Wen-Lan Li, Jing-Xin Ding, Jing Bai, Yang Hu, Hui Song, Xiang-Ming Sun, Yu-Bin Ji

Pentru mai multe informații, vă rugăm contactați:Joanna.jia@wecistanche.com

Abstract

Tehnologia LC este o metodă recunoscută folosită la nivel mondial pentru a evalua calitatea medicamentelor tradiționale chinezești (TCM). Calitatea MTC are un impact direct asupra eficacității sale. Prin urmare, pentru a dezvălui în detaliu modul în care TCM își exercită eficacitatea, în primul rând, este necesar să se înțeleagă baza materială pentru eficacitatea sa și apoi să se controleze calitatea compușilor activi. Aplicarea metodei relației spectru-efect este crucială pentru determinarea bazei materialului farmacologic. Scopul acestei lucrări a fost de a investiga corelațiile care stau la baza dintre profilurile chimice și activitatea estrogenică aCistanche, pentru a dezvălui compușii activi. Profilele chimice aleCistancheau fost înregistrate utilizând HPLC/Q-TOF-MS/MS, iar activitatea estrogenică a fost determinată prin testul de creștere a uterului și testul MTT. Apoi, combinând rezultatele analizei bivariate, ale analizei componentelor principale și ale metodei de analiză a corelației gri, au fost identificați cincisprezece compuși activi. Sunt 8-acidul epiloganic, salidrozida, siringalida A 3'{- -l-ramnopiranozida, cistanozida A, echinacozida, cistanozida F, cistanozida B, cistanozida C, osmantuzida B, acteozida, izoacteozida, tubulozida B, 2 '-acetillacteozidă și doi compuși necunoscuți. Acest studiu pune bazele studiilor in vivo aleCistanche, și pentru dezvoltarea aplicației sale clinice.

Cistanchetubulosa

Cuvinte cheie:Cistanchedeserticola; LC/Q-TOF-MS; activitate estrogenică; analiza componentelor principale (PCA); Testul de creștere a uterului.

Abrevieri

MTC: Medicina Traditionala Chineza

HPLC/Q-TOF-MS: cromatografie lichidă de înaltă performanță/spectrometrie de masă cu timp de zbor cvadrupol

BA: analiză bivariată

PCA: analiza componentelor principale

GCAM: metoda de analiză a corelației gri

MTT :Tripsină, 3-(4, 5-Dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazoliumbromură

DMSO: dimetil sulfoxid

RPMI1640 Roswell Park Memorial Institute 1640

1. Introducere

Recent, TCM a devenit din ce în ce mai popular în țările asiatice și occidentale datorită efectelor sale terapeutice stabile și toxicității scăzute în clinică. Ca rezultat, este necesar să se dezvolte noi tipuri de MTC și să se înțeleagă compozițiile eficiente utilizate în timpul aplicării lor clinice [1-6].

În primul rând, relația spectru-efect este studiată pentru a discerne corelația dintre amprenta cromatografică și eficacitatea farmacodinamică. Apoi, folosind relația pentru a căuta componente eficiente în TCM și pentru a formula standarde de control care să reflecte calitatea lor internă. Relația spectru-efect a fost aplicată în multe domenii ale cercetării TCM, cum ar fi baza materială a TCM unic și compus, compatibilitatea componentelor, mecanismul de procesare, prognoza efectului farmacologic și optimizarea tehnologiei [7-12]. Relația spectru-efect este folosită pentru a prezenta noi idei și metode pentru explorarea substanțelor active, optimizarea formulelor, îmbunătățirea proceselor de preparare, urmărirea și separarea ingredientelor țintă și pentru dezvoltarea de noi medicamente TCM [13-17].

Cistanchea fost utilizat pe scară largă pentru tratamentul disfuncției sexuale, constipației, prostatitei și deficienței renale. Are un spectru larg de bioactivități, inclusiv efect estrogenic, anti-îmbătrânire, antioxidare și acțiune imunitară [18-19]. În general, glicozidele feniletanoide (cum ar fi cistanozida A, tubulozida A), lignanii și glicozidele iridoide au fost considerate constituenți farmacologici și markeri chimici pentru controlul calității Cistanche și a produselor sale [20-21]. Spectrele chimice ale lui Cistanche din diferite zone au fost înregistrate utilizând cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) [22-23]. În acest studiu, selectăm testul de creștere a uterului și testul de proliferare a celulelor MCF7 pentru a evalua activitățile lor estrogenice. Analiza componentelor principale, analiza bivariată și metodele de analiză a corelației gri au fost utilizate pentru a corela activitatea estrogenică cu componentele individuale. Acest studiu a avut ca scop identificarea compușilor bioactivi ai Cistanche responsabili de efectele estrogenice in vivo. Studiul pune bazele unor studii aprofundate despre Cistanche.

