pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Partea: II Manifestări renale și extrarenale la peștii zebră adulți, model de cistinoză

2.3.5. Ctns−/− Zebrafish Prezintă o grosime crescută a corneei

Cistinozăafectează ochii, ducând la acumularea de cistina în mai multe țesuturi, cum ar fi irisul, conjunctiva și epiteliul retinian, totuși, corneea este partea cea mai afectată din cauza acumulării de cistina [19] și prezintă o grosime crescută [20]. Folosind colorarea H&E, am observat că ctns-/-zebrafish a arătat o grosime crescută a stratului stromal al corneei în comparație cu peștele de tip sălbatic (Figura 10A, B, E). Cu toate acestea, nu am dezvăluit anomalii aparente în epiteliul retinian al ctns-/-zebrafish (Figura 10C, D).

Figura 9. Viteza medie de înot la peștii sălbatici și ctns-/-zebrafish. Viteza medie este scăzută la ctns-/-zebrafish comparativ cu tipul sălbatic la ambele sexe. Viteza medie de înot este măsurată în pixeli/secundă. Fiecare punct reprezintă un pește-zebra, pentru un total de n=6 de tip sălbatic și n=6 ctns-/-{18-pești-zebra de lună. ANOVA bidirecțional cu testul diferenței cele mai puțin semnificative a lui Fisher (PLSD): ** p <>

Figura 10. Histologia oculară la peștele-zebră de tip sălbatic și ctns-/-. (A, B) Imagini reprezentative ale corneei de tip sălbatic (A) și ctns-/- (B) 18- pește-zebra de o lună. Stratul stromal al corneei (vârfuri de săgeți negre și linii negre). Colorarea H&E. Barele de scară reprezintă 50 µm. (C, D) Imagini reprezentative ale retinei peștilor zebra de tip sălbatic (A) și ctns-/- (B). Colorarea H&E. Barele de scară reprezintă 50 µm. (E) Cuantificare relativă a grosimii stratului stromal al corneei. Fiecare punct reprezintă o ficțiune a grosimii stratului stromal al corneei. Test t nepereche cu corecția lui Welch, cu două cozi: * p <>

2.3.6. Fenotipuri suplimentare Ctns-/- Zebrafish

În plus față de fenotipurile menționate mai sus, am efectuat o analiză histologică a creierului și a diverselor, fără a găsi diferențe între pești-/- și pești-zebra de tip sălbatic. Mai mult, am evaluat lungimea și greutatea corpului ctns-/-și peștilor-zebra de tip sălbatic la 18 luni vândute și am găsit o creștere a greutății corporale-/- pești-zebra, în timp ce am găsit o lungime a corpului crescută în ctns-/-zebrafish de ambele sexe, comparativ cu tipul sălbatic (Figura suplimentară S1).

3. Discuție

Pe parcursul ultimelor decenii,cistinozăs-a transformat dintr-o boală fatală a copilăriei într-o tulburare metabolică tratabilă cu care pacienții pot supraviețui până la vârsta adultă și pot ajunge la vârsta înaintată [21,22]. Supraviețuirea mai îndelungată a pacienților a evidențiat noi fenotipuri ale bolii și a ridicat noi întrebări cu privire la patogeneza și efectele pe termen lung ale terapiilor. În acest sens, studierea modelelor animale adulte de cistinoză devine din ce în ce mai relevantă.

În studiul actual, am investigat renal și extrarenal manifestări ale modelului de pește zebră adult de cistinozină de 18 luni vândut, care corespunde vârstei umane de 40-50 de ani [23,24]. În primul rând, am validat că modelul adult ctns-/- zebrafish prezintă acumularea de cistina pe întreg corpul și diferite organe. Înrinichi, la nivel histologic, am observat semne de deteriorare a PTEC reflectate de prezența a numeroase picături eozinofile asemănătoare hialinei, vacuole citoplasmatice și pierderea parțială a marginilor periei. În plus, peștele zebra ctns-/-masculin a dezvoltat hipertrofie glomerulară. În cele din urmă, am arătat că expresia clivată a caspazei 3 a fost crescută în PTEC renal al peștilor zebra ctns-/-, indicând faptul că apoptoza este implicată în patogeneza cistinozei nefropatice la peștii zebra. De candcistinozăpacientii prezinta si extrarenale manifestărilor, am investigat efectul mutației ctns-/- în alte organe în modelul nostru de pește-zebră. Interesant, am descoperit că mutația ctns-/- a cauzat o afectare a anatomiei pielii și afectează fertilitatea, activitatea locomotorie și ochii.

