Perspective structurale și funcționale asupra polimorfismului fibrilelor sinucleinei Partea 1

Abstract:

Acumularea anormală de -sinucleină agregată (-Syn) este observată într-o varietate de boli neurodegenerative, inclusiv boala Parkinson (PD), atrofia sistemelor multiple (MSA), demența cu corp Lewy (DLB), demența din boala Parkinson (PDD) și chiar subseturi. a bolii Alzheimer (AD) care prezintă o patologie asemănătoare corpului Lewy.

Sinucleina este o proteină foarte importantă care joacă un rol vital în creierul uman. Cercetările au arătat o relație strânsă între sinucleină și memorie.

Sinucleina, ca proteină endoscheletică citoplasmatică neuronală, se găsește în principal în neuronii din măduva spinării și creier. Are funcții structurale și biologice importante și poate menține și îmbunătăți conexiunile sinaptice. Aportul senzorial poate induce sinteza sinucleinei în neuroni, sporind astfel plasticitatea conexiunilor sinaptice și promovând procesele de învățare și memorie.

Cercetări recente sugerează că inhibarea nivelurilor de sinucleină poate avea consecințe asupra formării și păstrării memoriei. Nivelurile scăzute de sinucleină sunt asociate cu declinul memoriei și pot duce la apariția unor boli neurodegenerative, cum ar fi boala Alzheimer.

Prin urmare, putem concluziona că sinucleina joacă un rol vital în creierul uman și că există o relație strânsă între acesta și învățare și memorie. Ar trebui să acordăm atenție promovării sintezei sinucleinei în creierul nostru pentru a ne păstra și a îmbunătăți memoria. Se poate observa că trebuie să îmbunătățim memoria, iar Cistanche deserticola poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece Cistanche deserticola este un material medicinal tradițional chinezesc care are multe efecte unice, dintre care unul este îmbunătățirea memoriei. Eficacitatea Cistanche deserticola provine din numeroasele ingrediente active pe care le conține, inclusiv acid tanic, polizaharide, glicozide flavonoide etc. Aceste ingrediente pot promova sănătatea creierului într-o varietate de moduri.

Faceți clic pe cunoaște 10 moduri de a îmbunătăți memoria

Aceste sinucleinopatii prezintă diferențe în reprezentările lor clinice și patologice, care amintesc de tulburările prionice. Dovezile emergente sugerează că -Syn se auto-asamblează și se polimerizează în polimorfe conformaționale diverse in vitro și in vivo, similare cu prionii.

Acești polimorfi -Syn care decurg din aceeași proteină precursoare pot prezenta proprietăți biochimice specifice tulpinii și capacitatea de a induce fenotipuri patologice distincte la inocularea lor pe modele animale. În această revizuire, discutăm variabilitatea clinică și patologică a sinucleinopatiilor și câteva aspecte ale polimorfismului fibrilelor -Syn, inclusiv existența structurilor moleculare de înaltă rezoluție și a tulpinilor derivate din creier.

Revizuirea actuală pune în lumină progresele recente în delimitarea structurii-relația patogenă a -Syn și modul în care polimorfele moleculare -Syn diverse contribuie la eterogenitatea clinică existentă în sinucleinopatii.

Cuvinte cheie: -sinucleină; amiloid; polimorfe; sinucleinopatii.

1. Introducere

Plierea și agregarea greșită a -sinucleinei (-Syn) joacă un rol crucial în progresia bolilor neurodegenerative, cum ar fi boala Parkinson (PD), demența cu corpi Lewy (DLB), demența din boala Parkinson (PDD) și atrofia sistemului multiplu (MSA) , denumite în totalitate sinucleinopatii [1].

Ca urmare a agregării proteinelor, în creier apar modificări neuropatologice în timp, iar regiunile cerebrale afectate arată corpuri de incluziune imunopozitive Syn [2,3].

Acești corpi de incluziune sunt caracteristici definitorii ale sinucleinopatiilor și sunt denumiți corpi Lewy (LB) și neuriți Lewy (LN) în PD, DLB și PDD și incluziuni citoplasmatice gliale (GCI) în MSA [1,4].

Formarea LB s-a dovedit, de asemenea, a fi factorul principal al neurodegenerării [5]. Ea implică o interacțiune a fibrilației, interacțiuni cu componentele membranoase ale celulei și modificări posttranslaționale (PTM) [5-7].

