Clonarea genelor, identificarea funcțională, analiza structurală și de expresie a zaharozei sintaza din Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 Analiza expresiei CtSus în diferite părți ale Cistanche tubulosa și sistemul de cultură celulară sub stres de secetă

4.1 Analiza expresiei CtSus în diferite părți ale Cistanche tubulosa

In vitro, experimentele de transformare a celulelor întregi și experimentele de reacție catalitică enzimatică au confirmat că proteina codificată de gena CtSus poate cataliza sinteza UDP-glucozei. Pentru a explora în continuare corelația dintre această genă și biosinteza compușilor glicozidici din Cistanche tubulosa, a fost analizat nivelul de expresie al acestei gene în diferite părți ale Cistanche tubulosa.

IRBĂ DE CISTANCHE DE ÎNALTĂ CALITATE CU 10-98% ECHINACOSIDE

Echinacoside is the most representative glycoside compound in Cistanche tubulosa, and its content can reach more than 30% of the dry weight of Cistanche tubulosa plants [23]. The research group previously measured the content of echinacoside in different parts of Cistanche tubulosa plants. Specifically, the content of echinacoside in different tissues is as follows: haustoria>underground part>>parte aeriană; dintre acestea, conținutul de echinacozid din haustoria este cel mai mare.

PCR cantitativ cu fluorescență în timp real a fost efectuată folosind cADN din diferite părți ale Cistanche tubulosa ca șabloane, iar rezultatele au fost analizate prin metoda 2-ΔΔCT și a fost efectuată o analiză diferențială. Rezultatele sunt prezentate în Figura 4A. Nivelul de expresie al genei CtSus în haustoria a fost cel mai ridicat, de 1,5 ori mai mare decât cel al părții aeriene, iar nivelul de expresie în partea subterană a fost semnificativ mai mare decât cel din partea aeriană, ceea ce este în concordanță cu modelul de acumulare a glicozidelor feniletanoide. reprezentată de echinacozidă în diferite părți ale Cistanche tubulosa.

Figura 4 Nivelurile relative de expresie ale CtSus în diferite părți ale C. tubulosa și celulele suspensie tratate cu PEG6000. A: Nivelul de expresie relativ al CtSus în diferite părți ale C. tubulosa; B: Nivelul relativ de expresie al CtSus în celulele suspensiei de C. tubulosa tratate cu PEG6000 la diferite momente de timp. n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

4.2 Analiza expresiei CtSus în celulele suspensiei Cistanche deserticola în condiții de stres de secetă

Cercetările preliminare ale proiectului au arătat că stresul de secetă indus de PEG6000 poate crește semnificativ acumularea de glicozide de feniletanol în celulele suspensiei de Cistanche deserticola. De la 3 la 9 zile după inducție, conținutul de echinaceaside a crescut semnificativ. Din a 12-a până în a 15-a zi, rata de creștere a conținutului de echinacozid a încetinit și a atins valoarea maximă în a 15-a zi. Apoi, pe măsură ce timpul de cultură a crescut, conținutul de echinacozidă a crescut semnificativ. Conținutul de fructozidă a scăzut treptat [24]. Pe baza acestei cercetări, această lucrare a folosit cADN-ul celulelor de suspensie de Cistanche deserticola netratate și celulele de suspensie de Cistanche deserticola induse de PEG6000-ca șabloane pentru a efectua detectarea PCR cantitativă cu fluorescență în timp real pentru a examina gena CtSus în celulele de suspensie de Cistanche deserticola sub conditii de stres de seceta. Modificări ale nivelurilor de expresie. Rezultatele sunt prezentate în Figura 4B. În celulele de suspensie Cistanche deserticola induse de PEG6000, expresia CtSus a crescut semnificativ în a 6-a zi după inducție, a atins cea mai mare valoare în a 9-a zi și apoi a scăzut înapoi la același nivel ca martor. Grupuri de același nivel. Rezultatele de mai sus arată că stresul cauzat de secetă poate crește în mod semnificativ expresia genei CtSus în linia celulară de suspensie Cistanche deserticola, ceea ce este în concordanță cu modelul de acumulare a echinaceasidei sub stresul de secetă. Cu toate acestea, expresia maximă a genei CtSus apare mai devreme decât vârful conținutului de echinaceaside, deoarece donorul activ de glicozil sintetizat prin cataliza CtSus este un precursor important necesar pentru reacția de glicozilare în mai multe etape în calea biosintetică ulterioară a echinaceasidei. , se speculează că, după ce au fost supuse stresului cauzat de secetă, organismele vor mobiliza de preferință genele legate de metabolismul primar pentru a realiza acumularea de donatori activi, iar apoi vor realiza o acumulare importantă de metabolizare secundară a produselor metabolice.

