Clonarea genelor, identificarea funcțională, analiza structurală și de expresie a zaharozei sintaza din Cistanche Tubulosa Ⅱ

Rezultate și analize

1 Exploatarea genelor de sucroză sintază în Cistanche tubulosa și clonarea genei CtSus

Using the amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 as a template[16], the sequence was aligned in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data. They were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>parte aeriană.

Cistanche Tubulosa de înaltă calitate pentru sănătatea bărbaților

Prin urmare, valorile FPKM ale nivelului de expresie ale celor două gene candidate de zaharoză sintetază obținute în screening-ul inițial în datele transcriptomului diferitelor părți ale Cistanche tubulosa au fost normalizate prin Z-Score și a fost efectuată o analiză diferențială (Figura 1A). Rezultatele au arătat că gena CtSus a avut cel mai înalt nivel de expresie în haustoriu, iar nivelul de expresie în partea subterană a fost mai mare decât cel din partea aeriană, ceea ce a fost în concordanță cu modelul de acumulare a compușilor glicozidici în diferite părți ale Cistanche tubulosa, în timp ce nivelul de expresie al genei CtSus1 în haustoriu a fost scăzut. Prin urmare, pe baza rezultatelor de mai sus, gena CtSus a fost selectată pentru amplificarea secvenței ulterioare, exprimarea exogenă și identificarea funcțională. Folosind ADNc de Cistanche tubulosa ca șablon, a fost obținut un produs cu o singură bandă la ~ 2500 bp după amplificarea PCR (Figura 1B). Produsul PCR a fost recuperat din gel și ligat la vectorul de donare, iar regiunea de codificare de lungime completă a genei țintă a fost obținută prin secvențiere. Lungimea secvenței CtSus a fost de 2418 bp.

Figura 1 Explorarea genelor și clonarea CtSus din C. tubulosa și analiza bioinformatică a proteinei codificate. R: Nivelurile de expresie ale genelor CtSus și CtSus1 în diferite părți ale C. tubulosa normalizate ca scoruri Z pe baza valorilor lor FPKM; B: Amplificarea genică a CtSus; M: marker ADN; C: domeniul conservator al proteinei CtSus prezis de SMART; D: Alinierea secvenței multiple a CtSus și a zaharozei sintazelor identificate de la alte plante, inclusiv Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum și Albuca bracteata. Domeniul de sinteză a zaharozei și domeniul de transfer al zahărului sunt reprezentate prin casete roșii și, respectiv, albastre; E: Analiza filogenetică a CtSus și a zaharosintazelor de la alte plante; F: Analiza SDS-PAGE a exprimării heterologe a CtSus folosind vectorul pCold™ I în E. coli. Banda 1: Marker proteic; Banda 2: fracția de supernatant; Banda 3: Fracție precipitată. Săgeata roșie arată proteina CtSus. G: PCR de colonie a unei singure clone care conține ambele două plasmide recombinante. M: marker ADN; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

Tabelul 2 Asemănări de secvență de aminoacizi între CtSus și zaharoză sintetaze identificate de la altă plantă

2.3 Analiza filogenetică

Arborele filogenetic construit de software-ul MEGA a fost utilizat pentru a analiza relația filogenetică dintre zaharoza sintetaza CtSus din Cistanche tubulosa și alte zaharoză sintetaze derivate din plante. Rezultatele sunt prezentate în Figura 1E. Sintazele zaharozei derivate din plante prezintă ramuri evolutive distincte în dicotiledone (regiunile I și II) și monocotiledone (regiunea III). CtSus este în ramura dicotiledone, iar secvențele care sunt cel mai strâns legate de CtSus sunt toate de la plante Lamiaceae (Cistanche tubulosa este o plantă Lamiaceae Orobanchaceae), în timp ce cealaltă ramură este compusă în principal din plante Solanales, ceea ce indică în continuare conservarea ridicată și omologia genelor de zaharoză sintetază derivate din plante în evoluția plantelor în aceeași ordine. Dintre acestea, zaharoza sintetaza PrSus (AEN79500.1) de la Phelipanche ramosa a plantei Orobanchaceae este cea mai strâns legată de CtSus.