Lizozomii sunt locurile de digestie intracelulară și sunt considerați a fi coordonatorii vitali ai metabolismului celular [25]. Fiind o boală de stocare lizozomală, caracteristica cheie acistinozăeste acumularea lizozomală de cistină [26,27]. Interesant este că am găsit o creștere de 54-ori mai mare a cistinei în întregul corp18-lunilor de pești-zebra de cistinoză, în comparație cu peștii de tip sălbatic, în timp ce, în studiul nostru anterior [10], larvele de pești-zebra de cistinoză la 6 zile după fertilizare au prezentat o creștere de 13-ori. În general, aceste date sugerează că cistina se acumulează pe parcursul vieții în peștele-zebră cu cistinoză. Cromatografia lichidă și analiza spectrometriei de masă au confirmat că, printre toate organele,rinichieste locul preferat pentru acumularea de cistina. Umflarea lizozomală și picăturile eozinofile asemănătoare hialinei din interiorul lizozomilor au fost raportate în PTEC încărcat cu cistină [28,29] și, în biopsiile umane, cristalele de cistină apar ca spații de formă polimorfă în macrofagele interstițiale și citoplasma PTEC [27]. În țesutul uman, acumularea și cristalizarea cistinei este un proces cumulativ care are loc pe parcursul vieții. Inline, cristalele de cistină nu au fost detectate în ctns-/-zebrafish în stadiul larvar [10], în timp ce, în experimentele noastre pilot, am descoperit că forma polimorfă a cristalelor de cistina apare la vârsta de 3 și 6 luni și este clar vizibilă. la vârsta de 18-luni, sugerând o agravare progresivă a efectelor cistinozei înrinichi.

Apasa peEfecte Cistanche pentru boli de rinichi

Pentru a evalua modificările histologice ale glomerulilor, am măsurat suprafețele capsulei Bowman, smocul glomerular și spațiul Bowman de ctns-/-zebrafish pe secțiuni colorate cu PAS. Am descoperit că ctns-/-zebrafish a dezvoltat hipertrofie glomerulară, sugerând o hiperfiltrare. Leziunile glomerulare ușoare observate în pești-/-zebră ar putea fi atribuite capacității de regenerare a peștelui-zebră.rinichi, putând adăuga noi nefroni, precum și repararea nefronilor existenți [30].

În plus față de deteriorarea histologică, s-a demonstrat că acumularea de cistină activează proteinkinaza, care declanșează apoptoza în PTEC[12]. Astfel, am evaluat expresia clivată a caspazei-3 în PTEC și am constatat că ctns-/-zebrafishul a prezentat caspaze-3 crescute și fragmentare nucleară. Prezența caspazei scindate-3 a fost găsită în principal în celulele care au acumulat vacuolele citoplasmatice, ceea ce sugerează că apoptoza are loc în PTEC-ul vătămat. Un mecanism suplimentar care poate explica creșterea apoptozei ar putea fi prezența speciilor reactive de oxigen din cauza glutationului redus asociat cu acumularea de cistina [31]. Cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare pentru a evalua dacă acest mecanism apare și la ctns-/-zebrafish.

Cu toate cărinichisunt primele și cele mai grav afectate organe,cistinozăeste o boală multisistemică în care sunt implicate diferite organe, cum ar fi pielea, gonadele, ochii și mușchii. Din literatură, se știe că pacienții cu cistinoză prezintă frecvent îmbătrânire prematură a pielii, păr blond și culoare deschisă a pielii [13]. Cel din urmă fenotip se datorează implicării transportorului de cistinosin în reglarea sintezei de melanină[32] și menținerii pigmentării mai întunecate prin transportorul de cisteină nou descoperit MFSD12 [33]. În mod emoționant, modelul nostru adult ctns-/-zebrafish a prezentat un model de piele hipopigmentat și patat și a arătat o distribuție afectată a melaninei care nu a fost observată în stadiul larvar [10].

În plus,cistinozăcauzează infertilitate la bărbați, în timp ce femelele sunt cunoscute a fi fertile [14]. Date recente sugerează că infertilitatea s-ar putea datora degenerescenței testiculare progresive, care duce la alterarea calității spermei, sau din cauza unei obstrucții într-o parte nedefinită a sistemului excretor masculin. Structurile obstrucționate pot afecta calitatea materialului seminal, în special în regiunile în care canalele au un diametru foarte mic, de exemplu, retetestisul[16]. Peștii zebră, spermatozoizii la procesele genice sunt foarte asemănătoare cu mamiferele; totuși, una dintre principalele diferențe este că spermatogeneza are loc în chisturi [34]. În studiul nostru, am găsit o creștere a spermatozoizilor în chistul spermatogen al ctns-/-zebrafish, cu toate acestea, nu am găsit semne de degenerare testiculară. Prin urmare, fenotipul descris ar putea sugera o obstrucție la nivel testicular care duce la o eliberare mai mică de spermatozoizi în mediu, totuși sunt necesare studii suplimentare pentru a confirma această ipoteză. La nivel funcțional, scăderea numărului de ouă și scăderea ouălor fertilizate par să reflecte o afectare a fertilităţii ctns-/-zebrafish.