5 Studiu asupra structurii tridimensionale a proteinei CtSus și analiza site-urilor active cheie

Pe baza funcției CtSus în catalizarea producției de donator de glicozil UDP-glucoză, a fost studiată în continuare baza structurală a activității catalitice a CtSus. Instrumentul online SOPMA a fost folosit pentru a prezice structura secundară a proteinei. Rezultatele au arătat că structura secundară a CtSus conținea 55,28% elice, 25,47% spire aleatoare, 12,80% fire extinse și 6,46% spire (Figura 5A), indicând că elice sunt cele mai importante unități structurale secundare din proteina CtSus, urmate de bobine aleatorii, care reprezintă, de asemenea, o mare parte a proteinei. Șuvițele și spirele extinse sunt distribuite în întreaga proteină. Conform studiilor existente, zaharoza sintetaza există de obicei sub formă de tetramer, care este considerat a fi forma sa activă. Prin urmare, această lucrare a folosit în continuare AlphaFold2 pentru a prezice structura proteinei CtSus și a obținut structura sa tridimensională a tetramerilor de proteine. Comparația bazei de date PDB (Protein Data Bank) a constatat că asemănarea secvenței dintre Arabidopsis thaliana zaharoză sintetaza AtSus1 (PDBID 3S28) și CtSus poate ajunge la 77,93%. Structura CtSus prezisă a fost comparată cu structura tridimensională AtSus1, iar valoarea deviației pătrate medii (RMSD) după suprapunerea proteinei a fost de 1,11 Å, ceea ce indică faptul că structurile spațiale ale celor două sunt foarte consistente (Figura 5B).

Figura 5 Investigarea structurală a CtSus. A: Structura secundară prezisă a CtSus folosind SOPMA. Albastru: helix; Violet: bobină aleatorie; Roșu: șuviță prelungită; Verde: foaie. B: Alinierea structurii tridimensionale a AtSus1 (în culoare albastră) și CtSus (în culoare verde). Ambele au fost prezentate ca tetramer.C: Reziduuri cheie în buzunarul de legare a substratului de AtSus1 (în culoare albastră) și CtSus (în culoare verde cu reziduuri marcate); D: Alinierea conformațiilor de legare ale UDP și fructozei în AtSus1 (în culoare albastră) și CtSus (în culoare verde); E: Interacțiunile dintre UDP și CtSus prezentate în diagrama 2D analizată de Discovery Studio Client

Structura complexă cristalină proteină-ligand raportată a Arabidopsis AtSus1 cu UDP și fructoză (PDBID3S29) a fost utilizată ca șablon [16] pentru a analiza modul de legare a CtSus cu UDP și fructoză. Rezultatele de andocare moleculară sunt prezentate în Figura 5C. Se poate observa că buzunarele de legare de substrat ale AtSus1 și CtSus sunt foarte asemănătoare în ceea ce privește tipul de aminoacizi, distribuția spațială și configurația, iar suprapunerea este mare, demonstrând că secvența zaharozei sintetazei este foarte conservată în plante. Conformațiile celor doi liganzi, UDP și fructoză, în buzunarul de legare a substratului proteic, sunt prezentate în Figura 5D. Conformația cea mai avantajoasă de andocare moleculară a UDP și CtSus se suprapune bine cu conformația UDP din complexul cristalin AtSus1-UDP, dovedind acuratețea rezultatelor de andocare moleculară. Interacțiunea dintre UDP și reziduurile cheie de aminoacizi din buzunarul de legare a substratului proteic este prezentată în Figura 5E. UDP și CtSus sunt legate în principal împreună prin legături de hidrogen și interacțiuni hidrofobe. Resturile cheie de aminoacizi din buzunarul de legare a substratului includ Leu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 și Glu681.

