Soluția UW suplimentată cu tiosulfat de sodiu protejează grefele renale împotriva leziunilor prelungite de ischemie-reperfuzie la rece într-un model murin de transplant renal singeneic

Contact: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang și colab

Cistanche tubulosa previnerinichiboala, faceți clic aici pentru a obțineproduse si Cistanche Nz

ABSTRACT

Introducere:Leziunea de ischemie-reperfuzie la rece (IRI) este un eveniment inevitabil care crește complicațiile post-transplant. Am demonstrat anterior că suplimentarea soluției de la Universitatea din Wisconsin (UW) cu molecule donatoare de hidrogen sulfurat (H2S) neaprobate de FDA minimizează IRI rece și îmbunătățește funcția grefei renale după transplant. Prezentul studiu investighează dacă o moleculă donor H2S aprobată de FDA, tiosulfatul de sodiu (STS), va avea același efect sau un efect superior într-un model de șobolan relevant din punct de vedere clinic de ortotopic singeneic.rinichitransplant.

Metodă:Treizeci de șobolani Lewis au suferit nefrectomie bilaterală urmată de transplant ortotopic singeneic al stângirinichidupă 24-oră de conservare în UW sau UW plus soluție STS la 4 ◦C. Șobolanii au fost monitorizați până în ziua 14 post-transplant și sacrificați pentru a evalua funcția renală (debitul de urină, creatinina serică și azotul ureic din sânge).Rinichisecțiunile au fost colorate cu H&E, TUNEL, CD68 și mieloperoxidază (MPO) pentru a detecta necroza tubulară acută (ATN), apoptoza, infiltrarea macrofagelor și infiltrarea cu neutrofile.

Rezultat:Grefele UW plus STS au arătat o funcție a grefei îmbunătățită semnificativ imediat după transplant, cu o supraviețuire îmbunătățită a primitorului în comparație cu grefele UW (p <{{0}}}.05). examenul="" histopatologic="" a="" evidențiat="" o="" reducere="" semnificativă="" a="" infiltrației="" atn,="" apoptoză,="" macrofage="" și="" neutrofile="" și="" reglarea="" în="" jos="" a="" genelor="" pro-inflamatorii="" și="" pro-apoptotice="" în="" grefele="" uw="" plus="" sts="" comparativ="" cu="" grefele="" uw="" (p=""><>

Concluzie:Arătăm pentru prima dată că păstrarea grefelor renale în soluție UW suplimentată cu STS protejează împotriva IRI rece prelungită prin suprimarea căilor apoptotice și inflamatorii și, prin urmare, îmbunătățind funcția grefei și prelungind supraviețuirea primitorului. Aceasta ar putea reprezenta o nouă strategie terapeutică aplicabilă clinic pentru a minimiza rezultatul clinic dăunător al IRI rece prelungită înrinichitransplant.

Cuvinte cheie:Tiosulfat de sodiu (STS) Leziuni de ischemie-reperfuzie (IRI) Depozitare statică la rece (SCS)Rinichitransplant Supraviețuirea grefei și a primitorului

1. Introducere

Rinichitransplantul este tratamentul optim pentru stadiul terminalrinichirenalboala (IRST). Comparativ cu dializa,rinichitransplantul este superior, deoarece oferă o calitate mai bună a vieții și conferă un avantaj semnificativ de supraviețuire împreună cu rentabilitatea sa [1–3]. Totuși, obținerea rinichilor donatorului este asociată în mod inerent cu leziunea de ischemie-reperfuzie (IRI), o consecință inevitabilă a încetării și restabilirii ulterioare a fluxului sanguin în timpul transplantului [4]. Strategia actuală de atenuare a IRI indusă de transplant este depozitarea statică la rece (SCS) a grefelor renale în soluții standard de conservare, cum ar fi soluția de la Universitatea din Wisconsin (UW) pe gheață la 4 ◦C în perioada pre-transplant [5]. Cu toate acestea, SCS prelungit s-a dovedit a fi asociat cu moartea celulară crescută, inflamație și alte evenimente celulare și moleculare dăunătoare, care în cele din urmă duc la o incidență crescută a funcției întârziate a grefei (DGF), a necrozei tubulare acute (ATN) și a scăderii grefei. supraviețuire [6–10]. În plus, pentru a ține pasul cu incidența în creștere la nivel global a BRST și cu un număr tot mai mare de pacienți pe listele de așteptare pentru transplant, multe centre de transplant acceptă grefe renale cu perioade ischemice rece prelungite, ceea ce contribuie și mai mult la deteriorarea totală a țesuturilor. După SCS este reperfuzia, când sângele cald oxigenat este restabilit în grefa ischemică rece. Reperfuzia, care este faza efectoră a leziunii ischemice, se caracterizează printr-o leziune tisulară crescută [11–13].