O altă manifestare clinică acistinoză, care afectează în general pacienții începând din a doua decadă de viață, este miopatia, caracterizată prin pierderea musculară și slăbiciune [1]. În mod interesant, am constatat că peștii zebra ctns-/-adulti prezintă o activitate locomotorie scăzută în comparație cu controlul, ceea ce sugerează o funcție musculară afectată. De remarcat, acest fenotip nu a fost prezent la larve [10], ceea ce sugerează că afectează ctns-/-zebrafish în etapa ulterioară a bolii. În ciuda acestui fapt, nu au fost detectate diferențe histologice vizibile în mușchi. Scăderea activității locomotorii s-ar putea datora disfuncției mitocondriale care nu a putut fi detectată prin studii histologice de rutină [35-37]. Prin urmare, o caracterizare cuprinzătoare a mitocondriilor la peștele-zebră cu cistinoză necesită o evaluare suplimentară.

Pe lângă fenotipurile menționate mai sus, mai multe studii au arătat că pacienții cu cistinoză prezintă, de asemenea, simptome oculare precum fotofobia și blefarospasmul [1], corneea fiind una dintre părțile cele mai afectate ale ochiului, rezultând acumularea de cristale de cistină și creșterea grosimii [20]. Cu toate acestea, se cunosc puține despre cauzele creșterii grosimii corneei. De exemplu, s-a sugerat că fenotipul descris se datorează unei disfuncții subclinice a celulelor epiteliale și/sau endoteliale care conduc la tostromaledem[20]. În studiul nostru, am descoperit că ctns-/-adultzebrafish display a crescut este grosimea stratului stromal al corneei, ceea ce indică faptul că modelul nostru prezintă semne de disfuncție a corneei încistinoză.

Cistanche pentrurinichifuncţie

Unul dintre principalele lacune de completat pentru o înțelegere cuprinzătoare acistinozăeste lipsa unui model animal care să recapituleze complet boala umană. Au fost dezvoltate mai multe modele de șoarece, care arată acumularea de cistina, dar nu reușesc să o reproducă completrenalfenotip [8,26]. În mod specific, șoarecele C57BL/6 a prezentat acumulare de cistină în mai multe organe, care crește cu vârsta [8]. În plus, modelul de șoarece C57BL/6 prezintă leziuni tubulare proximale începând de la vârsta de 6 luni. În mod similar, în modelul nostru, leziunile tubulare proximale se agravează în timp. Cu toate acestea, la nivel glomerular, modelul de șoarece C57BL/6 a prezentat un fenotip normal, în timp ce modelul nostru de pește zebra adult prezintă hipertrofie glomerulară. În plus, modelul de șoarece C57BL/6 nu reușește să mimeze fertilitatea afectată observată la om, în timp ce modelul ctns-/-zebrafish prezintă chisturi spermatogenice îmbogățite în spermatozoizi și producția scăzută de ouă. La nivel ocular, atât modelul de șoarece[38], cât și de pește-/-zebră prezintă anomalii oculare. Dimpotrivă, la nivelul pielii, acest model de șoarece nu prezintă o producție afectată de melatonină [8], care apare în modelul de pește zebra adult ca un model de piele hipopigmentat. În sfârșit, la nivel comportamental, modelul nostru ctns-/- pește-zebră prezintă o activitate locomotorie scăzută, care poate fi cauzată de o funcție mitocondrială afectată sau poate fi cauzată de un efect secundar al creșterii greutății încistinozăpește-zebră. În general, se pare că modelul nostru ctns-/- pește-zebră recapitulează mai bine boala umană. Recent, Shimizu et al. a stabilit o nouă mutație congenică Ctnsugl la o tulpină de șobolan care a prezentatrenalleziuni si cristale de cistină în lizozomiirinichicortexul [7]. Cu toate acestea, încă lipsește o caracterizare mai detaliată a modelului. Prin urmare, există o nevoie urgentă de a dezvolta și caracteriza noi modele funcționale care recapitulează boala umană.

În concluzie, am demonstrat că modelul nostru de pește zebră ctns-/- pentru adulți reproduce mai multe fenotipuri umane de nisip de cistină poate fi util pentru studiul patogenezei bolii la adulți și pentru testarea efectelor pe termen lung ale medicamentelor noi pentru corectarea renală și extra-renalmanifestări.

4. Materiale și Metode

4.1. Întreținerea și creșterea peștilor zebră

Zebrafish a fost manipulat și întreținut în conformitate cu reglementările KU Leuven privind bunăstarea animalelor (Aprobare etică nr.142/2019). Pentru acest studiu, am inclus ctns-/-zebrafish la vârsta de 18 luni și peștele-zebră de control de tip sălbatic la ambele sexe. Detaliile generării ctns-/-zebrafish au fost descrise în studiul nostru anterior [10].

