Caracterizarea structurală a polizaharidei Cistanche Deserticola și a efectului său protector asupra HK cu celule HK induse de glucoză -2

1.2.5.8 Detectarea potențialului membranei mitocondriale

Celulele hk -2 au fost inoculate în plăci de puț 6- și cultivate. După stimularea corespunzătoare, mediul de cultură din plăcile de puț 6- a fost aspirat și a fost adăugat un grup de control pozitiv puternic (POS) la grup sub „1.2.5.6”. Clătiți o dată cu PBS, adăugați 1 ml de mediu de cultură celulară și 1 ml JC -1 Soluția de lucru de colorare a fost amestecată bine și plasată într -un incubator de cultură celulară în întuneric timp de 20 min. Celulele au fost spălate de două ori cu tampon de colorare JC -1 (1 ×) și imaginile au fost colectate folosind un microscop fluorescent.

 

 

 

 

Beneficiile Cistanche

 

1.2.5.9 Metoda Hoechst33258 pentru detectarea apoptozei celulare

Diapozitivele de celule au fost plasate în plăci de puț 6-, iar celulele HK -2 în faza de creștere logaritmică au fost însămânțate în plăcile de puț 6- la o densitate a celulelor de 1 × 105 celule/bine. După intervenția medicamentelor corespunzătoare, kitul de colorare Hoechst33258 a fost utilizat pentru colorare. Apoptoza celulară a fost detectată și imaginile au fost colectate folosind un microscop de fluorescență.

 

1.2.5.10 Western blotting pentru a detecta

Expresia proteinelor legate de calea de semnalizare TLR4/NF-κB a fost analizată prin gruparea și tratarea celulelor conform metodei sub „1.2.5.6”. După aceea, proteina totală din celule a fost extrasă conform instrucțiunilor kitului de extracție a proteinelor. Cuantificarea proteinelor a fost efectuată folosind metoda de cuantificare a proteinei acidului bicinchoninic (BCA), iar proteina a fost denaturată și păstrată într -un frigider de grad -20.
10% sodiu dodecil sulfat de poliacrilamidă Gel Electroforeză (SDS-PAGE), transfer de membrană poliviniliden (PVDF), introduceți membrana în tampon care conține TRIS {-20 tampon
Celulele au fost incubate într -o cameră salină tamponată cu Tris cu camera Tween -20 (TBST) și blocate la temperatura camerei. Anticorpii primari la TLR4, NF-κB p65, P-NF-κB p65 și -ctin au fost folosițiDetectați țesutul renal(Anticorpii au fost diluați la soluția TBST la un raport de volum de 1: 2000) la 4 grade peste noapte. Tbst
Membrana a fost diluată cu anticorp secundar (anticorp și soluție TBST au fost diluate la un raport de volum de 1: 2000) și incubate la temperatura camerei timp de 1 oră. După spălarea membranei de 3 ori cu TBST, a fost adăugat reactiv luminescent ECL pentru detectare, iar expresia proteinei a fost detectată prin imagistica cu gel. Software -ul Image J a fost utilizat pentru a analiza valoarea proteinei de gri, cu -actin ca referință internă.

1.3 Prelucrarea datelor

SPSS 23. 0 și software -ul GraphPad Prism 6.01 au fost utilizate pentru analiza datelor. Testul Shapiro-Wilk a fost utilizat pentru a testa normalitatea datelor eșantionului, iar testul maro-Forsythe sau Bartlett a fost utilizat pentru a testa omogenitatea variației datelor eșantionului. Datele de măsurare cu distribuția normală și omogenitatea variației au fost exprimate ca medie ± abatere standard. (x ± s) indică descrierea, a fost utilizată ANOVA unidirecțional pentru testare, iar metoda lui Dunnett a fost utilizată pentru comparație în perechi, dacă este semnificativă statistic.
Pentru comparațiile post -hoc în pereche de variații inegale, a fost utilizată metoda T3 a lui Dunnett, cu p <0. 0 5 indicând o diferență semnificativă statistic și p <0.01 care indică o diferență semnificativă între cele două grupuri.