O potențială strategie terapeutică pentru a limita IRI rece în timpulrinichitransplantul implică suplimentarea soluției standard de conservare cu hidrogen sulfurat (H2S), un gazotransmițător produs endogen despre care s-a demonstrat că joacă roluri fiziologice importante în vasodilatație și semnalizare celulară [14-16]. Am arătat anterior că SCS prelungit în soluția UW suplimentată cu H2S reduce IRI rece indus de transplant și îmbunătățește supraviețuirea grefei în modelele murine de transplant de rinichi singeneic și alogenic [17–19,41,42]. Cu toate acestea, moleculele donatoare de H2S utilizate în aceste studii nu sunt viabile clinic. Acest lucru a condus la luarea în considerare a utilizării tiosulfatului de sodiu (STS), un medicament donator de H2S care este aprobat de Food and Drug Administration (FDA) pentru a trata calcifilaxia la pacienții cu IRST, toxicitatea indusă de cisplatină în terapia cancerului și ca antidot pentru intoxicații cu cianuri [20–23]. Studii recente au arătat că STS prezintă efecte protectoare în modelele animale de IRI [24–26]. Cu toate acestea, efectul său asupra IRI renală rece indus de transplant este necunoscut. Prin urmare, prezentul studiu investighează efectele renoprotective ale STS într-un model in vitro de IRI renal și model de șobolan de transplant de rinichi ortotopic singeneic.

2. Materiale și metode

2.1. Protocol experimental in vitro

Un model in vitro de hipoxie rece și leziuni de reoxigenare caldă care imită condițiile celulare în timpul IRI rece in vivo a fost utilizat pentru a evalua efectele protectoare ale STS în timpul IRI renal. Celulele epiteliale ale rinichilor de șobolan (linia celulară NRK{{0}}E; ATCC, SUA) au fost utilizate în experimentele in vitro, deoarece aceste celule sunt susceptibile la leziuni ischemice [27], iar utilizarea lor este în concordanță cu șobolanul. model de transplant utilizat pentru al doilea scop al acestui studiu. Celulele au fost cultivate în Mediu Eagle Modificat Dulbecco (DMEM) care conține 10 procente ser fetal bovin (FBS) inactivat prin căldură la 60 °C timp de 20 de minute și 1 procente penicilină/streptomicina (P/S). Celulele au fost incubate în condiții normale de creștere de 37◦C, 21% O2 și 5% CO2. Celulele martor au fost în condiții identice cu cele pentru celulele pre-experimentale. Celulele experimentale au fost tratate fie cu mediu fără ser (SF), SF plus 200 nM AP39, fie SF cu concentrații diferite (50 uM, 150 uM, 500 uM, 1 mM) de tiosulfat de sodiu pentahidrat (STS), care au fost obținute din o soluție injectabilă de 250 mg/mL de STS (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]). A fost utilizată o concentrație de 200 nM AP39 deoarece am arătat anterior că AP39 la această concentrație este citoprotector împotriva aceleiași linii celulare într-un model similar de IRI rece [20]. Celulele au fost apoi incubate la 10 ◦ C timp de 24 de ore în condiții hipoxice (5% CO2, 0,5% O2, 95% N2) în camera de hipoxie HypOxystation H85 (HYPO2YGEN, SUA) pentru a induce leziuni ischemice la rece. A fost utilizată o temperatură hipotermă de 10 ◦C deoarece aceasta a fost cea mai scăzută temperatură care ar putea fi atinsă tehnologic, menținând în același timp un nivel de hipoxie de 0,5% O2. După hipoxie, mediul care conținea celule experimentale a fost înlocuit cu medii de control, iar celulele au fost reoxigenate prin incubare în condiții normale de creștere (37 °C, 21% O2 și 5% CO2) timp de 24 de ore pentru a simula reperfuzia și leziunea asociată acesteia. După 24 de ore de reoxigenare, viabilitatea celulară a fost evaluată prin colorarea celulelor cu anexin-V conjugat cu FITC (FITC-Annexin-V; BioLegend, SUA) și 7-Aminoactinomicina D ({7-AAD; BioLegend, SUA) ), care măsoară apoptoza și, respectiv, necroza celulară. Celulele au fost analizate prin citometrie în flux folosind CytoFLEX S (Beckman Coulter, SUA). FlowJo versiunea 11 (FlowJo LLC, SUA) a fost utilizată pentru a porți în mod corespunzător datele pentru analiza statistică.

2.2. Animale experimentale

Treizeci de șobolani Lewis masculi cântărind 275-300 g și achiziționați de la Charles River (St. Constant, QC, Canada) au fost găzduiți în unitatea de îngrijire a animalelor și servicii veterinare de la Universitatea Western (London, ON) în condiții standard. Studiile pe animale au fost aprobate de către Western University Council on Animal Care and Animal Use cu un protocol ID 2018-155.