4.2. Măsurarea cistinei

Nivelurile de cistină au fost măsurate la peștele de tip zebra (mascul de tip sălbatic, n=3și ctns -/- peștele mascul, n=3) și cantitatea a fost exprimată ca proteine ​​nmol/mg. Mai întâi, peștii zebra au fost sacrificați cu imersiune în tricaină metansulfonat MS-222 (3{00 mg/L), apoi, probele de țesut au fost sonicate în prezența a 200 µL de 5 mM N-ethylmaleimidă (NEM, St. Louis, MO, SUA, Sigma-Aldrich E3876) în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) Dulbecco, pentru maximum 200 mg de țesut pentru fiecare lizat. Ulterior, la fiecare omogenat s-au adăugat 100 µL de acid sulfosalicilic (SSA) 12%, iar probele au fost centrifugate la 12,000 g timp de 10 min, 4◦C. Supernatanții care conțin cistina au fost păstrați la -80 °C până la momentul analizei, în timp ce peletele au fost dizolvate peste noapte la 4 °C în 300 uL de NaOH 0,1 M și s-au păstrat la -80 °C până când proteina este măsurată utilizând Kitul de reactiv pentru testul proteinei Pierce BCA. Ulterior, cantitatea (nmol) de cistina a fost normalizată la cantitatea (mg) de proteină din fiecare probă. Apoi, 50 ui din supernatantul care conține cistină au fost adăugate cu 50 ui de soluție standard internă (Cistina d6) și agitate în vortex timp de 5 s; apoi amestecul a fost extras cu 200 uL de acetonitril, agitat timp de 30 s, apoi centrifugat la 16,000 g timp de 9 min. Cromatografia lichidă și analiza spectrometriei de masă au fost efectuate de un UHPLCAgilent1290InfinityII6470 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA) echipat cu o sursă ESI-JET-STREAM care funcționează în modul ion pozitiv (ESI plus). Software-ul utilizat pentru controlul acestui echipament și analiza datelor a fost MassHunter (Stația de lucru Agilent Technologies, Barcelona, ​​Spania). Coloana de separare utilizată a fost InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1,9 µm 100 x 2,1 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA).

4.3. Hematoxilină și eozină și colorare periodică de schimbare a acidului

Pește zebră (pește femelă de tip sălbatic, n=3; pește masculin de tip sălbatic, n=3; pește femelă ctns-/-, n=3; pește mascul ctns-/-, n=3) au fost sacrificate prin imersare în tricaină metansulfonat MS-222 (300 mg/L), după aceea, peștele zebra întreg a fost fixat în paraformaldehidă tamponată 4% (4% PFA) la 4 °C timp de 1 săptămână. . După ce au fost spălate cu PBS de două ori, peștii zebra au fost transferați în soluție de EDTA (100 mM, pH=8) pentru decalcifiere timp de încă o săptămână, urmată de încorporare în parafină. Țesutul de pește zebră încorporat în parafină a fost tăiat (4-µm grosime) pe un microtom Leica (LeicaBiosystems, Wetzlar, Germania). Secțiunile au fost colorate cu H&E și PAS conform protocoalelor standard.

Studii histologice ale ochilor de zebră (femele de tip sălbatic, n=3și ctns-/-femele de pește, n=3), ochii au fost enucleați și fixați în 4% PFA la temperatura camerei timp de 4 ore. Au fost realizate următoarele încorporare în mediu de temperatură optimă de tăiere (Tissue-Tek® VIP®; Sakura Finetek, Japonia), criosecțiuni de 10-µm (Cryostar NX70, Thermofisher Scientific, Tokyo, Japonia). Secțiunile au fost colorate cu H&E conform protocoalelor standard. Imaginile au fost realizate cu un microscop Leica cu câmp luminos (Leica DM6, Wetzlar, Germania).

4.4. Imunohistochimie (colorare cu caspază scindată-3)

Secțiunile cu țesut de pește zebra proaspăt tăiat au fost deparafinizate și rehidratate. Secțiunile au fost supuse recuperării antigenului indusă de căldură folosind tampon citrat 10 mM (pH=6). După blocarea cu 5% ser normal de capră (NGS) în dPBS, secțiunile au fost incubate cu caspază anti-clivată de iepure-3 (Cell Signaling, Danvers, MA, SUA, diluție 1:200), urmată de un anti-iepure -Envision, anticorp secundar marcat cu HRP (Dako Products, Agilent, Santa Clara, CA, SUA). Ca martor negativ, a fost folosit un ser normal de iepure. Diaminobenzidina (DAB, DAKO, Glostrup, Danemarca) a fost folosită ca cromogen. Ulterior, secțiunile au fost contracolorate cu H&E, deshidratate și montate.

Tratamentul bolilor de rinichi: Cistanche

4.5. Colorarea cu albastru de toluidină și TEM

Pește-zebrărenalțesuturile (pește zebra masculin de tip sălbatic, n=3 și ctns -/- pește zebra masculin, n=3) au fost recoltate și fixate în tampon de fixare EM (1,5% glutaraldehidă/1% paraformaldehidă) timp de 24 de ore . Ulterior, țesuturile renale au fost post-fixate cu 2,5% glutaraldehidă/1,2% acroleină în tampon de fixare (0,1 mol/L cacodilați, 0,1 mol/L zaharoză, pH 7,4) și 1 tetroxid de osmiu și încorporat în rășină. Secțiunile semisubțiri (0.{5-µm grosime) au fost colorate cu albastru de toluidină. Secțiunile ultrasubțiri au fost colorate cu acetat de uranil. Imaginile au fost colectate folosind o microscopie electronică cu transmisie JEM-1200 EX (JEOL Ltd, Tokyo, Japonia) cu diferite măriri.