2 Rezultate și analiză

2.1 Determinarea zahărului total, acidului uronic și a conținutului de proteine ​​din CDP

Ecuația de regresie liniară a conținutului polizaharide a fost: y=5. 7628x - 0. 0004, r=0. 999. Experimentul a arătat că între 7 și 70 pg/ml, a existat o relație liniară bună între concentrația standard de glucoză (X) și valoarea de absorbție (Y). Procentul calculat de conținut de polizaharide în eșantion este: 81,02%.
Ecuația de regresie liniară a acidului uronic standard este: y=1. 1571x + 0. 0015, r=0. 9968. Experimentul a arătat că între 20 și 100 pg/ml, a existat o relație liniară bună între concentrația standard de acid uronic (X) și valoarea de absorbție (Y). Conținutul de acid uronic din eșantion este: 4,43%.
Ecuația standard de regresie liniară proteică este: y=1. 2671x + 0. 2145, r=0. 9969. Experimentul a arătat că între 20 și 1 00 µg/ml, a existat o relație liniară bună între concentrația de proteine ​​standard (x) și valoarea de absorbție (Y). Conținutul de proteine ​​din eșantion este: 4,00%.

 

2.2 Distribuția în greutate moleculară a CDP -urilor

Greutatea moleculară a CDP -urilor a fost determinată prin detectarea coloanei în tandem a cromatografiei cu permeabilitate a gelului de înaltă performanță. Cu rt as (x) și lgmp ca (y), ecuația curbei de calibrare LGMP-RT a fost calculată ca: y=-0. 1951x + 11. 661, r²=0. 9956; Rt este (x), lgmw este (y), ecuația curbei de calibrare LGMW-RT este: y=-0. 1973x + 11. 738, r²=0. 9956; Rt este (x), lgmn este (y), curba de calibrare LGMN-RT Ecuația este: y=-0. 1964x + 11. 7, r²=0. 9955; Pe baza curbei standard, formula de calcul este obținută pentru a calcula greutatea moleculară a fiecărui eșantion. Spectrul de greutate moleculară al eșantionului este următorul, iar rezultatele calculului sunt prezentate în tabelul 2. Rezultatele au arătat că CDP -urile au avut mai multe vârfuri de eluție, iar greutatea moleculară a polizaharidelor a fost distribuită în principal între 3 și 8 kDa, care a fost o heteropolisataacharidă moleculară mică heterogenă. Așa cum se arată în figura 1.

 

 

2,3 compoziție monosacharide CDPS

CDP -urile au fost analizate prin cromatografie ionică, iar cromatograma este prezentată în figura 2. Rezultatele au arătat că în comparație cu timpul de retenție a 16 standarde monozaharide, au fost detectate 5 monozharide în CDPS. Prin compararea spectrelor cu cele ale standardelor monosacharide, CDP -urile au fost compuse în principal din glucoză, galactoză, rhamnoză, manoză și zaharoză. , arabinoză. Raportul molar este 0. 734 0 5: 0. 0 5381: 0. 0502: 0.0255: 0.0178. Din raportul molar, se poate observa că CDP -urile sunt compuse în principal din glucoză, galactoză și rhamnoză. Printre aceștia, glucoza reprezintă 73,405%, galactoza reprezintă 5,381%, iar rhamnoza reprezintă 5,02%.

 

Notă: Man.Mannose, GLC N.glucosamină clorhidrat, RHA.RHAMNOSE, GLC-UA.Glucuronic Acid, Gal-UA.Galacturonic, Gal N.galactosamină clorhidrat, ARA GLC.glucoză, gal.galactoză, Xyl.xiloză, ARA. Arabinoză, fuc.fucoză.

2,4 CDPS ANALIZĂ infraroșu Fourier

The peak near 3246 cm-1 is caused by the OH stretching vibration of the hydroxyl group, the absorption peak near 2900 cm-1 is the CH stretching vibration peak of -CH3, and the absorption peak at 1594 cm-1 is the C=O stretching vibration peak, indicând faptul că prezența CDP de acid uronic, 1374.31 cm -1: Acest vârf de absorbție poate fi legat de vibrația de deformare a legăturilor CH, în special în grupele de metil (-ch3) sau metilen (-H 2-) grupuri de polizatacaride. Vârful de absorbție la 1018.38 cm -1 poate fi legat de vibrația de întindere a legăturii CO, care se găsește în mod obișnuit în legăturile eterului sau în legăturile esterului polizaharidelor. Trei vârfuri slabe de absorbție în intervalul 1200-1000 cm -1 indică prezența piranozei în CDPS. Vârfurile de absorbție la 870 și 930 cm -1 indică faptul că legăturile glicozidice de tip pot exista în CDPS. Vezi Figura 3.