2.3. Model de transplant de rinichi

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >20% pierdere în greutate) sau moarte. Obiectivele umane au fost verificate de două ori pe zi și toți șobolanii au fost eutanasiați prin expunerea la CO2 într-o cameră la un debit de 40%. La momentul eutanasiei, nu existau complicații chirurgicale care ar fi putut duce la variații ale rezultatelor.

2.4. Analiza funcției renale

După transplantul de rinichi, șobolanii au fost monitorizați în cuști metabolice timp de 14 zile și apoi sacrificați. Au fost colectate probe de sânge și urină pe POD 3, 5, 7, 10 și 14 pentru a determina parametrii funcției renale (creatinina serică, azotul ureic din sânge [BUN], osmolalitatea urinei și cantitatea de urină). BUN și creatinina serică au fost de la primitorii de transplant de rinichi și șobolanii operați de simulare au fost măsurați folosind aparatul IDEXX Catalyst One Chemistry Analyzer (Markham, ON). Nivelurile de osmolalitate ale urinei au fost determinate prin osmometrie la punctul de îngheț folosind mașina de osmometru 3320 (Advanced Instruments, Norwood, MA) și comparate cu standardele furnizate de companie.

2.5. Analiza histopatologică și morfometrică

Țesuturile renale încorporate în parafină au fost tăiate în secțiuni de 4 um grosime și montate pe lame microscopice pentru histologie. Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină și eozină (H&E), deoxinucleotidil transferază terminală dUTP nick end labeling (TUNEL) pentru a determina gradul de ATN și respectiv apoptoză. Secțiunilor H&E li s-a atribuit un scor pentru ATN de către un patolog renal orb, conform următoarei scheme: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 la sută grefă ATN. Secțiunile de rinichi au fost, de asemenea, colorate cu următorii anticorpi primari: marker de leziune renală (KIM-1), marker de suprafață macrofagelor CD68 și mieloperoxidază enzimă specifică neutrofilelor (MPO; Abcam®, Toronto, Canada) și vizualizate cu anticorpi secundari și Cromogenul substratului DAB utilizând sistemul Dako Envision (Dako, Glostrup, Danemarca) conform protocolului producătorului, urmat de analizat la microscop cu lumină digitală Eclipse 90i (Nikon® Instruments, New York) la o mărire de 10x și cuantificat cu software-ul ImageJ v. 1.8 (Național). Institute of Health, Bethesda, MD).

2.6. Analiza PCR cantitativă

ARN-ul total a fost izolat din țesuturile grefei renale obținute la POD 3 utilizând RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Toronto, Canada) și transcris invers în cADN utilizând OneScript® Plus cDNA synthesis Kit (ABM, Canada) în combinație cu oligo(dT)12– 18 grunduri conform protocolului producătorului. ARN-ul izolat și ADNc au fost analizate prin nanodrop (spectrofotometru DeNovix DS-11, Canada) înainte de utilizare, cu evaluări A260/280 în mod constant > 1,95 și, respectiv, > 1,8. Amestecul de reacție al fiecărei probe qPCR a avut un volum de 20 µL și a fost realizat conform protocolului Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Canada) și analizat folosind mașina CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Canada) . Secvențele de primer au fost proiectate folosind software-ul Primer-BLAST (NCBI) împotriva beta-actină, poli (ADP-riboză) polimerază (PARP), interferon-gamma (IFN-), factor de necroză tumorală-alfa (TNF-), interleukina 6 (IL). -6), limfomul cu celule B 2 (Bcl{-2), proteina X asociată cu Bcl{-2- (BAX), caspaza 3, agonist al morții din domeniul de interacțiune BH3 (BID), c-Jun kinaza N-terminală 1/2 (JNK1/2), coactivator Pparg 1 alfa (PGC-1), complexul mitocondrial I (NDUFB8), complexul mitocondrial II (SDHB), protein kinaza 1/2 activată de mitogen (ERK1) /2), genele neutrofile gelatinaze lipocalin (NGAL) și molecule de leziune renală-1 (KIM{-1). Toate genele de interes au fost normalizate împotriva beta-actinei. Modificările de pliere ale expresiei genelor au fost comparate cu șobolanii operați de Sham și au fost calculate folosind metoda ΔΔCt.

2.7. analize statistice

Toate analizele statistice au fost efectuate folosind pachetul software statistic GraphPad (La Jolla, CA) Prism, versiunea 9.0. Datele de supraviețuire au fost analizate utilizând analiza de supraviețuire Kaplan-Meier și testul de rang log, în timp ce datele despre expresia genei qPCR au fost analizate utilizând testul t unidirecțional neîmperecheat. Toate celelalte date au fost analizate utilizând analiza unidirecțională a varianței (ANOVA), urmată de testul post-hoc al lui Tukey pentru a determina diferențele statistice între grupuri. Semnificația statistică a fost acceptată la p<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Rezultate

3.1. Mediile fără ser suplimentate cu STS îmbunătățesc supraviețuirea celulelor epiteliale tubulare renale în timpul hipoxiei/reoxigenării la rece