4.6. Analiza digitală a imaginii

Diapozitivele colorate au fost digitizate folosind un scaner ultrarapid Philips 1.6 RA (Philips, Eindhoven, Olanda)

4.6.1. Analiza hipertrofiei glomerulare

Pentru a analiza hipertrofia glomerulară la peștii zebra, suprafețele (µm2) ale capsulei Bowman, spațiul lui Bowman și smocul glomerular au fost măsurate pe lamele colorate cu PAS. Toți glomerulii disponibili pe secțiune au fost incluși și măsurați folosind software-ul ImageJ. Media măsurătorilor de la fiecare pește-zebră a fost utilizată pentru analiza statistică.

4.6.2. Analiza expresiei-3 de caspază scindată

Twoobserversscoredthecleavedcaspase-3expressioninthetubulesofeachzebrafish. The semiquantitative score was conducted on the three randomized tubular fields in each zebrafish(20×magnification). Thepercentageofcaspase-3positivearearelativetothetotal area of tubules was scored as 1 (negative staining), 2 (1–10% positive staining), 3 (10%–25% positive staining), 4 (>25% colorare pozitivă). Media scorului de la fiecare pește-zebră a fost utilizată pentru analiza statistică.

4.6.3. Analiza grosimii stromei corneene

Grosimea stromei corneene a peștelui zebra (10 × mărire) a fost măsurată la aceleași distanțe față de centrul ochiului folosind software-ul ImageJ pe peștele zebra. Pentru fiecare imagine, n=7 măsurători în diferite locații din secțiunea ochiului (central, mijloc, periferie) au fost efectuate de-a lungul corneei la intervale de 100 µM. Media măsurătorilor a fost utilizată pentru analiza statistică.

4.7. Studiu de fertilitate

Fertilitatea a fost evaluată prin împerecherea peștilor zebra femele și masculi (pești masculi de tip sălbatic, n=4 și pești femele de tip sălbatic, n=6 și ctns -/- pești masculi, n=4 și ctns−/−female pești, n=6) într-o tavă de depunere a icrelor. În dimineața următoare, la o oră după lumină, au fost colectați embrioni și a fost înregistrat numărul total de ouă produse. Ouăle fertilizate au fost testate și numărate din cele nefertile folosind microscopie cu lumină. Creșterea a fost efectuată de n=7 ori o dată pe săptămână la rând. Au fost excluse două experimente care au dus la nicio producție de ouă simultan atât la peștele sălbatic, cât și la ctns-/-zebrafish.

4.8. Activitatea locomotorie

Pește zebră (pește femelă de tip sălbatic, n=6; pește masculin de tip sălbatic, n=6; pește femelă ctns-/-, n=6; pește mascul ctns-/-, n=6) au fost plasate în locuințele obișnuite și, după un timp de adaptare de 5 min, au fost filmate timp de 5 min. Înregistrarea video a fost realizată cu ajutorul unui GoPro® HERO 7 plasat deasupra rezervorului, oferind astfel o vedere de sus a peștilor care înot. Rezoluția și rata de cadre au fost setate la 1080 p (1920×1080) și, respectiv, 30 fps. Videoclipurile au fost analizate cu Tracker. au urmărit traiectoriile peștilor de zebră individuale de-a lungul experimentului. Ulterior, traiectoriile au fost analizate cu codul python personalizat pentru a determina viteza medie a locomotorii (pixel/sec) în fiecare grup [39].

Cistanche-renal

4.9. Masuratori pentru greutatea corporala si lungime

Peștii zebră au fost eutanasiați cu imersiune în 300 mg/Loftricainemetansulfonat MS-222. După verificarea absenței răspunsului la stimulii externi, peștii zebră eutanasiați au fost plasați pe un șervețel de hârtie și uscati. Lungimea peștelui zebră eutanasiat a fost evaluată folosind un șubler, măsurând de la vârful gurii până la pedunculul caudal. Greutatea peștelui zebra eutanasiat a fost evaluată cu o scală analitică.