3 Expresia exogenă și analiza activității CtSus

3.1 Expresia exogenă a genei CtSus Plasmidele pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus și pCold™ I-CtSus verificate prin secvențiere au fost transferate în E. coli Transetta (DE3) competentă pentru expresie, iar clonele pozitive au fost analizate prin PCR de colonie pentru verificarea secvențierii. Tulpinile de expresie recombinantă obținute au fost induse de IPTG la temperatură scăzută pentru exprimarea proteinei, bacteriile au fost colectate prin centrifugare și tamponul de liză a fost adăugat pentru a sparge bacteriile pentru a obține supernatant și precipitat, iar SDS-PAGE a fost efectuat pentru detectare. Rezultatele au arătat că atunci când pET-28a și pET-24b au fost folosite ca vectori de expresie, CtSus nu a fost exprimat în E. coli, în timp ce când pCold™ I a fost folosit ca vector de expresie, un CtSus clar Banda de proteine ​​recombinate a fost detectată în regiunea de ~ 100 kDa, ceea ce a fost în concordanță cu masa moleculară relativă prezisă teoretic de 92,2 kDa (Figura 1F).

3.2 Transformarea întregii celule

Pentru a verifica preliminar funcția catalitică a CtSus, a fost construită o tulpină de co-expresie a CtSus și a genei glicoziltransferazei UGT71BD1. UGT71BD1 a fost donat și identificat din Cistanche tubulosa și este o UDP-glucoziltransferază care poate accepta pe scară largă compuși aromatici cum ar fi glicozide feniletanoide, diferite tipuri de flavonoide, stilben și cumarină ca receptori și catalizează reacția de glucozilare a substratului cu grupa hidroxil fenolic UDP. ca donator de zahăr [18]. Introducerea CtSus poate furniza, teoretic, mai mult donor de glicozil UDP-glucoză pentru reacția de glucozilare catalizată de UGT71BD1, promovând astfel echilibrul reacției pentru a se îndrepta către formarea produșilor de glicozilare, crescând astfel randamentul produselor de glicozilare. Plasmida pCold™ I-CtSus și plasmida pET-28a-UGT71BD1 au fost transformate simultan în E. coli Transetta (DE3) competentă la expresie. Clonele unice care conțin ambele plasmide recombinante au fost testate prin PCR de colonie și tulpinile de expresie recombinantă pozitivă au fost obținute prin verificarea secvențierii (Figura 1G). Co-expresia genei duale a fost indusă in vitro și tulpina de expresie a genei unice pET-28aUGT71BD1 a fost utilizată ca grup de control. Activitatea CtSus în catalizarea generării donorului de UDP-glucoză a fost verificată preliminar prin transformarea celulelor întregi. Rezultatele HPLC și spectrometria de masă de înaltă rezoluție au arătat că atunci când reacția de transformare a celulelor întregi a fost efectuată cu aconitina 1 și resveratrolul 2 ca substrat, generarea de produși de glicozilare evidenti a fost detectată după 24 de ore de transformare, așa cum se arată în Figura 2.

Figura 2 Biotransformarea celulelor întregi a substratului 1 sau 2 prin tulpina recombinantă care găzduiește UGT71BD1 sau tulpina recombinată care găzduiește cuplarea UGT71BD1 cu CtSus, respectiv. A: Cromatogramele HPLC ale biotransformării celulare întregi a substratului 1. Lungimea de undă de detecție a fost de 360 ​​nm; B: spectrele HRESI-MS și MS2 ale produsului 1a; C: cromatograme HPLC ale biotransformării celulare întregi a substratului 2; Lungimea de undă de detecție a fost de 330 nm. D: Spectrele HRESI-MS ale produselor 2a și 2b