Deși corpii de incluziune în sinucleinopatii prezintă diferențe de dimensiune, formă, structură și locații în creier [1], trăsătura comună este prezența agregatelor filamentoase ale proteinei -Syn. Aceste filamente -Syn sunt structuri de foi încrucișate foarte ordonate formate prin agregarea proteinei [8]. Numeroase studii in vitro au demonstrat că -Syn suferă o tranziție structurală de la o stare neordonată la o foaie încrucișată. fibrile bogate [9–11], care sunt similare cu -Synamyloids găsite în corpurile de incluziune din creierul pacienților bolnavi [12–16].

Cu toate acestea, agregarea lui -Syn nu este un proces de conversie cu o singură stare; în schimb, implică interconversia stărilor conformaționale multiple și formarea intermediarilor oligomerici [17].

Acești intermediari oligomerici sunt foarte eterogene, tranzitori și metastabili și se sugerează că sunt cele mai toxice specii în timpul căii de fibrilație [17]. Cu toate acestea, natura tranzitorie și foarte eterogenă a acestor specii oligomerice face dificilă explicarea relației lor structură-toxicitate [17]. ].

Dimpotrivă, fibrilele de amiloid formate ca produs final al procesului de agregare sunt implicate în principal în propagarea agregatelor asemănătoare prionilor și contribuie semnificativ la răspândirea patologiei bolii [18-23].

Cu toate acestea, au existat studii care au găsit dificilă inducerea patologiei -Syn la șoareci după administrarea intracerebrală a fibrilelor [24], probabil datorită dimensiunii și dimensiunii fibrilelor mature de lungime completă. În schimb, mai multe grupuri au sugerat că speciile non-fibrilare sau oligomerice sunt implicate în răspândirea patologiei -Syn [25-27].

Cu toate acestea, având în vedere natura toxică a oligomerilor, este dificil să se stabilească legătura dintre toxicitate și răspândirea de către oligomeri. Prin urmare, mecanismul molecular care guvernează interacțiunea dintre oligomeri și fibrile trebuie să fie bine înțeles.

În plus, natura polimorfă a fibrilelor de amiloid a adăugat o altă complexitate domeniului. Modelele structurale detaliate ale fibrilelor de amiloid și ale intermediarilor de agregare au arătat că fibrilele de amiloid prezintă polimorfism la nivel molecular, adică o singură peptidă sau proteină poate forma o serie de ansambluri fibrilare distincte, autopropagabile [28].

Descoperirile recente din studii biochimice și structurale care implică linii celulare, modele animale și extracte din creier uman au furnizat dovezi inițiale că variațiile structurale ale fibrilelor amiloide pot fi responsabile pentru variațiile observate ale bolii [29-35].

Condițiile de creștere a fibrilelor, cum ar fi compoziția tamponului, sărurile, temperatura etc., afectează profund morfologia și activitatea biologică a fibrilelor -Syn formate in vitro [29,31,33,36–38].

Acest lucru sugerează că schimbările în condițiile soluției modifică interacțiunile moleculare dintre lanțurile polipeptidice, conducând la diferite tipuri de fibrile. Polimorfismul poate fi observat și datorită diferențelor în modelul interacțiunilor inter sau intra-reziduuri, a numărului de reziduuri de aminoacizi care constituie protofilamente, a împachetării și orientării acestora [39-41].

Mai mulți alți factori sunt, de asemenea, responsabili pentru natura polimorfă a amiloizilor; Cu toate acestea, înțelegerea noastră a modului în care o anumită stare de soluție duce la formarea diferitelor structuri fibrile este limitată. Existența polimorfilor a fost legată de fenomenul de tulpină în prioni, unde diferite tulpini de proteină PrP sunt asociate cu o serie de fenotipuri clinice observate în bolile prionice. [42–44].

In vitro, tulpinile prionice se caracterizează prin diferențe de rezistență la protează, profilul de glicozilare, mobilitatea electroforetică, capacitatea de însămânțare etc. ].

Un număr tot mai mare de dovezi sugerează că -Syn prezintă, de asemenea, fenomene de tulpină asemănătoare prionilor, ceea ce explică asocierea sa cu diferite boli neurodegenerative cu fenotipuri clinice și patologice distincte [35,48–50]. Lee și colegii au arătat generarea de tulpini sintetice de -Syn capabil să înmulțească diferențial tau pentru prima dată [30].

