2C-D). Un număr mai mare de progenitori limfoizi comuni (CLP) a fost detectat în grupul R. glutinosa în comparație cu numărul din grupul de control (Figura 2I). Nu au existat diferențe în numărul de progenitori multipotenți (MPP), progenitori mieloizi comuni (CMP), progenitori granulocite-macrofagi (GMP) și progenitori megacariocite-eritroizi (MEP) în grupul R. glutinosa, în comparație cu numărul din grupul R. glutinosa. grupul de control. În grupul cu A. membranaceus, nu a existat nicio diferență semnificativă în numărul de LT- și ST- HSC în comparație cu numerele din grupul de control (Figura 2C-D). Mai mult, nu a existat nicio diferență în numărul de celule MPP, CMP, MEP și CLP în comparație cu numerele din grupul de control (Figura 2E, 2F, 2H și 2I); cu toate acestea, numărul de GMP a fost scăzut în grupul A. membranaceus. Astfel, șoarecii hrăniți dietele suplimentate cu R. glutinosa au prezentat un număr scăzut de celule stem hematopoietice și celule progenitoare.

3.3|R. glutinosa a îmbunătățit funcția și a menținut liniștea HSC

Pentru a evalua funcția HSC-urilor, potențialul clonogenic al LT‐ HSC a fost examinat in vitro. Am sortat celulele LT-HSC într-un mediu pe bază de metilceluloză folosind FACS și am numărat numărul și dimensiunea coloniilor după 14 zile. În comparație cu numărul și dimensiunea coloniilor produse de celulele de la șoareci din grupul martor, celulele de la șoareci din grupul R. glutinosa au prezentat o creștere a numărului de colonii, în special pentru dimensiunile mici (P=0.0241 ) și clona de dimensiuni mari (P=0.0418), în timp ce nu a existat nicio diferență în numărul de șoareci din grupul A. membranaceus (Figura 3). Mărimea și numărul crescut de colonii în grupul R. glutinosa a sugerat că această plantă îmbunătățește potențialul de auto-reînnoire al LT-HSC.

Cele mai multe HSC la șoarecii adulți rămân inactiv;19, prin urmare, menținerea inactivității celulare este un mecanism esențial pentru auto-reînnoirea celulelor stem.20,21 Scăderile observate ale HSC sugerează diminuarea proliferării celulare în R. glutinosa și A. grupele membranaceus; prin urmare, am examinat starea ciclului celular al HSC-urilor prin analiza markerului celular proliferativ Ki-67 combinată cu determinarea conținutului de ADN 7-AAD în populația LSK. Am observat un număr crescut de celule LSK în faza G0 în grupurile R. glutinosa și A. membranaceus comparativ cu cel din grupul de control (Figura 4A). Aceste rezultate au indicat că R. glutinosa și A. membranaceus au menținut liniștea HSC.

Analiza PCR în timp real a regulatorilor ciclului celular din celulele LSK a arătat că p18, p19 și p57 au jucat roluri critice în menținerea inactivității HSC.22-24 Nu au fost observate modificări evidente pentru p57 și p19 (Figura 4C- D), iar p18 a fost supraregulat în grupul R. glutinosa în comparație cu cel din grupul de control și ușor supraregulat în grupul A. membranaceus (Figura 4B).

FIGURA 2 Rehmannia glutinosa și Astragalus membranaceus au afectat numărul de celule stem/progenitoare hematopoietice. Șoareci (în vârstă

20 luni) au fost hrăniți cu diete suplimentate cu R. glutinosa sau A. membranaceus (2{00 mg/zi) timp de 10 luni (n=5/grup); grupul de control a fost hrănit cu o dietă standard. Celulele de măduvă osoasă (BM) proaspăt izolate au fost colorate cu anticorpii indicați și analizate prin citometrie în flux. A, Profiluri reprezentative de colorare ale populațiilor de celule stem hematopoietice BM și celule progenitoare. B, Procentul de celule Lin–Sca1 plus celule c-kit– (LSK) în celulele BM. C‐ I, Numerele de celule ale (C) pe termen lung (LT; Lin–, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit , CD34 plus – , Flt3–); D, pe termen scurt (ST; Lin–, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit , CD34 plus plus , Flt3–); E, progenitor multipotent (MPP; Lin– ​​, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit plus , Flt3 plus ); F, progenitor mieloid comun (CMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/ CD32–); G, progenitor granulocite‐macrofag (GMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/CD32 plus ); H, progenitor megacariocite‐eritroid (MEP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit– , CD34–, CD16/CD32–); și eu, progenitor limfoid comun (CLP; Lin– ​​, Sca‐ 1low, c‐ Kitlow, CD127 plus ). Datele reprezintă media ± SD; n=5 șoareci/grup. *P < 0,05,="" **p=""><>

3.4|R. glutinosa a întârziat senescența HSC

Suplimentarea alimentară pe termen lung cu R. glutinosa poate prelungi durata de viață a șoarecilor. Senescența celulară crește odată cu vârsta; prin urmare, am investigat senescența HSC la șoarecii îmbătrâniți prin analiza citometrică în flux a HSC colorate cu SA--gal folosind un substrat fluorescent -gal (C12FDG).25 Procentul de celule SA--gal-pozitive a fost scăzut în Grupul R. glutinosa, indicând faptul că R. glutinosa întârzie senescența celulelor LSK (Figura 5A).