Analiza citometriei în flux după colorarea pentru apoptoză și necroză a arătat că celulele NRK{{0}}E tratate cu SF în timpul IRI rece in vitro au prezentat o viabilitate celulară semnificativ scăzută în comparație cu celulele de control (normoxice) (Fig. 1A; p < 0.05).="" în="" timp="" ce="" toate="" probele="" experimentale="" au="" arătat="" o="" viabilitate="" semnificativ="" mai="" mică="" a="" celulelor="" epiteliale="" tubulare="" renale="" decât="" celulele="" crescute="" în="" condiții="" normoxice="" (p="">< 0.05),="" celulele="" tratate="" cu="" sf="" suplimentat="" cu="" 150="" µm="" și="" 500="" µm="" sts="" au="" prezentat="" o="" viabilitate="" semnificativ="" mai="" mare="" decât="" cele="" tratate.="" cu="" mediu="" sf="" singur="" (fig.="" 1a;="" p="">< 0,05),="" care="" a="" corespuns="" cu="" apoptoză="" semnificativ="" redusă="" în="" comparație="" cu="" celulele="" tratate="" numai="" cu="" mediu="" sf="" (fig.="" 1b;="" p="">< 0,05).="" în="" plus,="" creșterea="" viabilității="" celulare="" și="" scăderea="" apoptozei="" pare="" să="" atingă="" niveluri="" optime="" cu="" 150="" um="" și="" 500="" um="" sts,="" deoarece="" o="" doză="" mai="" mare="" a="" inversat="" aceste="" tendințe="" (fig.="" 1a="" și="">

3.2. Suplimentarea soluției UW cu STS îmbunătățește supraviețuirea și funcția grefei renale timpurii

Conservarea grefelor renale în soluția UW suplimentată cu STS a îmbunătățit semnificativ supraviețuirea primitorului cu 83% supraviețuire până la POD 14 (ziua sacrificiului) în comparație cu grupul de control fără suplimentarea STS, care a arătat o supraviețuire de 12,5%, în special în primele 3 zile (Fig. 2A; p < 0.05).="" în="" plus,="" suplimentarea="" sts="" a="" îmbunătățit="" semnificativ="" funcția="" grefei="" în="" timpul="" perioadei="" timpurii="" post-transplant="" în="" comparație="" cu="" tratamentul="" cu="" uw="" singur.="" nivelurile="" serice="" de="" creatinine="" și="" bun="" au="" fost="" semnificativ="" crescute="" atât="" în="" ​​grupurile="" uw,="" cât="" și="" uw="" plus="" sts="" pe="" pod="" 3,="" ceea="" ce="" s-a="" corelat="" cu="" osmolalitatea="" urinei="" scăzută="" în="" comparație="" cu="" sham="" (figurile="" 2b,="" c="" și="" 3a;="" p="">< 0.{{25}="" }}5).="" cu="" toate="" acestea,="" nivelurile="" de="" creatinine="" serice="" și="" bun="" în="" grupul="" uw="" plus="" sts="" au="" scăzut="" semnificativ="" pe="" pod="" 3="" cu="" o="" creștere="" corespunzătoare="" a="" osmolalității="" urinei="" în="" comparație="" cu="" grupul="" uw="" (fig.="" 2b,="" c="" și="" 3a;="" p="">< 0,05).="" interesant="" este="" că="" nivelurile="" de="" creatinine="" serice="" și="" bun="" în="" grupul="" uw="" plus="" sts="" au="" scăzut="" constant="" de="" la="" pod="" 3="" la="" pod="" 14="" cu="" osmolalitate="" crescută="" a="" urinei="" și="" au="" fost="" comparabile="" cu="" cele="" ale="" sham="" (figurile="" 2b,="" c="" și="" 3a).="" de="" asemenea,="" producția="" de="" urină="" în="" grupul="" uw="" plus="" sts="" a="" fost="" semnificativ="" mai="" mare="" în="" primele="" patru="" zile="" postoperatorii="" în="" comparație="" cu="" grupurile="" uw="" și="" sham="" (fig.="" 3b;="" p="">< 0,05).="" cu="" toate="" acestea,="" a="" scăzut="" constant="" spre="" valoarea="" inițială="" (sham)="" și="" a="" fost="" comparabilă="" cu="" cea="" a="" sham="" pe="" pod="" 14,="" în="" timp="" ce="" producția="" de="" urină="" la="" șobolanul="" supraviețuitor="" din="" grupul="" uw="" a="" rămas="" mai="" mare="" decât="" valoarea="" inițială="" pe="" pod="" 14="" (fig.="">