Acest studiu a stat la baza investigațiilor ulterioare care au implicat tulpini -Syn [29,32,33,36,49,51–54]. Progresele recente în spectroscopia RMN în stare solidă (ssNMR) și microscopia crio-electronică (cryo-EM) au contribuit în continuare la înțelegerea polimorfismului la nivel molecular în fibrilele -Syn [55–59]. Aceste polimorfe de fibrilă pot fi distinse pe baza fibrilei. diametrul, prezența răsucirilor, numărul și împachetarea protofilamentelor, interacțiunile lanțului lateral, aranjamentul structurii secundare și terțiare etc. [41,57,60,61].

Structurile crio-EM ale fibrilelor de tip sălbatic (WT) -Syn și variantele sale mutaționale au oferit, de asemenea, noi perspective asupra modului în care mutanții punctiformi ai -Syn asociate bolii modifică structura fibrilei a proteinei WT, sugerând polimorfismul în cadrul mutanților. Mai mult, caracterizarea și rezolvarea structurii tulpinilor derivate de la pacient poate oferi dovada directă a existenței tulpinilor -Syn responsabile de eterogenitatea bolii în sinucleinopatii.

În general, diferite studii anterioare au sugerat că diferitele tulpini de -Syn sunt responsabile pentru variațiile clinice observate în sinucleinopatii și, posibil, explică asocierea agregatelor -Syn cu eterogenitatea bolii [32–35,52,53].

Cu toate acestea, există întrebări despre originea polimorfismului in vivo, propagarea proprietăților specifice tulpinii fibrilelor și factorii care guvernează formarea tulpinilor care necesită atenție.

Prezenta revizuire se concentrează pe natura polimorfă a lui -Syn și descrie rolul său în patogenia bolii PD și tulburările asociate. Se discută dovezile care demonstrează că -Syn se poate asambla în tulpini distincte de fibrile și ar putea fi factorii principali pentru eterogenitatea bolii în sinucleinopatii.

2. Caracteristicile clinice și patologice ale sinucleinopatiilor

Agregarea proteinei -Syn este asociată cu PD și alte tulburări neurodegenerative, denumite colectiv sinucleinopatii. Acestea includ MSA, DLB, PDD și distrofii neuroaxonale mai puțin caracterizate [4,48].

PD este cea mai frecventă dintre toate sinucleinopatiile și a fost un obiectiv principal al cercetării -Syn efectuate de-a lungul deceniilor. -Syn se pliază greșit și se acumulează sub formă de insinucleinopatii de corpi de incluziune fibrilare. Cu toate acestea, aspectul și localizarea acestor corpi de incluziune variază sinucleinopatiile indiferente [62].

De exemplu, incluziunile neuronale sunt prezente în PD, PDD și DLB, în timp ce incluziunile gliale se formează în MSA [4] și axonalsferoizii mai puțin caracterizați în distrofiile neuro-axonale [4]. Existența diverselor profiluri clinice și patologice în sinucleinopatii ridică o întrebare fundamentală cu privire la modul în care agregarea unei singure proteine ​​duce la diferite boli.

2.1. Boala Parkinson (PD)

PD este a doua cea mai răspândită și complexă tulburare neurologică după boala Alzheimer (AD) [63]. Este o tulburare neurodegenerativă prevalentă, cronică și progresivă, care afectează aproximativ 1% până la 4% din populația generală cu vârsta peste 60 și 80 de ani [64–66].

Ea implică acumularea de LB și LN eozinofile, rotunde, citoplasmatice, însoțite de degenerarea neuronilor dopaminergici în regiunea substanței negre parscompacta (SNpc) a mezencefalului [3,67].

Pierderea neuronilor dopaminergici are ca rezultat o scădere a nivelului de neurotransmițător dopamină [68], ceea ce are ca rezultat funcționarea anormală a creierului și afectarea funcționării motorii care duce la simptome de PD. Simptomele patrucardinale, cum ar fi bradikinezia, tremorul de repaus, instabilitatea posturală și rigiditatea sunt luate în considerare pentru diagnosticul clinic al PD [67].