Speciile reactive de oxigen joacă un rol major în senescența HSC, iar pierderea inactivității HSC este frecvent corelată cu creșterea ROS celulare.26 Analiza ROS intracelulare în LSK-uri a arătat că nivelurile au fost scăzute în grupul R. glutinosa comparativ cu cei din grupul de control. grup (Figura 5B). Aceste date au indicat că R. glutinosa poate menține liniștea HSC și poate îmbunătăți funcția HSC prin scăderea nivelurilor de ROS.

Am investigat apoi expresia mai multor gene implicate în senescența celulară prin analiza RT-PCR a celulelor LSK. Comparativ

FIGURA 3 Funcția celulelor stem hematopoietice îmbunătățită prin suplimente alimentare cu Rehmannia glutinosa. Potențialul clonogen in vitro al celulelor stelate hepatice pe termen lung de la șoareci (n=3)

cu grupul de control, expresia proteinelor p53 și p16 asociate senescenței celulare a fost reglată în jos în grupul R. glutinosa (Figura 5D-E). Dar expresia p53 și p16 nu a fost redusă semnificativ între grupul A. membranaceus și grupul de control (Figura 5D-E). Luate împreună, aceste date arată că mai multe gene cheie legate de ciclul celular și senescența celulară reglează funcția HSC la șoarecii hrăniți dietele suplimentate cu R. glutinosa.

3,5|R. glutinosa a sporit imunitatea celulelor B

Limfocitele B și T sunt ambele importante pentru răspunsurile imunologice. Limfocitele T joacă un rol critic în imunitatea celulară și reglarea acesteia, în timp ce limfocitele B participă în principal la imunitatea umorală. Proliferarea limfocitelor este cel mai imediat indice care reflectă imunitatea organică. Pentru a investiga rolul în îmbunătățirea imunologică, au fost examinate efectele R. glutinosa și A. membranaceus asupra proliferării limfocitelor.

Șoarecii din grupul R. glutinosa au prezentat un număr scăzut de HSC și un număr crescut de CLP. Analiza citometrică în flux a arătat un număr crescut de celule B mature (B220 plus) în PB, BM și splină la șoareci din grupul R. glutinosa în comparație cu numerele detectate în grupul de control (Figura 6A); cu toate acestea, nu au existat diferențe semnificative în numărul de celule T (CD4 plus și CD8 plus), monocite și granulocite (CD11b plus) între cele două grupuri (Figura 6B-D). Astfel, aceste rezultate indică faptul că dieta R. glutinosa îmbunătățește imunitatea celulelor B.

FIGURA 4 Suplimentele alimentare de Rehmannia glutinosa și Astragalus membranaceus au menținut liniștea celulelor stem hematopoietice. A, Procentul de celule în fiecare fază a ciclului celular. Analiza citometrică în flux a colorării cu 7-aminoactinomicină D (7-AAD) și Ki-67 a celulelor Lin-Sca1 plus c-kit- (LSK). B, Analiza reacției în lanț a polimerazei în timp real a exprimării genei ale celulelor LSK sortate; GAPDH a fost folosit pentru normalizare. Datele reprezintă media ± SD a trei experimente. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

FIGURA 5 Suplimentarea alimentară cu Rehmannia glutinosa a redus senescența celulelor stelate hepatice (HSC). Șoarecii (în vârstă de 20 luni) au fost hrăniți cu diete suplimentate cu Rehmannia glutinosa sau Astragalus membranaceus (200 mg/zi) timp de 10 luni (n {{4} }}/grup); grupul de control a fost hrănit cu o dietă standard. A, Analiza citometrică în flux a celulelor SA--gal-pozitive Lin-Sca1 plus c-kit- (LSK) folosind un substrat fluorescent de -galactozidază (C12FDG). B, Procentul de celule pozitive ale speciilor reactive de oxigen (ROS) în LSK. Analiza citometrică în flux a LSK-urilor pozitive pentru ROS. Datele reprezintă media ± abaterea standard (SD). *P < 0,05,="" ***p=""><0,001. c,="" modelul="" de="" expresie="" al="" genelor="" asociate="" senescenței="" celulare="" în="" lsk;="" gapdh="" a="" fost="" folosit="" pentru="" normalizare.="" datele="" reprezintă="" media="" ±="" sd="" a="" trei="" experimente.="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