4.10. Analize statistice

Analiza statistică a fost efectuată folosind SPSS (IBM, New York, NY, SUA) și GraphpadPrism (GraphPadSoftware, LaJolla). Datele a două grupuri au fost analizate utilizând un test t nepereche cu corecția lui Welch, cu două cozi. Datele a două variabile independente categorice au fost analizate cu ANOVA bidirecțională cu testul Fisher diferența cea mai mică semnificativă (PLSD). Diferențele cu p < 0.05="" au="" fost="" considerate="" semnificative="">

4.11. Studiu de fertilitate

Pentru compararea ratelor de producție de ouă între peștele de tip sălbatic și ctns-/-zebrafish, a fost efectuată o analiză de regresie Poisson folosind ecuații de estimare generalizate cu erori standard robuste pentru a ține seama de corelarea ratelor cu experimentele. Pentru compararea ofertei de șanse au fost utilizate ouă între tipul sălbatic și ctns-/-zebrafish. S-au efectuat analize de regresie logistică folosind ecuații de estimare generalizate cu erori standard robuste pentru a ține seama de corelarea șanselor în cadrul experimentelor.

Materiale suplimentare: Următoarele sunt disponibile online la https://www.mdpi.com/article/ 10.3390/ijms22179398/s1.

Contribuții autor: Conceptualizare, SPB, JH, LvdH, HJB, EL; metodologie, SPB, JH, LDG, HT, TN, PB, SC, BG; software SPB, JH, LDG, HT, TN; validare, SPB, JH, LDG, PB, LvdH, HJB și EL; analiza formală, SPB, JH, LDG, HT, TN; ancheta, LvdH, HJB, EL; resurse, HJB și EL; curatarea datelor, SPB, JH, LDG, LvdH, HJB, EL; redactare — pregătire originală a proiectului SPB, JH; scris—revizuire și editare, LvdH, HJB, EL; vizualizare, LvdH, HJB, EL; supraveghere, PdW, LvdH, HJB, EL; administrare proiect, LvdH, HJB, EL; achiziție de finanțare, HJB, EL Toți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului.

Finanțare: Autorii ar dori să recunoască fondul intern de la KULeuvenC1 GranttoE.L. (C14/17/113), Grantul Consiliului de burse din China pentru JH (CSC n◦ 201508500109) și bursa postdoctorală FWO pentru LDG (12I3820N).

Declarația Comitetului de revizuire instituțională: Studiul a fost realizat în conformitate cu liniile directoare ale Declarației de la Helsinki și aprobat de Comitetul de etică al KU Leuven nr.142/2019. Mulțumiri: Dorim să-i mulțumim: Didier Cagnini pentru evaluarea histologiei creierului atât la ctns-/- și la pești-zebra tip sălbatic, KathleeenLambaerts, FrédéricHendrickxand KimvanKelst pentru sprijinul și asistența lor constantă în KU Leuven pentru instalația de asistență tehnică acvatică Peter Neesken, al TEM și Ron Wolterbeek pentru analiză statistică.

Conflicte de interese: autorii nu declară conflicte de interese. Finanțatorii nu au participat la proiectarea studiului; în colectarea, analizele sau interpretarea datelor; în scrierea manuscrisului sau în decizia de a publica rezultatele.

Referințe

1. Elmonem, MA; Veys, KR; Soliman, NA; van Dyck, M.; van den Heuvel, LP; Levtchenko, E. Cystinoz: O recenzie. Orphanet J. Rare Dis. 2016, 11, 47. [CrossRef]

2. Jezegou, A.; Llinares, E.; Anne, C.; Kieffer-Jaquinod, S.; O'Regan, S.; Aupetit, J.; Chablis, A.; Sagne, C.; Debacker, C.; ChadefauxVekemans, B.; et al. Proteina heptahelică PQLC2 este un exportator de aminoacizi cationici lizozomal care stă la baza acțiunii cisteaminei încistinozăterapie. Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 2012, 109, E3434–E3443. [CrossRef] [PubMed]

3. Besouw, MT; Levtchenko, EN Îmbunătățirea prognosticului cistozei nefropatice. Int. J. Nephrol. Renova. Dis. 2014, 7, 297–302. [CrossRef]

4. Brodin-Sartorius, A.; Tete, MJ; Niaudet, P.; Antignac, C.; Invitat, G.; Ottolenghi, C.; Charbit, M.; Moyse, D.; Legendre, C.; Lesavre, P.; et al. Terapia cu cisteamină întârzie progresia cistozei nefropatice la adolescenții târziu și la adulți. KidneyInt. 2012, 81, 179–189. [CrossRef]

5. Cherqui, S. Terapia cu cisteamină: un tratament pentru cistinoză, nu un leac. Rinichi Int. 2012, 81, 127–129. [CrossRef]

6. David, D.; Princiero Berlingerio, S.; Elmonem, MA; Oliveira Arcolino, F.; Soliman, N.; van den Heuvel, B.; Gijsbers, R.; Levtchenko, E. MolecularBasisof Cytinosis: Geographic Distribution, Functional Consequences of Mutations intheCTNSGene, and Potential for Repair. Nephron 2019, 141, 133–146. [CrossRef] [PubMed]

7. Shimizu, Y.; Yanobu-Takanashi, R.; Nakano, K.; Hamase, K.; Shimizu, T.; Okamura, T. O deleție a genei Ctns provoacă disfuncție tubulară renală și acumulare de cistina la șobolanii LEA/Tohm. Mamm. Genomul 2019, 30, 23–33. [CrossRef]

