Lipocalinul secretat asociat cu gelatinază neutrofilă arată o capacitate mai puternică de a inhiba mărirea chistului celulelor ADPKD în comparație cu forma nesecretată

Cuvinte cheie: ADPKD;lipocalină asociată gelatinazei neutrofile; cultura 3D

Ierburi NOI PENTRU

1. Introducere

Boala polichistică de rinichi (PKD), una dintre cele mai frecvente boli ereditare, se caracterizează prin dezvoltarea chisturilor pline de lichid de-a lungul mai multor segmente ale nefronului [1]. ADPKD este cea mai comună formă de PKD, care este o PKD la adulți pentru care majoritatea pacienților nu dezvoltă simptome până la vârsta de patruzeci de ani [2]. ADPKD este rezultatul mutațiilor fie ale genelor PKD1 (85%), fie ale PKD2 (15%) care codifică policistina-1 (PC1) și respectiv policistina{-2 (PC2), [3,4]. Defectele PC1 sau PC2 sunt asociate cu creșteri anormale ale proliferării celulelor epiteliale renale și provoacă în continuare formarea de chisturi [5-7]. Pe măsură ce ADPKD progresează, chisturile se măresc și perturbă arhitectura normală a rinichilor, ducând în cele din urmă la insuficiență renală. Cu toate acestea, mecanismul implicat în ADPKD este complicat și rămâne de explorat. Pierderea funcțională a PC1 și/sau PC2 în ADPKD duce la concentrații intracelulare reduse de calciu, atenuând adenilil ciclaza (AC) sensibilă la calciu și conducând în continuare la un nivel crescut de adenozin monofosfat ciclic intracelular (cAMP) [8,9]. cAMP stimulează proliferarea celulelor epiteliale și secreția fluidă pentru a promova mărirea chistului prin activarea proteinei kinazei A (PKA) și a căii Ras/B-Raf/MEK/ERK din aval [10,11]. S-a demonstrat că disfuncția autofagiei apare la ADPKD pești-zebră și șoareci in vitro [12] și șobolani in vivo [13]. Autofagia este un mecanism crucial care menține homeostazia celulelor și organelor prin degradarea și reciclarea organelelor, proteinelor cu viață lungă și nutrienților [14,15]. Interacțiunea are loc între calea mTOR a căilor de autofagie și apoptoză, care este dereglată în PKD [16]. Tratamentul cu activatori de autofagie, cum ar fi rapamicina și carbamazepina, poate atenua semnificativ formarea chisturilor [12]. Anterior, am stabilit un model de șoarece ADPKD numit Pkd1L3/L3 (în fundalul genetic C57BL/6) [17] prin inserarea unui site loxP și a unei casete mc1-neo flancate de loxP în intronii 30 și 34 ai genei Pkd1. , respectiv (L3 înseamnă trei situsuri loxP în alelă), pentru a genera mutația condițională a genei. Șoarecii Pkd1L3/L3 au produs niveluri scăzute (20% din control) de PC1, care a indus creșterea agresivă a chistului și extinderea volumului rinichilor odată cu creșterea în vârstă [17]. În plus, un model de celule ADPKD (linia celulară 2L3) a fost stabilit prin transducția virusului SV40 a celulelor epiteliale renale primare de la șoareci Pkd1L3/L3 pentru a induce linii celulare imortalizate [18].

Lipocalina asociată cu gelatinaza neutrofilă (NGAL), o proteină secretată de 22-kD, este considerată un biomarker pentru leziunile renale, inclusiv PKD la adulți [19] (dar nu la copii [20]), boala renală cronică [21 ] și ischemie acută renală [22]. Mecanismul creșterii proteinei NGAL în urina pacientului nu este clar, s-a propus că NGAL acumulat în urină se referă la decilierea celulelor epiteliale renale ca urmare a leziunii [23]. Unele studii au indicat că NGAL joacă un rol protector împotriva leziunilor renale, localizarea ischemiei [24] și suprimarea progresiei chistului [25], în timp ce unele studii au sugerat că NGAL ar putea fi implicat în progresia chistului [26] și dezvoltarea tumorii [27] ]. Receptorul NGAL (NGAL-R, Slc22a17) este exprimat în mai multe țesuturi epiteliale, inclusiv în nefronii renali [28]. Cuplarea NGAL și NGAL-R poate sechestra fierul intracelular și poate induce în continuare apoptoza [29], care este asociată cu o strategie de epuizare a fierului a sistemului imunitar înnăscut împotriva infecției bacteriene [30].