4|DISCUŢIE

În acest studiu, am investigat mecanismulefecte anti-îmbătrânirede R. glutinosa sau A. membranaceus prin completarea dietei șoarecilor cu ierburi în doză de 200 mg/zi timp de 10 luni. S-a descoperit că R. glutinosa prezintă efecte anti-îmbătrânire, inclusiv scăderea senescenței și supraviețuirea crescută a HSC, precum și

imunitatea sporită a celulelor B. În ceea ce privește mecanismulefecte anti-imbatranire, am constatat că R. glutinosa a scăzut numărul de HSC, în timp ce capacitatea de proliferare a crescut. Mai mult, R. glutinosa a menținut liniștea HSC și a scăzut numărul de celule SA--gal-pozitive și nivelurile de ROS prin reglarea p18, p53 și p16. În combinație, rezultatele noastre au confirmat căefecte anti-îmbătrânirede R. glutinosa la șoareci sunt medicate prin menținerea liniei și îmbunătățirea funcției HSC.

Rehmannia glutinosa, care a fost folosită ca medicament tradițional chinezesc pe bază de plante de mii de ani, poate fi utilizată pentru tratarea hipoglicemiei în diferite afecțiuni diabetice.27,28 De asemenea, sa raportat că extractul de R. glutinosa îmbunătățește metabolismul osos.29 În plus, R. glutinosa inhibă răspunsurile și sindroamele inflamatorii30,31 și protejează împotriva daunelor celulare prin eliminarea radicalilor liberi.14,32 În acest studiu, am descoperit că suplimentele alimentare cu R. glutinosa au fost exercitate de șoareci.efecte anti-îmbătrânireși îmbunătățirea imunității celulelor B prin creșterea capacității proliferative a LT-HSC și scăderea numărului de celule SA--gal-pozitive și a nivelurilor de ROS.

S-a descoperit că gradul de deteriorare oxidativă crește odată cu vârsta într-o varietate de celule și țesuturi. Stresul oxidativ este un factor determinant al auto-reînnoirii HSC. Pierderea inactivității LT‐ HSC se corelează frecvent cu creșterea ROS celulară, care este asociată negativ cu auto-reînnoirea HSC.26 Catalpol este un glucozid iridoid, care a fost găsit în rădăcina R. glutinosa. Catalpol a arătat inhibarea stresului oxidativ, deteriorarea ADN-ului și scurtarea telomerilor prin calea PGC‐1/TERT într-un studiu anterior.33 În studiul nostru, nivelul ROS a fost scăzut în celulele LSK din grupul R. glutinosa comparativ cu grupul de control. Astfel, R. glutinosa prelungește supraviețuirea șoarecilor prin inhibarea stresului oxidativ în HSC.

FIGURA 6 Analiza citometrică în flux a procentului de celule imune mature din sângele periferic (PB), măduva osoasă (BM), splină și timus. Șoarecii (în vârstă de 20 luni) au fost hrăniți cu diete suplimentate cu Rehmannia glutinosa sau Astragalus membranaceus (200 mg/zi) timp de 10 luni (n=5/grup); grupul de control a fost hrănit cu o dietă standard. A, Analiza citometrică în flux a procentului de celule B (B220 plus) în PB, BM și splină. B, Analiza citometrică în flux a procentului de celule monocite și granulocite (CD11b plus) în PB și BM. C și D, Analiza citometrică în flux a procentului de celule CD4 plus și CD8 plus în PB, splină și timus. Datele reprezintă media ± SD. *P <>

Astragalus membranaceus este, de asemenea, utilizat în medicina tradițională chineză pentru a promova imunitatea, pentru a reduce glicemia și pentru a promova apoptoza celulelor tumorale și, de asemenea, areantioxidareșianti îmbătrânireproprietăți. În acest studiu, am constatat că suplimentele alimentare cu A. memranaceus timp de 10 luni nu au avut efecte evidente în comparație cu cele observate la șoarecii martor, în timp ce greutatea șoarecilor a fost redusă la 20 de luni. Prin urmare, A. membranaceus poate fi nepotrivit pentru tratamentul LT pentru șoareci hrăniți.

În concluzie, rezultatele noastre arată că R. glutinosa poate prelungi durata de viață a șoarecilor prin menținerea liniei și îmbunătățirea funcției HSC. În plus, R. glutinosa poate scădea nivelurile intercelulare de ROS și numărul de celule SA--gal-pozitive și poate crește imunitatea celulelor B.

MULȚUMIRI

Acest studiu a fost susținut parțial de Fundația Națională de Știință pentru China (31672374), Fondul de inovare CAMS pentru Științe Medicale (CIFMS) (2016-12M-1-012) și Fondul de Tineret PUMC (2017310018).

CONFLICTE DE INTERES

Nici unul.

CONTRIBUȚIILE AUTORILOR

Toți autorii listați îndeplinesc cerințele pentru calitatea de autor. CQ și LFZ au conceput și proiectat experimentele. LB a efectuat experimentele și a scris testul manuscris principal. GYS a efectuat și analizat datele FACS. YJY a conceput experimentul despre medicina tradițională chineză. WC a gestionat șoarecii. Toți autorii au citit și au aprobat manuscrisul.