Toate procedurile experimentale au fost revizuite și aprobate de Comitetul de etică a animalelor al Universității de Comerț din Harbin.

Cistanchedeserticola (cd-20120227-005) a fost achiziționat de pe piața de medicamente și identificat de prof. Zhang Delian (Harbin University of Commerce). Dietilstilbestrol a fost achiziționat de la HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD. RPMI1640 și RPMI1640 fără roșu de fenol au fost achiziționate de la HyClone Company (SUA). MTT și DMSO au fost toate achiziționate de la Sigma-Aldrich Co. LLC (St Louis, SUA). Linia celulară MCF7 a cancerului de sân uman a fost furnizată de Centrul de Cercetare al Științelor Vieții și Științelor Mediului (Harbin University of Commerce). Standardele utilizate au fost următoarele: acteozide (111530- 200505), echinacozide (111670-200503) și salidrozide (110736-200628) au fost obținute de la Institutul Național pentru Controlul Produselor Farmaceutice și Biologice (Beijing). , China). Acetonitrilul, metanolul și acidul formic erau de calitate MS, în timp ce apa era ultrapură. Alți reactivi erau de calitate analitică și erau disponibili comercial.

2 Procedura experimentală

2.1 Materiale

Sistemul HPLC Agilent 1290, sistemul LC/MS (Q-TOF) cu timp de zbor cu patru poli Agilent 6530 și stațiile de lucru HPLC-3D chimice au fost utilizate pentru experimente de chimie analitică și procesarea datelor. Apa ultrapură Milli-Q a fost folosită pentru prepararea probelor și a standardelor. Instrumentele suplimentare au inclus balanța analitică electronică AR1140 (Ohaus International Ltd), cititorul de microplăci 680 (Bio-Rad Corporation) și centrifuga de mare viteză 64R (Beckman Coulter Allegra).

Șoarecii Kunming femele imaturi (aproximativ 21 zile de naștere, înțărcați) cântărind (12 ± 2) g, au fost achiziționați de la Centrul pentru animale de laborator al bazei industriei biologice din Changchun (Changchun, China). Șoarecii au fost găzduiți într-o cameră cu temperatură reglată (22 ± 2 grade) cu acces nerestricționat la hrană și apă. Experimentarea pe animale a fost inițiată după cinci zile de aclimatizare. Șoarecii au fost ținuți peste noapte cu acces liber la apă înainte de a administra soluțiile de testare. Acest studiu a fost realizat în strictă conformitate cu recomandările din Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator al National Institutes of Health.

2.2 Prepararea soluției de probă

CistancheAu fost colectate mostre din zece habitate diverse, și anume Neimeng, Xinjiang, Ningxia, Guizhou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan și provincia Hubei.

Soluția (1,0 g/mL) aCistancheproba a fost preparată în apă distilată pentru administrare orală. Concentrația de dietilstilboestrol a fost de 20ug/mL și a fost utilizată ca soluție de control pozitiv. Soluția (1,0 g/mL) a probei de Cistanche a fost preparată în 50 procente de acetonitril. Acteozidă, echinacozidă și salidrozidă (2,0 mg fiecare) au fost dizolvate în 10 ml de soluție de acetonitril 50%. Atât proba, cât și soluțiile standard au fost filtrate folosind un filtru de 0,45-μm înainte de analiză.