S-a demonstrat că administrarea de NGAL exogen crește apoptoza celulelor Pkd1-/- și scade și mai mult creșterea chisturilor in vitro [25]. În lucrările anterioare, am generat șoareci Pkd1L3/L3 × NGAL-/- și șoareci Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg prin încrucișarea șoarecilor Pkd1L3/L3 cu șoareci knockout NGAL și respectiv transgenici [31]. Am descoperit că supraexprimarea NGAL într-un model de șoarece ADPKD (șoareci Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg) a redus progresia chistului și a prelungit durata de viață a șoarecilor Pkd1L3/L3, însoțită de modificări într-o serie de căi moleculare implicate în proliferare, apoptoză și fibroză [31]. Cu toate acestea, mecanismul de bază al efectelor NGAL în atenuarea progresiei ADPKD rămâne enigmatic.

În acest studiu, a fost stabilită o platformă de cultură celulară 3D pentru a testa progresia chistului celulelor epiteliale renale Pkd1L3/L3 (celule 2L3) cu adăugarea proteinei recombinate NGAL de șoarece (mNGAL) sau supraexprimarea NGAL transgenic in vitro. În plus, au fost explorate efectele mentalului asupra proliferării, apoptozei și căilor legate de autofagie. În plus, mecanismul NGAL în celulele 2L3 a fost elucidat prin examinarea efectelor supraexprimării NGAL secretat (pN + LS) și NGAL nesecretat (pN - LS) în celulele 2L3. Efectul și mecanismul imaginabil al proteinei NGAL în celulele ADPKD au fost parțial explorate în acest studiu.

2. Materiale și Metode

2.1. Liniile celulare

Linia celulară Pkd1L3/L3 (2L3) a fost stabilită prin transducția virusului SV40 a celulelor epiteliale renale primare de la șoareci 2L3, un model de șoarece ADPKD, pentru a induce o linie celulară imortalizată [17,18]. Celulele renale primare au fost infectate în al doilea pasaj prin utilizarea unui kit de imortalizare a virusului Lenti SV40 (Capital Biosciences Inc., Gaithersburg, MD, SUA). Celulele au fost incubate în 5% CO2 la 37 °C și tratate cu polibrenă (8 pg/mL) peste noapte într-o placă cu șase godeuri. În ziua următoare, supernatantul viral a fost aruncat, iar celulele au fost incubate într-un mediu proaspăt. După ce au ajuns la confluență, celulele au fost subcultivate într-un vas de 10-cm cu mediu de cultură și au fost considerate celule de pasaj unu (P1). Clonele transformate SV40-au fost selectate și izolate prin utilizarea inelelor de donare [17,18]. Linia celulară M-1 (Pkd1+/+) achiziționată de la BCRC (Hsinchu, Taiwan) a fost utilizată ca linie celulară de tip sălbatic.

2.2. Cultura celulară

Celulele au fost trecute la fiecare trei zile. Pentru a testa IC50 de mNGAL în celulele ADPKD, celulele 2L3 au fost însămânțate în 24-plăci de godeuri (6{000 celule/godeu) cu 500 µL de mediu descris mai sus și incubate pentru 16 h. Celulele au fost apoi tratate cu mNGAL recombinant (0, 20, 40, 80, 160, 320 pg/mL) sau rapamicină (1 pM, de la Sigma, St. Louis, MO, SUA) pentru încă 0, 8, 24 sau 48 h (n=4).

2.3. Colorarea cu lectină

Pentru a verifica dacă celulele M{{0}} și 2L3 au provenit din tubuli renali de origini similare, colorarea lectinei cu lectină Lotus tetragonolobus (LTL, care este un marker al tubului proximal diferențiat marcat cu fluoresceină) și aglutinină Dolichos biflorus (DBA). , care este un marker de canal colector diferențiat marcat cu rodamină). LTL și DBA au fost achiziționate de la Vector Laboratories (Burlingame, CA, SUA). Pentru observarea celulelor, celulele cultivate pe lamelă au fost spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) de trei ori timp de 10 minute și apoi fixate cu paraformaldehidă (PFA) 4% în PBS timp de 30 de minute. După permeabilizarea cu 0,4% Triton X-100 în PBS (PBST) timp de 20 de minute, celulele au fost blocate cu 10% ser de cal în PBST timp de 1,5 ore. Celulele au fost colorate cu LTL (20 pg/mL) și DBA (20 pg/mL) timp de 1 oră la 37 °C. Nucleii au fost colorați cu DAPI (1 pg/mL) timp de 5 minute. Probele au fost spălate cu PBST de trei ori timp de 10 minute între pași.