3.3. Adăugarea de STS la soluția UW atenuează moartea celulară indusă de transplant după transplantul de rinichi

Secțiunile de rinichi obținute pe POD 3 și 14 au fost colorate cu TUNEL ca măsură a morții celulelor apoptotice și au fost marcate de un patolog renal orb (Fig. 4A). Grefele renale din grupul UW au prezentat o moarte celulară apoptotică semnificativ mai mare pe POD 3, așa cum este indicat de scorul TUNNEL mai mare în comparație cu rinichii din grupurile UW plus STS și Sham (Fig. 5A și b; p < 0.{{11}="" }5).="" grefele="" din="" grupul="" uw="" plus="" sts="" nu="" au="" fost="" semnificativ="" diferite="" în="" comparație="" cu="" cele="" ale="" sham="" în="" același="" punct="" de="" timp="" și="" la="" pod="" 14="" (fig.="" 4b).="" în="" plus,="" în="" timp="" ce="" grefele="" din="" ambele="" grupuri="" uw="" și="" uw="" plus="" sts="" au="" prezentat="" scoruri="" atn="" semnificativ="" crescute="" la="" pod="" 3="" în="" comparație="" cu="" grupul="" sham="" (fig.="" 5;="" p="">< 0.{05),="" grefele="" uw="" plus="" sts="" a="" arătat="" scoruri="" atn="" scăzute="" pe="" pod="" 3="" comparativ="" cu="" uw="" (fig.="" 5;="" p="">< 0,05).="" de="" asemenea,="" în="" timp="" ce="" primitorii="" de="" grefe="" uw="" nu="" au="" supraviețuit="" până="" la="" pod="" 14="" și,="" prin="" urmare,="" scorurile="" lor="" atn="" nu="" au="" putut="" fi="" determinate="" pe="" pod="" 14,="" cei="" ai="" grefelor="" uw="" plus="" sts="" au="" supraviețuit="" până="" la="" pod="" 14,="" dar="" au="" prezentat="" scoruri="" atn="" semnificativ="" crescute="" în="" comparație="" cu="" grupul="" sham="" (fig.="" 5;="" p=""><>

3.4. Grefele renale conservate în soluție UW suplimentată cu STS au prezentat scăderea markerilor de leziune și infiltrat inflamator după transplantul de rinichi

Secțiunile de rinichi obținute pe POD 3 și 14 au fost colorate cu KIM-1 pentru a detecta leziunile tubulare proximale, precum și CD68 (marker de macrofage) și MPO (marker de neutrofile) și au fost marcate de un patolog renal orb (Fig. 6A, 7A, și C). Expresia țesutului renal a KIM-1, CD68 și MPO a fost semnificativ mai mare în grupul UW pe POD 3 în comparație cu cele ale grupurilor UW plus STS și Sham (Figurile 6B, 7B și D; p < {{11}="" }.05)="" în="" timp="" ce="" expresia="" acestor="" markeri="" în="" grefele="" uw="" plus="" sts="" nu="" a="" fost="" semnificativ="" diferită="" în="" comparație="" cu="" sham="" pe="" pod="" 14="" (figurile="" 6b,="" 7b="" și="" d;="" p=""> 0,05).

3.5. Suplimentarea STS la soluția UW a suprimat expresia renală a genelor pro-inflamatorii, pro-apoptotice și mitocondriale

Expresia genică a markerilor pro-inflamatori, pro-apoptotici, direcționați pe mitocondrii și leziuni renale a fost determinată prin qRT-PCR în rinichi transplantați obținuți pe POD 3. Expresia genelor proinflamatorii IFN-, TNF- și IL{8 }} au crescut semnificativ în grefele UW comparativ cu grefele UW plus STS pe POD 3 (Fig. 8A; p <0.{05) și="" au="" urmat="" același="" model="" cu="" genele="" pro-apoptotice="" parp,="" bax="" ,="" caspaze-3,="" bid,="" jnk1="" și="" jnk2="" (fig.="" 8a;="" p=""><0.05), în="" timp="" ce="" expresia="" bcl-2="" anti-apoptotică="" a="" fost="" ușor="" crescută="" în="" uw="" plus="" grupul="" sts="" comparativ="" cu="" grupul="" uw,="" deși="" această="" creștere="" nu="" a="" atins="" semnificație="" statistică="" (fig.="" 8a).="" în="" plus,="" expresia="" genelor="" mitocondriale="" pgc-1,="" ndufb8="" (complexul="" i)="" și="" sdhb="" (complexul="" ii)="" în="" grefele="" uw="" a="" fost="" semnificativ="" scăzută="" în="" comparație="" cu="" grefele="" uw="" plus="" sts="" (fig.="" 8b;="" p=""><0 .05)="" în="" timp="" ce="" inversul="" a="" fost="" observat="" cu="" expresiile="" erk1="" și="" erk2="" (fig.="" 8b;="" p="">< 0,05).="" în="" plus,="" expresia="" genei="" kim-1="" în="" grefele="" uw="" a="" fost="" semnificativ="" crescută="" în="" comparație="" cu="" grefele="" uw="" plus="" sts="" (fig.="" 8c;="" p="">< 0,05),="" în="" timp="" ce="" scăderea="" expresiei="" ngal="" în="" grefele="" uw="" plus="" sts="" nu="" a="" atins="" semnificație="" statistică="" în="" comparație="" cu="" cea="" din="" grefele="" uw="" plus="" sts.="" grefe="" uw="" (fig.="" 8c;="" p=""> 0,05).