2.3 Condiții LC-MS

Un scut de simetrie Waters RP18 (3,9 mm×150 mm, 5μm; Waters Corporation, Milford, MA, SUA) a fost folosit pentru a analiza probele. Faza mobilă a constat din acetonitril (A) și soluție apoasă de acid formic 0,2 procente (v/v) (B) și a fost pompată la un debit de 0,5 ml/min. Volumul de injectare al fiecărei probe a fost de 10 μL. Programul de eluare cu gradient a fost după cum urmează: Faza mobilă A a fost inițiată la 5% și a crescut liniar la 23% la 35 de minute. Soluția A a fost ulterior crescută la 25 la sută (35 până la 65 min). Faza mobilă A a fost apoi scăzută la 5 procente în ultimele 5 minute ale cursei (65 până la 70 de minute). Temperatura coloanei a fost menţinută la 30 de grade. Cromatogramele au fost monitorizate la 254 nm. Presiunea gazului de atomizare a fost de 30 psi, iar tensiunea capilară a fost de 3,5 kV. Debitul gazului uscat a fost setat la 8 l/min cu o temperatură de 30 de grade. Spectrele de masă au fost înregistrate în intervalul de scanare de 100- 3,000 Da și au fost în modul de scanare cu ioni negativi.

2.4 Evaluarea amprentei

Amprentele digitale LC ale probelor colectate din 10 loturi diferite au fost stabilite și corelate automat utilizând Sistemul de evaluare a similarității pentru amprenta cromatografică a TCM (versiunea 2012; Comitetul pentru Farmacopeea Chinei, Beijing, China). În plus, harta cromatogramei de referință a fost generată folosind metoda mediei. În plus, analiza cluster a fost aplicată pentru a evalua calitatea eșantioanelor din zece habitate diverse.

2.5 Analiza componentelor principale (PCA)

PCA este o metodă statistică multivariată. Poate reține suficiente informații din achiziția datelor. În studiul de față, vârfurile caracteristice din cromatogramele LC au fost analizate în continuare de către PCA și au avut ca scop identificarea compușilor activi pe baza relației spectru-efect.

2.6 Testul de creștere a uterului

Șoarecii au fost împărțiți în 12 grupuri (10 per grup). Soluțiile de probă care au fost preparate din Cistanche au fost colectate din zece habitate diverse și au fost administrate de două ori pe zi (dimineața și seara) prin gavaj la o doză de 30 g/kg greutate corporală timp de patru zile. Grupurile martor și martor pozitiv au cuprins volume egale de apă distilată și soluție de dietilstilboestrol și au fost administrate de două ori pe zi timp de patru zile. În a cincea zi, probele de sânge care conțineau medicament au fost extrase de la șoarecii anesteziați. Probele au fost centrifugate (5,000 rpm, 10 min), iar supernatanții (probe de ser care conțin medicamente) au fost separați. Probele de ser care conțin medicament au fost inactivate prin încălzire la 56 de grade într-o baie de apă timp de 30 de minute și au fost filtrate printr-un filtru de 0,22-μm înainte de testul MTT. Concomitent, uterul șoarecilor a fost imediat excizat și cântărit pentru a calcula indicii greutății uterine. Experimentarea pe animale a fost inițiată după cinci zile de aclimatizare. Soarecii au postit peste noapte cu acces liber la apa inainte de administrarea solutiilor de testat. Prezentul studiu a fost realizat în strictă conformitate cu recomandările Ghidului pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator al National Institutes of Health. Toate procedurile experimentale au fost revizuite și aprobate de Comitetul de etică a animalelor al Universității de Comerț din Harbin. Toate procedurile potențial stresante au fost efectuate sub anestezie cu pentobarbital de sodiu.

Testul 2,7 MTT

Celulele MCF7 au fost co-cultivate cu RPMI 1640 fără roșu de fenol (conținând 5% CDT-FBS) timp de patru zile. Celulele au fost însămânțate în 96-plăci de godeuri la o densitate de 2,000 celule/godeu. S-a realizat o cultură aderentă și după 72 de ore de cultură, celulele au fost co-cultivate în mediu RPMI 1640 care conține probe de ser de la șoareci tratați cu Cistanche. Experimentele au fost efectuate în șase replici. Ulterior, s-au adăugat 20 μL de soluție MTT (5 mg/mL în PBS) în fiecare godeu și celulele au fost incubate timp de 4 ore. După îndepărtarea mediului, s-au adăugat 150 ui de DMSO pentru a produce produsul formazan, iar plăcile au fost agitate la întuneric pentru a se dizolva complet. Absorbanța a fost măsurată la 570 nm folosind un cititor de microplăci. Rata de proliferare a fost calculată ca valoarea medie de absorbție a grupului de ser care conține medicament împărțită la valoarea medie de absorbție a grupului martor (celule co-cultivate în RPMI 1640 fără ser).