În plus față de aceste simptome motorii, simptome non-motorii cum ar fi insomnia, constipația, disfuncția cognitivă, insuficiența autonomă și depresia sunt de asemenea observate la pacienții cu PD [67]. Mai multe studii susțin că aceste simptome nemotorii și multe probleme ale tractului gastrointestinal (GI) [69-73] la pacienți implică sistemul nervos enteric (ENS) afectat în stadiile incipiente ale PD.

Datele experimentale sugerează că -Syn pliat greșit se răspândește într-un mod asemănător prionilor de la ENS la SNC prin inervațiile nucleului motor dorsal al nervului vag (DMV) [74-76]. Cu toate acestea, factorii care fac ca -Syn să se plieze greșit și să se agreeze în ENS nu sunt pe deplin cunoscuți. Unul dintre factorii raportați este prevalența ridicată a Enterobacteriaceae în tractul GI care produc amiloizi extracelulari denumiți fibre curli [77].

Acești amiloizi curli sunt utilizați pentru atașarea gazdei, invazia țesuturilor și producerea de biofilm de către bacterii. În ciuda rolurilor funcționale ale fibrelor de curli, Escherichia coli producătoare de curli induce disfuncție gastro-intestinală și afectare motorie la șoareci care supraexprimă -Syn [78].

Subunitatea amiloidogenă a fibrilelor curli (CsgA) interacționează și accelerează agregarea -Syn, iar expresia curli este într-adevăr necesară pentru a induce deficite comportamentale asociate cu -Syn [78]. Cu toate acestea, sunt necesare cercetări suplimentare pentru a descifra rolul amiloizilor bacterieni în promovarea agregării -Syn și urmărirea originii PD de-a lungul axei intestin-creier. În ultimii câțiva ani, genetica PD a fost studiată în mod semnificativ.

Gena SNCA a fost identificată ca una dintre genele majore legate de PD sporadic și familial [63,79]. Mutațiile în parkin și LRRK2 sunt celelalte gene comune asociate cu PD moștenită recesiv și, respectiv, [63,79]. Dublarea [80] și triplicarea [81] a genei SNCA, gena care codifică -Syn, determină debutul precoce al parkinsonismului.

Odată cu multiplicarea genei SNCA [82], mutațiile cu un singur punct sunt, de asemenea, asociate cu parkinsonismul autosomal familial. Până în prezent, șapte mutații missense sunt cunoscute a fi asociate cu PD familială: A30P [83], E46K [84], H50Q [85,86], G51D [87], A53T [88], A53E [89], și A53V nou descoperit [90]. Agregarea și formarea de amiloid a acestor mutanți familiali au fost studiate pe larg in vitro [12,16,91–101].

A30P, A53E și G51D încetinesc agregarea WT -Syn, în timp ce E46K, A53T, H50Q și A53V accelerează la fel [10,91–95,99,101,102]. Cu toate acestea, rata lor de agregare in vitro nu se corelează cu debutul bolii, sugerând o interacțiune între oligomerizare și fibrilație in vivo, care dictează progresia și debutul bolii în formele familiale de PD [103].

În afară de factorii genetici, ~95% din cazurile de PD sunt sporadice [63,104] și sunt asociate cu factori de risc celulari și de mediu. Acestea includ prezența poliaminelor, chaperonilor, glicozaminoglicanilor, membranelor, ionilor metalici, expunerea la pesticide și metale grele etc. [6.105–114]. Acești factori de risc modulează în mod unic plierea greșită și agregarea -Syn asociată cu patogeneza PD [94,115].

2.2. Atrofie a sistemului multiplu (MSA)

MSA este o boală neurodegenerativă sporadică rară și se cronicizează progresiv cu o insuficiență autonomă împreună cu simptome de parkinsonism sau ataxie cerebeloasă [116,117]. Prevalența bolii este de 2,4-4,9 cazuri la 100,000 populație [117].

MSA afectează în mod egal ambele sexe, iar incidența este mai răspândită la persoanele cu vârsta peste 60 de ani [118,119]. MSA este o tulburare neurologică mai devastatoare și mai agresivă decât alte sinucleinopatii din cauza progresiei clinice mai rapide, cu o durată a bolii mult mai scurtă (6-9 ani) decât PD (~12 ani) [117,119]. Mulți pacienți diagnosticați cu PD au descoperit MSA după autopsie [120].