4. Discutie

Acest studiu stabilește suplimentarea soluției standard de conservare cu STS, un donator de H2S aprobat de FDA, viabil clinic, pentru a atenua IRI renal rece indus de transplant, pentru a îmbunătăți calitatea grefei și a prelungi supraviețuirea primitorului. Folosind un model in vitro de IRI renal și un model de șobolan de transplant de rinichi ortotopic singeneic, demonstrăm pentru prima dată că suplimentarea soluției UW cu STS în timpul SCS prelungit este protectoare pentru și organ.

Constatarea principală a modelului nostru in vitro este că suplimentarea STS în medii fără ser protejează celulele epiteliale renale de hipoxia rece și apoptoza indusă de reoxigenarea caldă și crește viabilitatea, ceea ce este în concordanță cu studiul nostru anterior în care am arătat efectele protectoare ale mitocondriilor. -țintirea medicamentului donator H2S, AP39, într-un model in vitro de IRI renală rece [20]. Interesant este că o concentrație mai mare de STS de 1 mM a inversat efectele benefice, ceea ce implică faptul că STS prezintă un fenomen bifazic de răspuns la doză, denumit hormeză, în care o concentrație mai mică este citoprotectoare, în timp ce o concentrație mai mare este citotoxică. Lezarea mitocondrială este o consecință majoră a IRI renală, deoarece permeabilitatea mitocondrială poate inhiba producția de adenozin trifosfat (ATP) și poate crește formarea speciilor reactive de oxigen (ROS), un mediator distructiv al leziunii tisulare [13]. S-a sugerat recent că mitocondriile sunt un loc principal al activității STS. Se știe că STS nu numai că generează H2S în mitocondrii prin reducerea dependentă de glutation și viceversa prin calea de oxidare a sulfurilor, dar, de asemenea, păstrează sinteza ATP mitocondrială, scade producția de ROS și îmbunătățește activitățile complexe ale enzimelor în lanțul de transport de electroni (ETC) [24] ,28–30]. În plus, studii recente au arătat că STS a crescut semnificativ expresia PGC-1, un regulator pozitiv al biogenezei mitocondriale și al producției de ATP [26], ceea ce este în acord cu observația noastră in vivo. Aceste mecanisme moleculare ar putea explica expresia semnificativ crescută a complexelor mitocondriale ETC I și II (NDUFB8 și, respectiv, SDHB) în modelul nostru de transplant de rinichi, cu supraviețuire și funcție crescute, așa cum s-a observat în grefele renale conservate în soluția UW suplimentată cu STS.

Pe baza rezultatelor noastre in vitro, am decis să investigăm dacă efectul protector al STS este aplicabil in vivo folosind un model de transplant în care IRI rece contribuie major la disfuncția grefei și la creșterea complicațiilor post-transplant. Descoperirile noastre arată că SCS prelungit (24 de ore) a grefelor renale în soluția UW suplimentată cu STS îmbunătățește semnificativ calitatea și funcția grefei, caracterizată prin scăderea creatininei serice și a nivelurilor BUN, producție de urină mai mare și supraviețuirea prelungită a primitorului în comparație cu grefele conservate numai în soluția UW. . Este important de remarcat faptul că debitul imediat de urină chiar și după transplantul clinic de rinichi este un rezultat critic care determină dacă dializa este necesară pentru a aborda funcția întârziată a grefei (DGF). Prin urmare, observația noastră că STS crește producția de urină imediat după transplant și este comparabilă cu grupul Sham de pe POD 14 este o descoperire promițătoare. Îmbunătățirea observată a funcției renale după transplantul de grefe conservate în soluție UW suplimentată cu STS a conferit, de asemenea, un avantaj semnificativ de supraviețuire. Cantitativ, suplimentarea cu STS a prelungit durata de viață a grefei astfel încât 83% (5/6) dintre șobolanii care au primit grefe UW plus STS au supraviețuit până la POD 14 (ziua sacrificiului), comparativ cu doar 12,5% (1/8) dintre șobolanii primitori de grefe conservate în soluție UW fără suplimentarea STS. Această constatare din studiul de față se aliniază, de asemenea, cu studiul nostru anterior, în care doar 14% (1 din 7) dintre șobolanii primitori ai grefelor au fost conservați în soluție UW timp de 24 de ore fără suplimentarea cu H2S (GYY4137), supraviețuind până la POD 14 [20] .