2.8 Analiză statistică

Testul t cu eșantion pereche (cu două cozi) a fost utilizat pentru a identifica diferențele semnificative statistic între valorile din grupul martor și grupul experimental. Diferențele au fost considerate semnificative la un nivel de încredere de 95% (p <>

PCA a fost utilizat pentru a evalua zonele de vârf caracteristice în cromatogramele probelor din zece habitate diverse. Analiza bivariată și analiza corelației Gray au fost utilizate pentru a evalua corelația zonelor de vârf și activitatea lor estrogenică. Corelația a fost calculată prin statisticile software SPSS (SPSS pentru Windows 21.0, SPSS Inc., SUA). Diferențele au fost considerate semnificative la un nivel de încredere de 95% (cu două cozi).

Aprobare etică: Cercetarea efectuată nu are legătură nici cu utilizarea umană, nici pe animale.

3. Rezultate si discutii

3.1 Analiza clusterului și evaluarea similitudinii

Abaterea standard relativă a timpului de retenție și a zonei de vârf a vârfurilor caracteristice au fost {{0}},58 și 0,34% pentru precizie, 0,52 și {{8} },31 la sută pentru reproductibilitate și {{10}},19 și, respectiv, 0,13 la sută pentru stabilitate. Aceste constatări au indicat că metoda noastră LC de stabilire a amprentelor digitale a fost rezonabilă și de încredere. Asemănările cromatogramelor a zece probe au fost mai mari de 0,9. Vârfurile comune pentru toate probele nu au putut reprezenta pe deplin constituenții caracteristici ai Cistanche, deoarece vârful ar fi putut fi pierdut. Prin urmare, numărul de potrivire a probei a fost ajustat de la 26 la 20 pentru a obține o hartă cromatogramă mai precisă. Au fost obținute un total de 26 de vârfuri, iar suma ariilor acestora a fost mai mare de 0,8 în comparație cu cele ale zonei totale a vârfurilor din eșantion. Prin urmare, am ajuns la concluzia că aceste vârfuri cromatografice ar putea reflecta în mod eficient constituenții chimici principali ai Cistanche. Rezultatele analizei cluster sunt prezentate în Figura 1. Un total de zece habitate diverse au fost împărțite în trei categorii, după cum urmează: (A) 2, Guizhou; 3, Qinghai; 4, Chaidamu; 10, Neimeng; 7, Xinjiang și 6, Sichuan. (B) 1, Xizang; 8, Ningxia și 5, Alashan. (C) 9, Hubei. Tendința analizei cluster a arătat că habitatele plantelor medicinale sunt similare atunci când se află în partea de jos a pragului. Dar odată cu creșterea pragului, condițiile climatice și de creștere ale habitatelor sunt apropiate. Ea arată că analiza cluster nu poate doar să distingă bine diversele habitate, ci și să reflecte afinitățile dintre ele.

3.2 Identificarea constituenților chimici

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Cu cât valoarea absolută a încărcăturii proprii este mai mare, cu atât influența compușilor asupra indicilor estrogenici este mai mare.

Cromatogramele lui Cistanche și probele standard au fost comparate pentru a identifica componentele individuale în aceleași condiții LC-MS. După cum se arată în Tabelul 1, au fost identificați un total de 26 de constituenți pe baza timpului de retenție și a datelor MS [24-26]. Ingredientele active sunt administrate oral sub formă de amestecuri, mai degrabă decât monomeri, deoarece medicina tradițională chineză este sub formă de amestec pentru a juca un rol terapeutic. Un singur compus după ce a fost separat individual nu sa dovedit a juca un rol. Scopul nostru este de a dezvălui compuși care au activitate estrogenică în componentele cunoscute ale Cistanche [23-30] și, prin urmare, nu au selectat RMN și alte mijloace tehnice pentru a le valida identitatea. Vârful 1 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 373 (C16H22O10), care a fost identic cu compoziția elementară a acidului geniposidic. Acest lucru a fost susținut de pierderea unui fragment de glucoză care a produs un ion fragment cu un raport m/z de 211. Vârful 2 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 461 (C20H30O12), care a fost identic cu compoziția elementară. a decafeoilacteozidei și a fost susținută de pierderea unui fragment ramnosil, formând o fragmentare cu un raport m/z de 315. Vârful 4 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 375 (C16H24O10), care a fost identic cu cel compoziţia elementară a acidului 8-epiloganic. Pierderea unui fragment de glucoză, a format o fragmentare cu un raport m/z de 213, a susținut în continuare inferența. Vârful 6 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 607 (C29H36O14), care a fost identic cu compoziția elementară a siringalidei A3'- - l-ramnopiranozidei.