Când 1 (m/z 179,034 4 [M+H]+, formula moleculară C9H6O4) a fost utilizată ca substrat, vârful cromatografic al produsului 1a (m/z 341.087 2 [M+H]+, formula moleculară prezisă C15H16O9) a fost detectat la 5,39 min, ceea ce a fost în concordanță cu UV absorbția substratului și a produsului de control. În același timp, un vârf de fragment de m/z 179.033 4 [M+H]+ a fost detectat în spectrul MS2 al 1a, care a fost produs de 1a pierderea unei molecule de glucoză (162 Da), indicând faptul că 1a a fost produsul substratului 1 conectat la o moleculă de glucoză. Rata de conversie a fost calculată prin integrarea zonei de vârf. S-a descoperit că rata de conversie a celulelor întregi UGT71BD1 care catalizează substratul 1 pentru a genera produsul glicozilat 1a a fost de 71,87%, în timp ce adăugarea de CtSus a crescut rata de conversie a reacției la 95,84%, de 1,3 ori mai mare decât a grupului martor. Când substratul a fost compusul 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, formula moleculară C14H12O3), vârfurile cromatografice ale produsului 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, molecular prezis formula C20H22O8) și 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, formula moleculară prezisă C26H32O13) în concordanță cu absorbția UV caracteristică a substratului și produsul martor au fost detectate la 10,32 și, respectiv, 6,52 min. . Un vârf de fragment a fost detectat la 3 [MH]-, care a fost generat de pierderea unei molecule de glucoză (162 Da), indicând că 2a a fost produsul substratului 2 conectat la o moleculă de glucoză. Prin compararea cu datele din literatură [18] și cu informațiile de predicție din spectrometria de masă, s-a determinat că produsul 2b este produsul substratului 2 conectat la două molecule de glucoză. Rata de conversie a fost calculată utilizând zona de vârf integrată. S-a descoperit că adăugarea de CtSus ar putea crește rata de conversie a reacției de glicozilare a substratului 2 de la 64,01% la 78,51%, printre care randamentul produsului monozaharidic 2a a crescut de la 45,09% la 63,58% și randamentul produsului dizaharidic 2b. s-a modificat de la 18,92% la 14,93%.

3.3 Purificarea proteinei recombinate CtSus și identificarea activității enzimatice in vitro

Rezultatele întregului experiment de transformare celulară sugerează că CtSus are activitatea de catalizare a producției de UDP-glucoză donor activ de glucoză. Pentru a verifica în continuare direct această activitate catalitică prin reacția catalitică enzimatică in vitro, proteina de fuziune a genei CtSus în sistemul de expresie pCold™ a fost separată și purificată prin cromatografie de afinitate. Rezultatele au arătat că atunci când pCold™ I a fost utilizat ca vector de expresie, proteina recombinată a fost exprimată în cantități mari, dar mai ales în precipitat. Când pCold™ TF a fost utilizat ca vector de expresie, gena CtSus a fost exprimată în cantități mari în E. coli (Figura 3A). Proteina de fuziune a fost purificată prin cromatografie de afinitate HisTrap FF și supusă reacției catalitice enzimatice in vitro. Rezultatele sunt prezentate în Figura 3B. Atunci când zaharoza și UDP au fost utilizate ca substraturi, în comparație cu grupul martor negativ, a fost detectat un nou vârf de produs la 10,32 min. Timpul său de retenție și absorbția UV au fost în concordanță cu UDP-glucoză. S-a dovedit că produsul este UDP-glucoză prin comparație cu standardul. Cu toate acestea, deoarece proteina de fuziune exprimată de vectorul de expresie pCold™ TF conține o etichetă solubilă cu factor declanșator mare (dimensiunea proteinei etichetei este de 48 kDa), aceasta va avea un impact mare asupra activității catalitice a proteinei. Prin urmare, eticheta proteinei de fuziune a fost tăiată în continuare de enzima Factor Xa și proteina CtSus fără etichete exogene a fost purificată (Figura 3A). Proteina a fost supusă catalizei enzimatice in vitro, iar rezultatele au arătat că randamentul de UDP-glucoză a crescut de la 3,53% la 10,66%

(Figura 3B). Rezultatele de mai sus au confirmat activitatea CtSus în catalizarea producției de UDP-glucoză prin cataliză enzimatică in vitro și, de asemenea, au arătat că prezența unei etichete de afinitate mare este favorabilă expresiei solubile a CtSus, dar va afecta semnificativ și în activitatea catalitică vitro a enzimei.

Figura 3 Expresia heterologă și identificarea funcțională a CtSus. A: Analiza SDS-PAGE a proteinelor CtSus. Banda 1: Marker proteic; Banda 2: CtSus recombinant cu factor de declanșare; Banda 3: Se declanșează scindarea etichetei factorului de declanșare utilizând protează Factor Xa pentru a da proteina CtSus marcată de săgeata roșie. B: Teste enzimatice invitro care utilizează proteine ​​de fuziune și proteine ​​CtSus fără factor de declanșare pentru a cataliza sinteza UDP-glucozei în prezența zaharozei și, respectiv, UDP, cu standardul de referință UDP-glucoză. Proteina fiartă a fost folosită ca grup de control în aceleași condiții. Lungimea de undă de detectare a fost de 260 nm