2.4. Lizat de ADN și genotipare

Pentru genotiparea genei Pkd1, primeri PCR înainte (50 -TGTGTTGTTCTTTGTGGCAGTCAG-30) și invers (50 -ATTCTCAATGACTGACTTGGGCTC-30) au fost utilizați pentru a amplifica secvențele de ADN genomic. Probele au fost încălzite la 94 °C timp de 5 minute, apoi au fost efectuate 30 de cicluri (94 °C timp de 1 min, 56 °C timp de 1 min, 72 °C timp de 1 min), urmate de 72 °C timp de 10 min și 25 °C. C timp de 5 min. După amplificare prin PCR, produsele ADN au fost amestecate cu colorant de încărcare 6x și analizate utilizând gel Tris-borat-EDTA (TBE) de agaroză 1%.

2.5. Reacția în lanț a polimerazei în timp real cu transcripție inversă cantitativă (RT–qPCR)

ARN-ul total din linia celulară a fost izolat folosind un kit de extracție MagQu gDNA (MagQu, New Taipei City, Taiwan) urmat de tratament cu DNază I (Worthington, Lakewood, NJ, SUA) și stocat în ddH2O la -80 ◦C. Calitatea și concentrația ARN au fost determinate folosind un gel de agaroză TBE 1% și un spectrofotometru NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). ARN-ul șablon a fost transcris invers la ADNc utilizând un kit de sinteză RevertAid First Strand cADN (Thermo Fisher Scientific) în prezența inhibitorului RNaseOUTTM RNase (G-Biosciences, St. Louis, MO, SUA). Fiecare reacție a fost preparată într-un volum total de 20 µL, incluzând ARN total (100 ng), primer Oligo (dT)18 (1 µL), tampon de reacție 5X (4 µL), inhibitor RiboLock RNază (20 U), amestec dNTP ( 1 mM), RevertAid Reverse Transcriptase (200 U) și apă fără nuclează. Pentru sinteza ADNc-ului primei catene, probele au fost încălzite la 42 °C timp de 1 oră, iar reacția a fost apoi încheiată prin încălzire la 70 °C timp de 1 min.

Cuantificarea expresiei genelor a fost efectuată utilizând un sistem StepOne™ Real-Time PCR (Applied Biosystems, Norwalk, CT, SUA). Fiecare probă a fost preparată într-un volum total de 20 µL, incluzând primeri specifici genei înainte (100 nM), inversi (100 nM) (Tabelul 1), șablon ADNc (100 ng), ORATM SEE qPCR Green ROX H Mix (1× , high GmbH, Kraichtal, Germania) și apă PCR. Probele au fost încălzite la 95 °C timp de 2 minute, urmate de 40 de cicluri (95 °C timp de 5 s, 65 °C timp de 25 s) și apoi analiza curbei de topire (95 °C timp de 15 s, 60 °C timp de 1 min. , 95 ◦C timp de 15 s) folosind un sistem StepOne™ Real-Time PCR. Datele au fost analizate cu software-ul StepOne™ (v2.3). Expresia genică a lui Gapdh a fost utilizată pentru normalizare.

2.6. Test de viabilitate celulară

Viabilitatea celulară a fost determinată utilizând bromură de tetrazoliu de albastru de tiazolil (test MTT) (Sigma). Soluția MTT (0,5 mg/mL) a fost adăugată în fiecare godeu și incubată la 37 ◦C timp de 2 ore. Pentru a solubiliza cristalele de formazan violet, a fost adăugat dimetil sulfoxid (DMSO, Sigma) în fiecare godeu după îndepărtare. soluția medie și MTT. Densitatea optică (OD) a fiecărei probe la 570 nm a fost măsurată folosind un cititor ELISA (Thermo Fisher Scientific).