Pierderea unui fragment caff, a format un ion de fragment cu un raport m/z de 445, a susținut în continuare inferența. Vârful 8 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 799 (C36H48O20), care a fost identic cu compoziția elementară a cistanozidei A. Pierderea unui fragment caff a format un ion fragment cu un raport m/z de 637, a susținut în continuare inferența. Vârful 11 ​​a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 487 (C21H28O13), care a fost identic cu compoziția elementară a cistanozidei F. Acest lucru a fost susținut de pierderea unui fragment ramnosil care a produs un ion fragment cu un m/z raportul de 341, iar pierderea unui alt fragment caff a format un ion de fragment cu un raport m/z de 179, a susținut în continuare inferența. Vârful 12 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 813 (C37H50O20), care a fost identic cu compoziția elementară a cistanozidei B. Pierderea unui fragment de glucoză a format un ion fragment cu un raport m/z de 651, a susținut în continuare inferența. Vârful 13 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 827 (C37H48O21), care a fost identic cu compoziția elementară a tubulozidei A. Pierderea unui fragment ramnosil a format o fragmentare cu un raport m/z de 681, în continuare. a susținut inferența. Vârful 14 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 637 (C30H38O15), care a fost identic cu compoziția elementară a cistanozidei C. Pierderea unui fragment ramnosil a format un ion fragment cu un raport m/z de 491, a susținut în continuare inferența.

Vârful 15 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 591 (C29H36O13), care a fost identic cu compoziția elementară a osmantuzidei B. Pierderea unui fragment ramnosil a format un ion fragment cu un raport m/z de 445, a susținut în continuare inferența. Vârful 16 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 623 (C29H36O15), care a fost identic cu compoziția elementară a actozidei. Pierderea unui fragment caff, a format un ion de fragment cu un raport m/z de 461, a susținut în continuare inferența. Vârful 18 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 623 (C29H36O15), care a fost identic cu compoziția elementară a izoacteozidei. Pierderea unui fragment caff, forepeak 15 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 591 (C29H36O13), care a fost identic cu compoziția elementară a osmantuzidei B. Pierderea unui fragment ramnosil a format un ion fragment cu un Raportul m/z de 445, a susținut în continuare inferența. Vârful 16 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 623 (C29H36O15), care a fost identic cu compoziția elementară a actozidei. Pierderea unui fragment caff, a format un ion de fragment cu un raport m/z de 461, a susținut în continuare inferența. Vârful 17 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 623 (C29H36O15), care a fost identic cu compoziția elementară a cis-acteozidei. Pierderea unui fragment caff, a format un fragment iod un fragment de ion cu un raport m/z de 461, a susținut în continuare inferența. Vârful 21 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 653 (C30H38O16), care a fost identic cu compoziția elementară a campneozidei Ⅰ.

Pierderea unui fragment caff a format un ion fragment cu un raport m/z de 491, iar pierderea unui alt fragment ramnosil a format un ion fragment cu un raport m/z de 345, susținând în continuare inferența. Vârful 22 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 665 (C31H38O16), care a fost identic cu compoziția elementară a tubulozidei B. Pierderea unui fragment CH3CO a format un ion fragment cu un raport m/z de 623, iar pierderea unui alt fragment caff a format un ion de fragment cu un raport m/z de 461, susținând în continuare inferența. Vârful 23 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 639 (C29H36O16), care a fost identic cu compoziția elementară a campneozidei. Pierderea unui fragment ramnosil, a format un ion de fragment cu un raport m/z de 493, a susținut în continuare inferența. Vârful 24 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 665 (C31H38O16), care a fost identic cu compoziția elementară a 2’-acetilacteozidei. Pierderea unui fragment Ac a format un ion fragment cu un raport m/z de 623, iar pierderea unui alt fragment caff a format un ion fragment cu un raport m/z de 461, susținând în continuare inferența. Vârful 25 a indicat un ion deprotonat predominant cu un raport m/z de 445 (C20H30O11), care a fost identic cu compoziția elementară a cistanozidei G. Pierderea unui fragment ramnosil a format un ion fragment cu un raport m/z de 299, a susținut în continuare inferența. Structurile compușilor sunt enumerate în Figura 2.