8. Nevo, N.; Chol, M.; Bailleux, A.; Kalatzis, V.; Morisset, L.; Devuyst, O.; Gubler, MC; Antignac, C. Fenotipul renal alcistinozămodelul de șoarece depinde de fundalul genetic. Nefrol. Apelează. Transplant 2010, 25, 1059–1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Elmonem, MA; Berlingerio, SP; van den Heuvel, LP; de Witte, PA; Lowe, M.; Levtchenko, EN GeneticăRenalBoli: rolul emergent al modelelor de pești zebra. Cells 2018, 7, 130. [CrossRef] [PubMed]

10. Elmonem, MA; Khalil, R.; Khodaparast, L.; Khodaparast, L.; Arcolino, FO; Morgan, J.; Pastore, A.; Tylzanowski, P.; Ny, A.; Lowe, M.; etal. Mutanții de pește zebră de cistinoză (ctns) prezintă disfuncție glomerulară și tubulară pronefrică. Sci. Rep. 2017,7, 42583. [CrossRef]

11. Lusco,MA;Najafian,B.;Alpers,CE;Fogo,ABAJKDAtlasofRenalPathology:Cistinoză. A.m. J.KidneyDis. 2017,70,e23–e24. [CrossRef]

12. Park, MA; Pejovic, V.; Kerisit, KG; Junius, S.; Thoene, JG Creșterea apoptozei în fibroblastele cistinotice șirenalcelulele epiteliale tubului proximal rezultă din cisteinilarea proteinei kinazei C delta. J. Am. Soc. Nefrol. 2006, 17, 3167–3175. [CrossRef]

13. Veys, KRP; Elmonem, MA; Dhaenens, F.; Van Dyck, M.; Janssen, M.; Cornelissen, EAM; Hohenfellner, K.; Reda, A.; Quatresooz, P.; van den Heuvel, B.; et al. Îmbătrânirea intrinsecă a pielii îmbunătățită în cistinoza nefropatică evaluată prin tomografie cu coerență optică de înaltă definiție. J. Invest. Dermatol. 2019, 139, 2242–2245. [CrossRef]

14. Besouw, MT; Kremer, JA; Janssen, MC; Levtchenko, EN Starea fertilității la pacienții de sex masculin cu cistinoză tratați cu cisteamină. Fertil. Steril. 2010, 93, 1880–1883. [CrossRef]

15. Veys, KR; D'Hauwers, KW; van Dongen, A.; Janssen, MC; Besouw, MTP; Goossens, E.; van den Heuvel, LP; Wetzels, A.; Levtchenko, EN Prima concepție reușită indusă de un pacient de sex masculin cu cistinoză. JIMD Rep. 2018, 38, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

16. Rohayem, J.; Haffner, D.; Cremers, JF; Huss, S.; Wistuba, J.; Weitzel, D.; Kliesch, S.; Hohenfellner, K. Funcția testiculară la bărbați cu cistinoză nefropatică infantilă. Zumzet. Reprod. 2021, 36, 1191–1204. [CrossRef] [PubMed]

17. Blakey, H.; Proudfoot-Jones, J.; Knox, E.; Lipkin, G. Sarcina la femeile cu cistinoză. Clin. Kidney J. 2019, 12, 855–858. [CrossRef]

18. Dogulu, CF; Tsilou, E.; Rubin, B.; Fitzgibbon, EJ; Kaiser-Kupper, MI; Rennert, OM; Gahl, WA Hipertensiunea intracraniană idiopatică în cistinoză. J. Pediatr. 2004, 145, 673–678. [CrossRef] [PubMed]

19. Dixon, P.; Christopher, K.; Chauhan, A. Rolul potențial al colagenului stromal în cristalizarea cistinei la pacienții cu cistinoză. Int. J. Pharm. 2018, 551, 232–240. [CrossRef]

20. Katz, B.; Melles, RB; Schneider, JA; Rao, NA Grosimea corneei în cistinoza nefropatică. Br. J. Oftalmol. 1989, 73, 665–668. [CrossRef] [PubMed]

21. Nesterova, G.; Gahl, WA Cistinoza: Evoluția unei boli tratabile. Pediatr. Nefrol. 2013, 28, 51–59. [CrossRef] [PubMed]

22. Ariceta, G.; Giordano, V.; Santos, F. Efectele tratamentului pe termen lung cu cisteamină la pacienții cucistinoză. Pediatr. Nefrol. 2019, 34, 571–578. [CrossRef] [PubMed]

23. Gilbert, MJ; Zerulla, TC; Tierney, KB Zebrafish (Danio rerio) ca model pentru studiul îmbătrânirii și exercițiilor fizice: capacitatea fizică și capacitatea de antrenament scad odată cu vârsta. Exp. Gerontol. 2014, 50, 106–113. [CrossRef] [PubMed]