Pe lângă faptul că arată o îmbunătățire a parametrilor funcției renale, suplimentarea cu STS a inhibat și apoptoza și inflamația grefei renale prin scăderea expresiei tisulare a genelor pro-apoptotice și pro-inflamatorii, în timp ce, simultan, reglarea genelor anti-apoptotice și scăderea macrofagelor CD{{3}pozitive și Neutrofile MPO-pozitive, care au avut ca rezultat reducerea expresiei KIM-1 și ATN și, în cele din urmă, au păstrat morfologia renală. Aceste citokine inflamatorii sunt cunoscute a fi mediatori ai morții celulare în timpul IRI rece [31], iar reducerea lor în grefele UW plus STS se datorează probabil caracteristicilor binecunoscute ale STS de a scădea permeabilitatea endotelială în monostratul endotelial vascular, atenuează producția de citokine. și provoacă producția de citokine antiinflamatorii [32]. De asemenea, descoperirea noastră că suplimentarea STS la soluția UW reglează în jos expresia genelor proinflamatorii se potrivește cu cea a unui studiu anterior privind activitatea antiinflamatoare a STS prin reducerea nivelurilor de TNF- și IL-6 în bolile neurologice [33]. ,34]. Din punct de vedere mecanic, STS inactivează caspaza-3 prin atașarea la site-ul său activ prin legături puternice de hidrogen și împiedicând astfel accesul substratului natural la locul activ, oprind în cele din urmă apoptoza [35]. STS blochează, de asemenea, activarea JNK, o proteină care joacă un rol critic în semnalizarea apoptotică [35], ceea ce susține descoperirea noastră cu privire la efectul de reglare descendentă a STS asupra caspazei3 și JNK. Cu toate acestea, nu putem determina dacă astfel de mecanisme sunt operaționale în studiul de față, deoarece nu am efectuat experimente suplimentare pentru a explora aceste mecanisme moleculare.

O limitare majoră a experimentului nostru in vitro este provocarea noastră tehnică de a folosi temperatura standard actuală de conservare 4 ◦ C [36], deoarece 10 ◦ C pe care am folosit-o a fost cea mai scăzută temperatură care ar putea fi atinsă tehnologic fără a pune în pericol mediul hipoxic. Aceasta este o diferență reală în ceea ce privește procesele fiziologice celulare și, de asemenea, în tehnicile de conservare. O posibilă soluție este utilizarea hipoxiei induse chimic într-o pungă de plastic și plasarea acesteia într-un frigider de 4 ◦C pentru a reflecta setările clinice ale SCS. Cu toate acestea, aceste pungi de generare a atmosferei anaerobe au fost proiectate pentru a fi utilizate la temperaturi calde (21–37 ◦C), deoarece compușii chimici care induc mediul hipoxic funcționează în această condiție. Studiile viitoare ar trebui să urmărească optimizarea temperaturii din camera de hipoxie pentru a imita setările clinice de SCS. Atingerea unei temperaturi consistente de 4 ◦ C fără a compromite un mediu hipoxic ne va permite să determinăm dacă fenotipurile observate în modelul experimental IRI la rece in vitro sunt exprimate în mod consecvent. În afară de experimentul in vitro, modelul nostru de transplant de șobolan nu este lipsit de un dezavantaj. Am efectuat transplant de rinichi singeneic (donatori și primitori identici genetic cu compatibilitate imunologică), care este aplicabil numai gemenilor identici în transplantul clinic de rinichi, în timp ce majoritatea transplanturilor de rinichi clinice sunt alogene (donatori și primitori diferiți genetic). Transplantul alogen îi obligă pe primitorii transplantului să fie supuși unor teste imunologice înainte de transplant pentru a identifica antigenele leucocitare umane (HLA; molecule care induc și reglează răspunsul imun) ale donatorului, pentru a determina compatibilitatea imunologică între donatori și primitori și pentru a evita respingerea organelor [37,38]. Studiile viitoare care utilizează STS ar trebui să ia în considerare transplantul alogen. Un alt model de limitare a transplantului de rinichi este faptul că ne-am concentrat pe donatorii vii, grefele suboptimale de la donarea după moarte cardiacă (DCD) devin din ce în ce mai frecvente ca sursă de rinichi ai donatorului în multe centre de transplant la nivel global [39]. DCD expune organele donatorului la diferite perioade de ischemie caldă în plus față de perioadele ischemice reci în timpul SCS și este asociat cu rate crescute de DGF și scăderea supraviețuirii grefei în comparație cu donatorii vii [40]. Prin urmare, studiile viitoare ar trebui să ia în considerare modelul de transplant de rinichi DCD pentru a evalua efectul STS împotriva IRI în acest model.