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Aceste vârfuri au fost următoarele: 9, 12, 14 și 15. În consecință, echinacozida, cistanozida B, osmantuzida B și acteozida, corespunzând unui total de 4 vârfuri, au fost selectate ca variabile reprezentative pentru activitatea estrogenică (Figura 3).

.

3.4 Determinarea activității estrogenice

S-a calculat raportul dintre greutatea umedă a uterului și greutatea corporală a fiecărui șoarece (Figura 4). Animalele expuse la Cistanche din nouă habitate au prezentat activități estrogenice semnificative prin creșterea greutății uterine în comparație cu șoarecii din grupul martor. Figura 4 arată în continuare rata de proliferare a celulelor MCF7 tratate cu serul șoarecilor tratați cu Cistanche. Celulele tratate cu seruri de șoareci cărora li sa administrat Cistanche din zece habitate au prezentat o creștere semnificativ mai mare în comparație cu celulele lipsite de tratament.

3.5 Analiză bivariată

În studiul de față, am observat că greutățile uterine ale șoarecilor Kunming femele imaturi au crescut și a fost promovată proliferarea celulelor canceroase de sân umane MCF7. Aceste descoperiri au verificat activitatea estrogenică a Cistanche. Figura 5 a indicat indicii uterini și ratele de proliferare a celulelor MCF7 ale acestor constituenți. Coeficientul de corelație al lui Pearson a fost utilizat pentru a calcula zonele de vârf relative, care corespundeau activității estrogenice a probelor. Coeficienții de corelație mai mari de 0,3 au fost considerați semnificativi (p < 0.05),="" în="" timp="" ce="" coeficienții="" de="" corelație="" mai="" mari="" de="" 0,5="" au="" fost="" considerați="" foarte="" semnificativi="" (p="">< 0,01).="" pe="" baza="" rezultatelor,="" sa="" demonstrat="" că="" cistanche="" posedă="" activitate="">

Un total de nouă compuși s-au corelat semnificativ cu creșterea greutății uterine (p <{{0}},05), în="" timp="" ce="" zece="" compuși="" s-au="" corelat="" semnificativ="" cu="" proliferarea="" celulară="" mcf7="" (p=""><0,05). compușii="" care="" s-au="" corelat="" semnificativ="" cu="" greutatea="" uterului="" și="" proliferarea="" celulară="" au="" fost="" 8-acidul="" epiloganic,="" salidrozida,="" siringalida="" a3'{-="" -="" l-ramnopiranozida,="" cistanozida="" a,="" cistanozida="" b,="" cistanozida="" c,="" osmantuzida="" b,="" acteozida,="" izoacteozida,="" tubulozida="" b,="" 2’-acetilaceozidă="" și="" doi="" compuși="" necunoscuți="" (figura="" 5).="" acești="" treisprezece="" compuși="" exercitau="" activități="">

3.6 Metoda de analiză a corelației gri

Figura 6 prezintă corelația relativă a vârfurilor caracteristice a 26 de compuși cu indicii uterini, iar Figura 7 arată corelația relativă a vârfurilor caracteristice ale celor 26 de compuși cu ratele lor de proliferare celulară. Un total de trei compuși au prezentat cea mai mare corelație cu indicii uterini, și anume 8-acidul epiloganic, cistanozida F și acteozida (Figura 6, în ordine descrescătoare); în timp ce cei șase compuși care au prezentat cea mai mare corelație cu proliferarea celulelor MCF7 au fost echinacozida, cistanozida F, cistanozida B, osmantuzida B, izoacteozida și tubulozida B (Figura 7, în ordine descrescătoare). Corelațiile relative dintre echinacozide, osmantuzide B, acteozide și izoacteozide au fost mai mari decât 0.5.

3.7 Optimizarea condițiilor LC-MS

Pentru a obține o hartă cromatogramă mai bună, s-au comparat metanolul și acetonitrilul. În final, combinația de acid formic apos (0,2 procente, v/v) - acetonitril a fost cea mai bună fază mobilă pentru separare. În intervalul de scanare cu lungime de undă completă de 200-400nm, 254 nm a fost selectat ca optim. În plus, parametrii MS au fost, de asemenea, îmbunătățiți. Modul de scanare cu ioni negativi a fost selectat deoarece a îmbunătățit valorile de răspuns ale majorității ingredientelor din Cistanche.