24. Gerhard, GS; Kauffman, EJ; Wang, X.; Stewart, R.; Moore, JL; Kasales, CJ; Demidenko, E.; Cheng, KC Durată de viață și fenotipuri senescente la două tulpini de zebră (Danio rerio). Exp. Gerontol. 2002, 37, 1055–1068. [CrossRef]

25. Saftig, P.; Klumperman, J. Biogeneza lizozomilor și proteinele membranei lizozomale: Traficul întâlnește funcția. Nat. Pr. Mol. Cell Biol. 2009, 10, 623–635. [CrossRef]

26. Cherqui, S.; Sevin, C.; Hamard, G.; Kalatzis, V.; Sich, M.; Pequignot, MO; Gogat, K.; Abitbol, ​​M.; Broyer, M.; Gubler, MC; et al. Acumularea de cistină intralizozomală la șoarecii lipsiți de cistinoză, proteina defectuoasă în cistinoză. Mol. Celulă. Biol. 2002, 22, 7622–7632. [CrossRef]

27. Raggi, C.; Luciani, A.; Nevo, N.; Antignac, C.; Terryn, S.; Devuyst, O. Dediferențierea și aberațiile compartimentului endolizozomal caracterizează stadiul incipient al cistozei nefropatice. Zumzet. Mol. Genet. 2014, 23, 2266–2278. [CrossRef]

28. Hard, GC Unele ajută la recunoașterea histologică a nefropatiei cu picături hialine în studii de toxicitate de nouăzeci de zile. Toxicol. Pathol. 2008, 36, 1014–1017. [CrossRef]

29. Sakarcan, A.; Timmons, C.; Baum, M. Distribuția intracelulară a cistinei în tubii proximali încărcați cu cistină. Pediatr. Res. 1994, 35, 447–450. [CrossRef]

30. Kroeger, PT, Jr.; Wingert, RA Utilizarea peștelui zebră pentru a studia geneza podocitelor în timpul dezvoltării și regenerării rinichilor. Geneză. 2014, 52, 771–792. [CrossRef]

31. Sumayao, R.; McEvoy, B.; Newsholme, P.; McMorrow, T. Acumularea de cistină lizozomală promovează depolarizarea mitocondrială și inducerea genelor sensibile la redox în celulele tubulare proximale ale rinichiului uman. J. Physiol. 2016, 594, 3353–3370. [CrossRef]

32. Chiaverini, C.; Sillard, L.; Flori, E.; Ito, S.; Briganti, S.; Wakamatsu, K.; Fontas, E.; Berard, E.; Cailliez, M.; Chat, P.; et al. Cystinosin este o proteină melanozomală care reglează sinteza melaninei. FASEB J. 2012, 26, 3779–3789. [CrossRef]

33. Adelmann, CH; Traunbauer, AK; Chen, B.; Condon, KJ; Chan, SH; Kunchok, T.; Lewis, CA; Sabatini, DMMFSD12 mediază importul de cisteină în melanozomi și lizozomi. Natura 2020, 588, 699–704. [CrossRef]

34. Leal, MC; Cardoso, ER; Nobrega, RH; Batlouni, SR; Bogerd, J.; Franca, LR; Schulz, RW Evaluarea histologică și stereologică a spermatogenezei peștilor zebră (Danio rerio), cu accent pe generațiile de spermatogoni. Biol. Reprod. 2009, 81, 177–187. [CrossRef] [PubMed]

35. Sansanwal, P.; Sarwal, MM Autofagie mitocondrială anormală la nefropaticistinoză. Autophagy 2010, 6, 971–973. [CrossRef] [PubMed]

36. Bellomo, F.; Signorile, A.; Tamma, G.; Ranieri, M.; Emma, ​​F.; De Rasmo, D. Impactul nivelului de AMP ciclic mitocondrial atipic în cistinoza nefropatică. Celulă. Mol. Life Sci. 2018, 75, 3411–3422. [CrossRef] [PubMed]

37. De Rasmo, D.; Signorile, A.; De Leo, E.; Polishchuk, EV; Ferretti, A.; Raso, R.; Russo, S.; Polishchuk, R.; Emma, ​​F.; Bellomo, F. MitocondrialDynamicsofProximalTubularEpithelialCellsinNefropathicCystinosis. Int. J.Mol. Sci. 2019,21,192. [CrossRef]

38. Kalatzis, V.; Serratrice, N.; Hippert, C.; Payet, O.; Arndt, C.; Cazevieille, C.; Maurice, T.; Hamel, C.; Malecaze, F.; Antignac, C.; et al. Anomaliile oculare într-un model animal de cistinoză imită patogeneza bolii. Pediatr. Res. 2007, 62, 156–162. [CrossRef]

39. Romero-Ferrero, F.; Bergomi, MG; Hinz, RC; Heras, FJH; de Polavieja, GG idtracker.ai: Urmărirea tuturor indivizilor în colective mici sau mari de animale nemarcate. Nat. Metode 2019, 16, 179–182. [CrossRef]