Acest diagnostic greșit al MSA se întâmplă din cauza suprapunerii simptomelor celor două tulburări, sugerând că prevalența MSA este mai mare decât estimarea [117]. MSA a fost descris anterior de trei sindroame clinice, degenerarea striatonigrală, atrofia olivopontocerebeloasă și sindromul Shy-Dragers, considerate anterior ca tulburări separate [121,122].

Mai târziu, s-a constatat că aceste sindroame coexistă adesea clinic și patologic și dau impresia unei boli de bază comune, care a fost denumită MSA. Din punct de vedere clinic, pacienții cu MSA prezintă numeroase combinații de simptome, cum ar fi parkinsonismul, ataxie cerebeloasă, insuficiență autonomă progresivă și semne piramidale.

Pe baza acestui fapt, ele sunt clasificate în două subtipuri clinice principale: (i) subtipul parkinsonian (MSA-P), cu parkinsonismul ca trăsătură predominantă și (ii) subtipul cerebelos (MSA-C), cu ataxia cerebeloasă ca trăsătură majoră. 123–125]. Apariția MSA-P și MSA-C variază de la 2:1 la 4:1, respectiv [126–128].

Cu toate acestea, subtipul MSA-C se găsește în principal și predomină în populația japoneză [118]. Semnul distinctiv histopatologic al MSA este prezența GCI-urilor formate în oligodendrocitele din creier, care prezintă o imunoreactivitate puternică cu -Syn [129]. Acest lucru îl face distinct patologic de alte sinucleinopatii, deoarece prezintă o acumulare anormală a proteinei -Syn în oligodendrocite, spre deosebire de PD și DLB, unde se găsesc incluziuni -Syn în neuroni [130].

Deși unii pacienți cu MSA au arătat prezența agregatelor -Syn în nucleul și citoplasma neuronilor [131], aceste incluziuni neuronale sunt mai puțin prevalente decât GCI-urile în MSA. Mai mult, mecanismul acumulării aberante a -Syn în celulele gliale este neclar, deoarece nu există o expresie minimă a oligodendrocitelor mature -Syn [132-135].

Câteva rapoarte au sugerat posibilitatea de transmitere/translocare a -Syn de la neuroni la oligodendrocite [136,137]. Cu toate acestea, acest mecanism nu este complet cunoscut, iar originea exactă a inoligodendrocitelor incluziunilor -Syn rămâne obscură.

2.3. Demență cu corpi Lewy (DLB)

DLB este a doua cea mai frecventă -sinucleinopatie după PD [138–140]. Ratele de incidență și prevalență ale DLB nu sunt precise din cauza suprapunerii simptomelor cu AD, PDD, demență vasculară și alte sinucleinopatii.

Se estimează că prevalența sa este de aproximativ 0,4%, adică 400 de persoane la 100,000 populație la vârstnici [141], reprezentând 5% din toate cazurile de demență și între 1-4 persoane per 1000 de locuitori [142]. Inițial, DLB a fost identificat ca sindrom de demență [143]. Mai târziu, corpurile de incluziune de la pacienții DLB s-au dovedit a fi foarte imunoreactive la -Syn [3]. După aceea, a fost clasificat drept unul dintre principalele tipuri de sinucleinopatii.

În timp ce PD se caracterizează printr-o scădere a abilităților motorii, DLB se caracterizează în principal prin demență. În schimb, un pacient DLB poate suferi sau nu de parkinsonism [144]. Spre deosebire de PD, LB-urile la pacienții cu DLB sunt în principal localizate și distribuite în citoplasma neuronilor corticali ai creierului bolnav [145]. LB-urile corticale sunt eozinofile, rotunjite și, în general, nu au structura halo observată la LB-urile clasice.

Clinic, se caracterizează prin demență, tulburări de memorie, parkinsonism și modificări ale comportamentului, somnului și funcțiilor autonome ale corpului și cognitive [143]. Mulți pacienți cu DLB prezintă, de asemenea, depunere semnificativă de A în zona corticală, împreună cu formarea de LB [146,147] . Mai multe dovezi convingătoare susțin relația sinergică dintre A și -Syn [148–154].

Studiile in vitro au demonstrat că -Syn și A se pot încrucișa, forma hetero-oligomeri și promovează agregarea reciprocă [148,151,152,154]. În consecință, durata mai scurtă a bolii și declinul mai rapid au fost observate la pacienții cu patologie AD și demență [155,156].