2.7. Test de proliferare celulară

Testul de proliferare celulară cu bromodeoxiuridină (BrdU) (Millipore, Burlington, MA, SUA) a fost efectuat pentru a analiza proliferarea celulelor M-1 și 2L3. To compare the proliferation ability of M-1 and 2L3 cells, cells were cultured in 96-well plates (5 × 103 cells/well)for 24 h. BrdU was added to the medium 2 h before the end of the incubation period. Pentru a explora efectul mNGAL asupra proliferării celulelor 2L3, celulele 2L3 au fost mai întâi cultivate în plăci de 96-godeuri (2 × 103 celule/godeu) timp de 16 ore, urmate de tratament cu mNGAL pentru încă 8, 24 și 48 de ore. BrdU was added to the medium 2 h before the end of the meal incubation period. Celulele au fost apoi fixate cu soluție de fixare (200 µL/godeu) la 37 ◦C timp de 30 de minute, urmată de incubare cu anticorp de detectare BrdU (100 µL/godeu) la 37 ◦C timp de 1 oră și anticorp de capră anti-șoarece conjugat cu peroxidază. (100 µL/well) at 37 ◦C for 30 min. The cells were washed three times with Wash Buffer and blotted dry on paper towels between the above-described steps.

After incubation with TMB peroxidase substrate (100 µL/well) at 37 ◦C for 30 min in the dark, the reaction was stopped with stop solution (100 µL/well). Finally, the OD450 of each sample was measured using an ELISA reader (Thermo Fisher Scientific). 

2.8. Apoptosis Assay

For analysis of apoptosis using flow cytometry, 2L3 cells were seeded into 6-well plates (1.8 × 105cells/well) with 2 mL medium and incubated for 16 h. Cells were then treated with mNGAL (0, 600, 1200 µg/mL) for another 0, 4, or 12 h, collected and stained with Annexin V-FITC and PI (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) for analysis by flow cytometry at 4 and 12 h, respectively (n=3, for control and mNGAL). To establish compensation and quadrants before the analysis, unstained cells, cells stained with Annexin V-FITC only, and cells stained with PI only were used. 

2.9. Analiza Western Blot

Cells were harvested and lysed with RIPA supplemented with protease inhibitor cocktail (1:100) and phosphatase (1:100). Following incubation for 30 min at 4 ◦C, cell lysates were centrifuged for 15 min at 13,400× g (Eppendorf 5415R, Hamburg, Germany) at 4 ◦C. The concentrations of protein were measured using the BCA assay. Equal amounts of protein (25 µg protein with 1:2 loading dye/well) were electrophoretically separated by SDS–PAGE (10%) and transferred for 1 h to PVDF membranes. Membranes were then blocked with 5% skimmed milk in Tris-buffered saline with 0.1% Tween-20 (TBST) for 2 h at room temperature. After washing with TBST three times for 10 min, membranes were incubated with primary antibodies (Table 2) overnight at 4 ◦C, followed by a 1-h incubation with HRP-conjugated secondary antibodies (Table 3). 

2.10. Cultura celulară tridimensională (cultura 3D)

Cultura 3D a fost efectuată folosind matricea Matrigel (Corning, NY, SUA) pentru a evalua formarea chistului. Celulele 2L3 au fost însămânțate în plăci de 96-godeuri (1000 celule/godeu) pe Matrigel preformat (40% în mediu). După ce celulele au fost atașate de gel, mai mult Matrigel a fost adăugat la celule pentru a forma un model de tip sandwich (Figura 6). Celulele au fost menținute în cultură 3D la 37 ◦ C și 5% CO2. Celulele au fost tratate cu forskolin (20 mM, Sigma) din ziua 1 până în ziua 3 pentru a induce formarea chistului. După inducerea formării chistului cu forskolin, celulele au fost tratate cu sau fără mngal (2 mg/ml) din zilele 4 la 8, iar mediul a fost schimbat în fiecare zi. Formarea chistului a fost observată la microscop în fiecare zi, iar diametrul, aria și numărul chistului au fost măsurate cu ImageJ. Imunocitochimia (ICC) a fost efectuată în ziua 8 pe placă sau lamele. Observarea chisturilor a fost efectuată prin microscopie confocală (ZEISS, Oberkochen, Germania).

2.11. Imunocitochimie (ICC)

Pentru observarea chisturilor, chisturile cultivate cu Matrigel în godeuri sau pe lame de acoperire au fost spălate de trei ori cu PBS timp de 10 min și apoi fixate cu 4% paraformaldehidă (PFA) în PBS timp de 30 de minute. După permeabilizarea cu 0,4% PBST timp de 20 de minute, chisturile au fost blocate cu 10% ser de cal în PBST timp de 2 ore. Chisturile au fost colorate cu anticorpi primari împotriva E-caderinei (1:500; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SUA) și actinei (1:1000; Millipore) peste noapte la 4 ◦C și apoi colorate cu anticorp secundar fluorescent (Tabelul 3) la întuneric timp de 1 oră la temperatura camerei. Nucleii au fost colorați cu DAPI (1 pg/mL) timp de 5 minute. Probele au fost spălate cu PBST de trei ori timp de 10 minute între pași.