Discuţie

Modificarea glicozilării este unul dintre mijloacele importante de îmbunătățire a proprietăților fizice și a activităților biologice ale produselor naturale sau ale precursorilor de medicamente. În comparație cu metodele chimice tradiționale, modificarea glicozilării enzimatice are avantajele condițiilor de reacție blânde, selectivitate puternică și prietenos cu mediul. Cu toate acestea, reacția de glicozilare a glicoziltransferazei necesită o cantitate mare de donatori de zahăr UDP, care sunt scumpi și greu de obținut, rezultând faptul că glicoziltransferazele nu pot fi utilizate pe scară largă în producția industrială. Zaharoza sintetaza poate cataliza reacția reversibilă: zaharoză + UDP ⇌ UDP-glucoză + fructoză și poate forma un ciclu UDP-glucoză regenerabil printr-o reacție de cuplare cu glicoziltransferaza. Cistanche tubulosa este bogată într-o varietate de compuși glicozidici de diferite tipuri structurale, reprezentați de compuși feniletanol glicozidici, ceea ce sugerează că calea activă de sinteză a donorului de glicozil în organismul său care implică zaharoză sintaza are un metabolism puternic, dar zaharoza sintaza relevantă din plantele Cistanche nu are un metabolism puternic. fost raportat. În acest studiu, o genă de sucroză sintetază CtSus a fost donată pentru prima dată din Cistanche tubulosa. Proteina codificată de această genă conține domeniul conservat al zaharozei sintazei vegetale. Prin compararea secvenței de sucroză sintazelor de la alte plante, s-a constatat că asemănarea secvenței de aminoacizi între aceasta și zaharoză sintazelor din plante de același ordin a fost mai mare de 90%, indicând un grad ridicat de conservare a secvenței de zaharoză sintazelor din plante. Analiza evoluției moleculare a arătat că CtSus aparține ramurii zaharozei sintazei plantelor dicotiledonate și este cel mai strâns legat de zaharoza sintaza PrSus din P. ramosa din familia Orobanchaceae.

Pentru a explora activitatea catalitică a CtSus, acest studiu a combinat glicoziltransferaza UGT71BD1, a cărei activitate a fost verificată anterior de grupul de cercetare, pentru a construi un sistem de co-expresie cu plasmid dublu. Prin experimente catalitice cu celule întregi, condițiile au fost atinse fără adăugarea de donatori suplimentari de zahăr UDP. Reacția de glicozilare a compusului cumarinic scorțișoară și resveratrol al compusului stilben. Comparativ cu grupul de control, adăugarea de CtSus a crescut semnificativ rata de conversie a reacțiilor de glicozilare catalizate de UGT71BD1-. Pe această bază, acest studiu a construit în continuare o plasmidă de expresie recombinată CtSus și a obținut expresia solubilă a proteinei recombinante în E. coli. In vitro, reacțiile catalitice enzimatice arată că, în prezența zaharozei și a UDP, CtSus poate cataliza generarea de UDP-glucoză, iar după ce eticheta de afinitate a factorului de declanșare conținută în proteina recombinată este îndepărtată, produsul CtSus catalizează generarea de UDP. -se obtine glucoza. Rata a fost îmbunătățită semnificativ. Transformarea celulelor întregi și rezultatele reacției catalitice enzimatice in vitro au confirmat activitatea CtSus ca un donator de zahăr activ catalitic de zaharoză sintază UDP-glucoză. Pentru a explora în continuare corelația dintre gena CtSus și biosinteza glicozidelor din Cistanche tuberosum, expresia CtSus în diferite părți ale Cistanche tuberosum a fost analizată prin experimente PCR cantitative cu fluorescență în timp real. Rezultatele au arătat că gena a fost exprimată în haustoria Cistanche tuberosum. Cel mai înalt nivel de expresie. Cistanche deserticola este o plantă parazită și nu poate obține nutrienții necesari creșterii și dezvoltării prin fotosinteză. Prin urmare, trebuie să fie parazit pe rădăcinile plantei gazdă și să se bazeze pe planta gazdă pentru a obține nutrienți pentru a menține creșterea. În plante, zaharoza furnizează în principal surse de energie și de carbon [12]. Cu toate acestea, zaharoza nu poate fi utilizată direct de către celule și trebuie descompusă în continuare. Haustoria este puntea de legătură între Cistanche deserticola și planta gazdă și joacă un rol vital în procesul de creștere. crucial