 

2.5 Efecte toxice ale CDP -urilor asupra celulelor normale HK -2

Comparativ cu Con, la 24 de ore după administrare, viabilitatea celulară a început să scadă semnificativ după ce concentrația CDPS a atins 1000 UG/ml (P<0.05); at 48 h after administration, the cell viability decreased when the CDPs concentration reached 800 μg/mL and did not exceed 80 %; after 1000 µg/mL, the cell viability began to decline significantly (P<0.05); this may be related to the imbalance of cell osmotic pressure and cell membrane damage caused by the high concentration of polysaccharides. There was no significant difference in cell viability when compared with the concentrations of 25, 50, 100, 200, and 400 µg/mL, so the concentrations of CDPs of 100, 200, and 400 µg/mL when cell viability did not decrease significantly were selected as the drug intervention concentrations. See Table 3.

 

3 Discuții și concluzii

Polizaharidesunt polimeri cu greutate moleculară mare compuse din mai mult de 10 monosacharide. S -a raportat că polizaharidele auefecte imunomodulatoare, antioxidante, antiinflamatorii și hipoglicemice[15]. Ca una dintre principalele substanțe active farmacologic din Cistanche Deserticola, CDP -urile au o valoare medicinală semnificativă. Acest studiu a caracterizat preliminar structura CDP -urilor și a constatat că pot îmbunătăți deteriorarea celulelor HK -2 induse de un mediu ridicat de zahăr.

 

Structura complexă a polizaharidelor este strâns legată de activitatea lor biologică, printre care tipul și proporția monozaharidelor, masa moleculară relativă a polizaharidelor și tipul de legături glicozidice sunt factori de influență cheie [16]. Masa moleculară relativă moderată oferă polizaharide mai multe situri active și poate prezenta o activitate biologică mai puternică.
Cu toate acestea, greutatea moleculară mare va crește rezistența transmembraniană, va împiedica absorbția polizaharidelor și va afecta activitatea. În schimb, este posibil ca polizaharidele cu greutate moleculară mică să nu poată forma structuri active eficiente, ceea ce duce la o activitate redusă [17]. Atunci când explorați activitatea biologică a polizaharidelor, este necesar să luăm în considerare în mod cuprinzător compoziția monosacharidelor, masa moleculară relativă și tipul de legătură glicozidică [18]. În acest studiu, cromatografia ionică a stabilit că CDP -urile au fost compuse în principal din glucoză, galactoză și rhamnoză, ceea ce este în concordanță cu raportul lui Xu și colab. [19]. Greutatea moleculară medie în greutate ale CDP-urilor măsurate prin cromatografie cu gel lichid de înaltă performanță au fost 3444, 4198 și, respectiv, 8031 ​​kDa. Greutățile moleculare a trei polizaharide Cistanche din patru materiale medicinale de tip Cistanche măsurate de Yang și colab. [20] au fost similare. CDP -urile pot conține legături glicozidice de tip și pot conține -glucoză sau -mannoză. Polizaharidele compuse din -glucoză sau -mannoză sunt mai ușor recunoscute de receptorul 4 (TLR4) sau TLR2 [21].
DN este una dintre cele mai grave complicații microvasculare ale diabetului, iar patogeneza sa este strâns legată de stresul oxidativ, disfuncția mitocondrială și apoptoza celulară [22]. Acest studiu a investigat efectul protector al CDP-urilor asupra celulelor HK -2 induse de glucoză prin reglarea căii de semnalizare TLR4/NF-κB și mecanismul molecular al acesteia.