4. Concluzie

Tehnologia LC-Q-TOF-MS a fost utilizată pentru a identifica constituenții activi estrogenici ai Cistanche. Studiul de față a ilustrat că 8-acidul epiloganic, salidrozida, siringalida A3'{- -l-ramnopiranozida, cistanozida A, echinacozida, cistanozida F, cistanozida B, cistanozida C, osmantuzida B, acteozida, izoacteozida, tubulozida B, 2’-acetillacteozidul și doi compuși necunoscuți au fost principalii constituenți activi ai Cistanche. Cu toate acestea, aceste constatări necesită studii suplimentare pentru a explora efectele in vivo și mecanismul de acțiune al constituenților.

Mulțumiri:

Acest proiect a fost susținut de Fundația Națională pentru Științe Naturale din China (nr. 81073015), Fundația Natură Științifică a provinciei Heilongjiang (ZD2017014) și planul de formare pentru tineri talent inovatori al Colegiului din provincia Heilongjiang (UNPYSCT-2017209) . Autorii declară că nu există niciun conflict de interese cu privire la publicarea acestei lucrări.

Referințe

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., Fitochimie, farmacologie , controlul calității și cercetările viitoare ale Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl: O revizuire, J. Ethnopharmacol., 2018, 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., Strategia metabolomică pseudoțintită integrată și globală aplicată la screening-ul pentru markeri de control al calității pentru Citrus TCM, Anal. Bioanal. Chem., 2017, 409(20), 4849-4865.

[3] Yang B., Wang Y., Shan L., Zou J., Wu Y., Yang F., Zhang Y., Li Y., Zhang Y., A Novel and Practical Chromatographic "Fingerprint-ROC-SVM „Strategia aplicată analizei calității injecțiilor cu medicina tradițională chineză: utilizarea injecției KuDieZi ca studiu de caz, molecule, 2017, 22

(7). PII: E1237.[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., Screeningul markerilor de control al calității bioactivi ai pastilelor de picurare QiShenYiQi pe baza relației dintre amprenta cromatografiei lichide de ultra-înaltă performanță și activitate de protecție vasculară, J. Sep. Sci., 2017, 40(20), 4076-4084.

[5] Liu N., Li J., Li BG, Aplicarea analizei și gândirii statistice multivariate în controlul calității medicinei chineze, Zhongguo. Zhong. Yao. Za. Zhi., 2014, 39

(21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Da J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, date despre componentele caracteristice orientate HPLC/qTOF-MS set și analiza chimiometrică pentru controlul holistic al calității preparatelor complexe TCM: pilula Niuhuang Shangqing ca exemplu, J. Pharm. Biomed. Anal., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., Thrift AP, High Negative Predictive Value, Low Prevalence, and Spectrum Effect: Caution in the Interpretation, Clin. Gastroenterol. Hepatol., 2017, 15(9), 1355-1358.

[8] Liang J., Chen Y., Ren G., Dong W., Shi M., Xiong L., Li J., Dong J., Li F., Yuan J., Screening Hepatotoxic Components in Euodia rutaecarpa de către UHPLC-QTOF/MS Bazat pe relația spectru-toxicitate, Molecules., 2017, 22(8). PII: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., Screeningul și identificarea componentei hepatotoxice în Evodia rutaecarpa pe baza relației spectru-efect și UPLC-Q-TOFMS, Biomed . Chromatogr., 2016, 30(12), 1975-1983.

[10] Chopard G., Puyraveau M., Binetruy M., Meyer A., ​​Vandel P., Magnin E., Berger E., Galmiche J., Mauny F., Spectrum Effect and Spectrum Bias in the Screening Test Performance for Amnestic Deficiență cognitivă ușoară: Care sunt implicațiile clinice?, J. Alzheimers. Dis., 2015, 48(2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, She GM, Relațiile spectru-efect ca abordare sistematică a cercetării în medicina tradițională chineză: starea actuală și perspectivele viitoare, Molecules., 2014, 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., Relații spectru-efect între amprentele UPLC și bioactivitățile rădăcinilor secundare brute ale Aconitum carmichaelii Debeaux (Fuzi) și cele trei produse procesate ale sale asupra creșterii mitocondriale cuplate cu analiza corelației canonice, J. Ethnopharmacol., 2014,153(3) , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., Relații spectru-efect între amprentele chimice și Efectele antibacteriene ale bazei Lonicerae Japonicae Flos și Lonicerae Flos pe UPLC și microcalorimetrie, față. Pharmacol., 2016, 7, 12.