În concluzie, studiul nostru demonstrează că suplimentarea soluției standard de conservare cu un medicament donator H2S viabil clinic în timpul SCS prelungit al grefelor renale protejează împotriva IRI renal rece indus de transplant, îmbunătățește calitatea generală a grefei și funcția grefei și prelungește supraviețuirea primitorului transplantului. Având în vedere că riscul de DGF crește odată cu timpul ischemic prelungit la rece în transplantul clinic de rinichi, ceea ce ridică o preocupare clinică majoră, observația că STS protejează grefele renale în timpul SCS prelungit și previne DGF după transplant oferă o mare promisiune clinică care ar putea scădea sau preveni incidența DGF în transplantul clinic de rinichi în viitorul apropiat. Astfel, beneficiul viitor al adăugării STS la soluțiile de conservare poate prezenta o soluție potențială la această problemă în curs de desfășurare. În general, acest studiu se adaugă la corpul tot mai mare de literatură care susține efectele citoprotectoare ale STS și ale altor donatori H2S împotriva IRI de organ, în special îmbunătățirea rezultatelor grefei în IRI renal rece indus de transplant. Aceste strategii ar putea facilita utilizarea mai multor grefe expuse la timpi ischemici prelungi la rece, ceea ce ar putea crește numărul de organe plantabile.

Declarație de contribuție a autorului CRedit

Toți autorii au fost de acord cu trimiterea acestui manuscris. Nu există conflict de interese.

Referințe

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford și colab., Comparația mortalității la toți pacienții dializați, pacienții dializați în așteptarea transplantului și primitorii unui prim transplant cadaveric, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725–1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll, și colab., Revizuirea sistematică: transplantul renal în comparație cu dializa în rezultatele clinice relevante, Am. J. Transpl. 11 (10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte, et al., Cost-eficacitatea transplantului de rinichi de la DCD în Italia, Transplant. Proc. 46 (10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, Ischemia- reperfusion injury, Eur. J. Trauma Emerg. Surg. 33 (6) (2007) 600–612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Conservarea organelor: concepte actuale și strategii noi pentru următorul deceniu, Transfus. Med. Nama. 38 (2) (2011) 125–142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Ischemia rece și supraviețuirea pe termen lung redusă a alogrefelor renale cadaverice, Kidney Int. 65 (2) (2004) 713–718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo, et al., Major effects of delayed greft function and cold ischemia time on renal allogref survival, Nephrol. Apelează. Transplant. 21 (6) (2006) 1689–1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold, Impact of cold ischemia time on greft survival among ECD transplant recipients: a paired kidney analysis, Am. J. Transplant. 11 (12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, Factorii de risc ale destinatarilor asociați cu funcția grefa întârziată: o analiză a rinichilor perechi, Transplantation 91 (6) (2011) 666–671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr´ebern-Launay, et al., Fiecare oră suplimentară de timp de ischemie rece crește semnificativ riscul de eșec al grefei și mortalitate în urma transplantului renal, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343–349.

[11] A. Kezic, I. Spasojevic, V. Lezaic, M. Bajcetic, Mitochondria-targeted antioxidants: future perspectives in kidney ischemia-reperfusion injury, Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Stresul oxidativ cauzat de supraîncărcarea mitocondrială cu calciu, Ann. NY Acad. Sci. 1201 (2010) 183–188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, Rolul mitocondriilor în leziunea de ischemie/reperfuzie, Transplantation 73 (4) (2002) 493–499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Emerging role of gasotransmitters in renal transplantation, Am. J. Transplant. 13 (12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, Hidrogen sulfurat și semnalizare celulară: jucător de echipă sau arbitru? Fiziol vegetal. Biochim. 78 (2014) 37–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, The vasorelaxant effect of H(2)S as a new endogenous gazeous K(ATP) channel opener, EMBO J. 20 (21) (2001) 6008–6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter, et al., Tratamentul cu hidrogen sulfurat atenuează leziunea ischemiei-reperfuziei alogrefei renale în timpul depozitării la rece și îmbunătățește funcția renală de transplant precoce și supraviețuirea după transplantul renal alogen, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806–1815.

[18] I. Lobb, A. Mok, Z. Lan, W. Liu, B. Garcia, A. Sener, Hidrogenul sulfurat suplimentar protejează funcția renală de transplant și prelungește supraviețuirea primitorului după leziuni prelungite de ischemie-reperfuzie la rece prin atenuarea apoptozei grefei renale și inflamație, BJU Int. 110 (11 Pt C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian, et al., Hidrogenul sulfurat protejează grefele renale împotriva leziunilor prelungite de ischemie-reperfuzie la rece prin acțiuni mitocondriale specifice, Am. J. Transplant. 17 (2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, Tiosulfat de sodiu pentru otrăvirea acută cu cianură: un studiu într-un model de șobolan, Ann. Farmacă. pr. 63 (2) (2005) 154–161. [21] N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri, et al., Tiosulfatul de sodiu protejează de insuficiența renală în urma chimioterapiei intraperitoneale hipertermice (HIPEC) cu Cisplatin, Int. J. Hyperth. 37 (1) (2020) 897–902.