2.12. Microscopie confocală

Pentru a confirma că constructele sferice observate în cultura 3D au fost chisturi, lamele din cultura 3D au fost montate pe lame cu mediu de montare Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL, SUA) și au fost fotografiate folosind un microscop confocal. Imagistica confocală a fost efectuată cu un obiectiv de imersie în ulei de 63×. Diferite secțiuni optice z ale unui chist 2L3 în cultură 3D au fost obținute folosind modulul Z-stack din software-ul de microscop ZEISS ZEN (Oberkochen, Germania). Secțiuni optice de chisturi au fost reconstruite în Z-stack sau video 3D folosind software-ul de microscop ZEISS ZEN.

2.13. Construcția plasmidelor și infecția cu virus

Secvența NGAL de șoarece (534 pb) a fost inserată în vectorul pSecTag2B (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) în cadrul și în aval de o secvență lider de lanț Igk murin pentru a supraexprima proteina NGAL secretată. Dimpotrivă, secvența lider al lanțului Igk murin din plasmida descrisă mai sus a fost îndepărtată pentru a supraexprima proteina NGAL nesecretată. pSecTag2B-NGAL cu sau fără secvența lider (pN + LS sau pN - LS, respectiv) a fost conceput pentru a studia asocierea dintre NGAL și receptorul NGAL. Pentru a asigura inserarea corectă a constructelor, NheI și NotI au fost folosite pentru a digera pN + LS sau pN - LS cu NEBuffer 2 (New England Biolabs, Ipswich, MA, SUA) la 37 °C timp de 2 ore, urmată de analiză folosind o concentrație de 1% gel TBE.

Pentru a genera clone stabile, celulele 2L3 au fost incubate în mediu DMEM/F12 (300 µL/godeu) suplimentat cu 10% FBS inactiv la căldură, 1% P/S, polibrenă (8 µg/mL) și lentivirus (200 µL) în o placă de 6-godeuri la 37 ◦C timp de 24 de ore. Supernatantul de virus a fost apoi aruncat, iar celulele au fost spălate cu PBS și incubate cu mediu proaspăt care conține blasticidină (4 pg/mL) pentru selectarea celulelor infectate. Mediul de selecție a fost schimbat la fiecare 3 zile. Celulele infectate au fost recoltate la o săptămână după selecția blasticidinei pentru western blot și RT-QPCR pentru a analiza nivelul de expresie a mNGAL.

2.14. Testul imunosorbant legat de enzime (ELISA)

Cuantificarea NGAL secretată de celule a fost efectuată utilizând un kit ELISA sandwich în fază solidă cu lipocalină de șoarece {{0}} (Lcn2) (Thermo Fisher Scientific). Mediul supernatant al celulelor a fost colectat, centrifugat pentru a îndepărta resturile celulare și stocat la -80 ◦C. Pentru curba standard, s-au preparat diluții în serie de 8x ale proteinei NGAL de șoarece standard (0, 0,024, 0,195, 1,563, 12,5, 100 ng/mL). Standardele (100 µL/godeu) și probe (100 µL/godeu de 10 µg proteină totală din lizat de celule sau supernatant nediluat) au fost adăugate pe placa de godeuri 96-și incubate la 37 ◦C timp de 2,5 ore. Fiecare godeu a fost incubat cu conjugat de biotină (100 µL/godeu) la 37 ◦C timp de 1 oră și apoi cu soluție de streptavidină-HPR (100 µL/godeu) la 37 ◦C timp de 45 de minute cu agitare ușoară. Soluția a fost aruncată și godeul a fost spălat cu

După incubarea cu substrat TMB (100 µL/godeu) la 37 ◦C timp de 30 de minute în întuneric, reacția a fost oprită prin adăugarea de soluție de oprire (50 µL/godeu). În cele din urmă, OD450 al fiecărei probe a fost măsurat utilizând un cititor ELISA (Thermo Fisher Scientific).

2.15. Analiza Statistică

Toate datele sunt afișate ca medie ± abaterea standard (SD). Pentru comparații medii multiple, datele au fost analizate utilizând testul t Student și analiza unidirecțională a varianței (ANOVA) cu testele post-hoc ale lui Tukey în R studio. Diferențele au fost considerate semnificative statistic atunci când valoarea p < 0.05.