[14] Usher-Smith JA, Sharp SJ, Griffin SJ, The spectrum effect in tests for risk prediction, screening, and diagnostic, BMJ, 2016, 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., Urmărirea compușilor hemostatici noi din produsele de încălzire ai flavonoidelor totale din Flos Sophorae pe spectru -relații de efect și cromatografie pe coloană, J. Sep. Sci., 2015, 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Investigație privind relațiile spectru-efect ale lui Da-Huang-Fu- Zi-Tang la șobolani prin metoda UHPLC-ESI-Q-TOF-MS, J. Ethnopharmacol., 2014, 154(3), 606-612.

[17] Xie RF, Zhou X., Shi ZN, Li YM, Li ZC, Studiu privind relația de efect de spectru a rizomului Rhei, cortex Magnoliae Officinalis, Fructus Aurantii Immaturus și formula lor, J. Chromatogr. Sci., 2013, 51(6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., Activitatea antiosteoporotică a echinacozidei la șobolani ovariectomizați, Phytomedicine., 2013, 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., Efecte anti-hiperglicemice și hipolipidemice ale Cistanche tubulosa la șoarecii DB/DB diabetici de tip 2, J. Ethnopharmacol., 2013, 150(3) , 935- 945.

[20] Morikawa T., Ninomiya K., Imamura M., Akaki J., Fujikura S., Pan Y., Yuan D., Yoshikawa M., Jia X., Li Z., Muraoka O., glicozide feniletanoide acilate , echinacozidul și acteozidul din Cistanche tubulosa, îmbunătățesc toleranța la glucoză la șoareci, J. Nat. Med., 2014, 68(3), 561-566.

[21] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Glicozide feniletanoide cu activități antiinflamatorii din tulpinile de Cistanche deserticola cultivate în deșertul Tarim, Fitoterapia., 2013, 89, {{4] }}.

[22] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Analiza cantitativă a Cistanches Herba folosind cromatografie lichidă de înaltă performanță cuplată cu detectarea matricei de diode și spectrometrie de masă cu rezoluție combinată cu metode chimiometrice, J. Sep. Sci., 2013, 36(12), 1945-1952.

[23] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Caracterizarea structurală și identificarea glicozidelor feniletanoide din Cistanches deserticola YC Ma de către UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. Anal., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Activitatea antiproliferativă a fenilpropanoizilor izolați din Lagotis brevituba Maxim, Phytother . Res., 2017, 31(10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., Determinarea simultană a componentelor cu polaritate largi și game de conținut în Cistanche tubulosa utilizând cromatografie cu interacțiune în fază inversă-hidrofilă cuplată în serie-spectrometrie de masă în tandem, J. Chromatogr. A., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., Aplicarea metabolomicei bazate pe 1H RMN pentru discriminarea diferitelor părți și dezvoltarea unui nou flux de lucru de procesare pentru Cistanche deserticola, Acta. Farmacă. Păcat. B., 2017, 7(6), 647-656.

[27] Pan YN, Studii privind constituenții și bioactivitatea proaspătă a Cistanche tubulosa, Ph.D. teză, Universitatea Farmaceutică Shenyang, Shenyang, China, 2011.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X., Profilul metabolic al acteozidei produs de bacterii intestinale umane sau de șobolan sau enzime intestinale in vitro a folosit UPLC Q-TOF–MS, Fitoterapia., 2016, 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., Caracterizarea sistematică a metaboliților echinacozidei și acteozidei din Cistanche tubulosa în plasma, bilă, urină și fecale de șobolan. UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr., 2016(9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., O modalitate metabolică de a investiga obstacolele asociate care cauzează o biodisponibilitate slabă în administrarea orală a izoacteozidei la șobolani care utilizează cromatografie lichidă de performanță ultraînaltă/ Spectrometrie de masă în tandem în timp de zbor cu patru poli, Rapid. comun. Mass. Spectrom., 2017(4), 371-380.