În condiții ridicate de glucoză, celulele HK -2 prezintă un stres oxidativ semnificativ [23]. Studiile au descoperit că nivelul ridicat de zahăr crește semnificativ producția de ROS intracelular. Această cantitate excesivă de ROS poate deteriora direct lipidele membranei celulare, ceea ce duce la o creștere a conținutului produsului de peroxidare lipidică MDA [24]. În același timp, activitățile SOD și GSH-PX, sisteme importante de apărare antioxidante, au fost reduse semnificativ, ceea ce indică faptul că capacitatea antioxidantă a celulelor a fost grav deteriorată [25]. Acest dezechilibru în sistemul de oxidare-antioxidare promovează în continuare expresia și activarea TLR4 [26]. Studiile anterioare au arătat că ROS-ul excesiv poate fi recunoscut de TLR4 ca modele moleculare asociate cu pericolul (DAMP), formând o buclă de feedback pozitiv [27]. În acest studiu, pretratarea CDPs a redus semnificativ nivelul de ROS, a crescut activitățile SOD și GSH-PX și a scăzut conținutul de MDA. Acest efect antioxidant cuprinzător sugerează că CDP -urile pot regla răspunsurile la stres oxidativ prin mai multe ținte.
În calea de semnalizare TLR4/NF-κB, TLR4 activat promovează activarea complexului IKK prin recrutarea proteinelor adaptorului din aval, care la rândul lor duce la fosforilarea și degradarea IκB [28]. Studiul de față a observat că glucoza ridicată a crescut semnificativ nivelul de fosforilare a IκB, ceea ce a dus la translocarea NF-κB p65 de la citoplasmă în nucleu. Studiile au arătat că translocarea nucleară a p65 nu numai agravează stresul oxidativ, dar afectează și funcția mitocondrială [29].
S -a observat prin colorarea JC -1 că tratamentul ridicat de glucoză a provocat o scădere semnificativă a potențialului membranei mitocondriale, arătând o trecere de la fluorescența roșie la fluorescența verde, ceea ce indică faptul că gradientul de protoni dintre membranele interioare și exterioare ale mitocondriei a fost perturbat. Disfuncția mitocondrială agravează în continuare producția de ROS, formând un ciclu vicios [30]. Pretratarea CDPS poate menține stabilitatea potențialului membranei mitocondriale, iar acest efect protector poate fi obținut prin inhibarea expresiei TLR4 și activarea NF-κB.
Disfuncția mitocondrială și stresul oxidativ persistent duc în cele din urmă la apoptoza celulară [31]. Colorarea Hoechst a relevat faptul că nucleele celulare din grupul ridicat de tratament cu glucoză au arătat modificări morfologice apoptotice tipice evidente, cum ar fi condensarea, condensarea și fragmentarea [32]. Aceste modificări sunt strâns legate de calea apoptozei intrinseci mediate de mitocondrial: pierderea potențialului membranei mitocondriale duce la eliberarea citocromului C, activarea cascadei caspazei și, în final, apoptoza celulară [33]. Morfologia nucleară a celulelor din grupul de pretratare CDPS a fost practic normală, iar colorarea a fost uniformă, ceea ce sugerează că CDP -urile au prevenit apoptoza celulară prin menținerea funcției mitocondriale și inhibarea stresului oxidativ.
În rezumat, acest studiu a detectat sistematic indicatorii de stres oxidativ (ROS, MDA, SOD, GSH-PX), funcția mitocondrială (jc -1) și apoptoza celulară (HOECHST), combinate cu moleculele cheie ale căii de semnalizare TLR4/NF-κB care elucidează mecanismul acțiunii CDPS: CDPS
În primul rând, prin îmbunătățirea capacității antioxidante a celulelor, reducerea nivelului de ROS și reducerea activării TLR4; în al doilea rând, prin inhibarea expresiei TLR4 și fosforilarea IκB, blocând translocarea nucleară a NF-κB; În cele din urmă, prin îmbunătățirea funcției mitocondriale, inhibarea apoptozei celulare. Moartea, jucând astfel un rol protector împotriva DN. Acest efect sinergic multi-țintă face ca CDP-urile să arate perspective bune de aplicare în tratamentul DN. În studiile ulterioare, structura polizaharidelor va fi determinată în continuare prin difracția cu raze X, spectroscopie de rezonanță magnetică nucleară și spectrometrie de cromatografie de gaz. În plus, rezultatele medii în greutate moleculară arată că CDP -urile sunt polizaharide heterogene. În continuare, vom separa și purifica polizaharidele omogene, vom detecta structura polizaharidelor și activitatea biologică și va clarifica relația structură-activitate.