Un studiu recent a furnizat dovezi experimentale directe ale efectului co-patologiei în care plăcile A au promovat însămânțarea și răspândirea -Syn la șoarecii cu patologie A abundentă [157]. Totuși, studiile clinice și patologice sugerează că DLB se suprapune mai mult cu PDD decât cu AD [158]. În general, sinucleinopatiile sunt asociate cu depunerea anormală de -Syn, dar variază în continuare în ceea ce privește fenotipurile clinice și patologice.

În ciuda mai multor studii, motivul acestei divergențe clinicopatologice rămâne un puzzle.3. Plierea și agregarea greșită a -SynMonomeric -Syn este o proteină intrinsec dezordonată și tinde să adopte stări conformaționale multiple afectate de condițiile soluției precum pH, temperatură, tărie ionică, vâscozitate etc. [9].

De exemplu, prezența alcoolilor (etanol) sau fluoroalcoolilor (TFE sau HFiP) induce formarea de structuri -foaie sau -helicoidale parțial pliate de -Syn, în funcție de concentrația și tipul de alcool utilizat [9]. -Syn a fost mai întâi izolat din antiserurile ridicate împotriva veziculei colinergice de la Torpedo californica, o rază electrică [159].

Datorită locației sale la învelișul nuclear și terminalul presinaptic, a fost numit sinucleină [159,160]. -Proteina Syn este codificată de gena SNCA mapată la cromozomul uman 4q21.3-q22 [160]. -Syn a fost descoperit și de Ueda și colab. [161] în timpul studiului plăcilor de amiloid din creierul pacienților cu Alzheimer, în care au identificat o componentă non-amiloid (NAC) în plăci, care a fost derivată dintr-o proteină precursoare, NACP [161]. A fost detectat în toate țesuturile, cu excepția ficatului, iar cea mai mare concentrație a fost găsită în creier [161].

Mai târziu, s-a descoperit că NACP este un omolog nativ nestructurat și uman al -Syn [162–164]. Caracterizarea biofizică și structurală extinsă a arătat că -Syn este o proteină de 140 de aminoacizi cu o greutate moleculară de ~14,4 kDa și pKa de 4,7 [165].

Se știe că este implicat în eliberarea de neurotransmițători, traficul de vezicule și asamblarea complexului SNARE în creier, deși rolul său fiziologic exact este încă obscur [160,165]. -Syn constă din trei domenii, domenii N-terminal, NAC și C-terminal (Figura 1A).

N-terminalul lui -Syn (reziduuri 1–60) este un domeniu amfipatic, bogat în lizină și care leagă lipide, care interacționează cu membranele [109]. Conține 11 repetări aa, inclusiv motivele hexamerice KTKEGV conservate [109]. Aceste repetări sunt conservate între specii, precum și între trei membri sinucleici. Deși -Syn rămâne neordonat într-o soluție apoasă, adoptă o structură elicoidală care implică N-terminal la asocierea cu mici unilamelarvezicule încărcate negativ sau micele de detergent [109,166,167].

Interesant este că toate mutațiile familiale ale Syn apar și în regiunea N-terminală [83–90] (Figura 1B). Domeniul NAC al -Syn (residuurile 61-95) formează miezul hidrofob al proteinei și este predispus la agregare. Acest domeniu este responsabil pentru conversia -Syn dintr-o stare neordonată la -fibrile bogate în foi [168,169]. NAC este, de asemenea, parte a domeniului de legare la membrană al proteinei [167].

Ansamblul conformațional al monomerului -Syn constă într-adevăr din structuri care sunt similare cu starea legată de membrană a lui -Syn [170]. Acestea conțin elice parțial pliate care implică N-terminale și domenii NAC similare cu modelul 1XQ8 [170], sugerând că un astfel de tip de pliere ar putea fi prezent și în stadiile incipiente ale agregării.

Domeniul C-terminal (reziduurile 95-140) este flexibil și constă predominant din aminoacizi încărcați negativ [165]. Partea carboxi-terminală dezordonată este, de asemenea, implicată în localizarea nucleară a proteinei -Syn și interacțiunea acesteia cu metalul, moleculele mici și proteinele [171-175].

For more information:1950477648nn@gmail.com