[25], prin urmare, expresia ridicată a zaharozei sintetazei în haustoria de Cistanche deserticola este rezonabilă. Expresia ridicată a CtSus în haustoria este, de asemenea, în concordanță cu modelul mare de acumulare a glicozidelor feniletanoide în haustoria. În plus, prin analiza PCR cantitativă prin fluorescență a modificărilor nivelurilor de expresie a genei CtSus în celulele suspensiei de Cistanche deserticola la diferite momente sub stres de secetă, s-a descoperit că stresul de secetă poate crește semnificativ expresia genelor CtSus în linia celulară de suspensie, care este în concordanță cu echinaceaside. Modelul de acumulare în liniile celulare în suspensie sub stres de secetă este consistent. Rezultatele de mai sus sugerează că CtSus este implicat în calea de biosinteză a glicozidelor feniletanoide reprezentate de echinacea la Cistanche tulipis in vivo. Este una dintre numeroasele căi de biosinteză. Reacția de glicozilare din prima etapă furnizează donorul activ de glicozil UDP-glucoză. Pe scurt, acest studiu

Studiul a identificat o nouă genă a zaharozei sintazei în Cistanche deserticola, care a permis sinteza enzimatică in vitro a donatorilor activi de glicozil și a furnizat noi elemente genetice pentru construirea bacteriilor de inginerie pentru biosinteza glicozidelor Cistanche deserticola.

Contribuții autor: Tian Weisheng a fost responsabil pentru analiza bioinformatică, analiza expresiei, analiza activității enzimelor și scrierea primei schițe a genei CtSus; Yan Yaru a fost responsabil pentru screening-ul și clonarea genelor; Cui Xiaoxue și Huang Wenqian au participat la analiza bioinformatică și analiza expresiei; Wang Yingxia și Zhao Saijing au participat la construcția vectorului și analiza activității enzimelor; Li Jun și Shi Shepo au ghidat în principal analiza activității enzimatice și analiza expresiei; Tu Pengfei și Liu Xiao au fost responsabili pentru proiectarea ideii de hârtie, ghidarea experimentelor și scrierea și revizuirea lucrării. Toți autorii au participat la revizuirea lucrării.

Referințe

[1] Song ZH, Lei L, Tu PF. Progrese în cercetarea activității farmacologice la plantele din CistancheHoffing. et Link [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ și colab. Comparația chimiomelor între Cistanchetubulosa cultivată și sălbatică folosind spectroscopie ¹H-RMN [J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Song Y, Zeng K, Jiang Y, et al. Cistanches Herba, de la o specie pe cale de dispariție la un mare brand de medicină chineză [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.[4] Liu Y, Wang H, Yang M și colab. Polizaharidele Cistanche deserticola protejează celulele PC12 împotriva leziunilor induse de OGD/RP [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X și colab. Evoluția enzimelor de interconversie nucleotide-zahăr din plante [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Formarea, interconversia și salvarea zahărului din nucleotide vegetale prin reciclarea zahărului [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. Caracterizarea biochimică a UDP-GlcNAc/Glc4-epimerazei din Escherichia coli O86:B7 [J]. Biochimie, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr, et al. Identificarea UDP-N-acetilglucozamin4-epimerazei implicată în glicozilarea proteinei exosporium în Bacillus anthracis [J]. J Bacteriol,2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Identificarea la nivel de transcriptom a genelor de zaharoză sintetază în Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10]Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M și colab. Sucroză sintază: o glicoziltransferază unică pentru dezvoltarea procesului de glicozilare biocatalitică [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. The biosynthesis of sucrose [J]. J Biol Chem, 1955,214: 149-155.