Cauza bolii polichistice de rinichi

pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Supraexprimarea PKD1 cauzează boala polichistică de rinichi

Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté și Marie Trude

Mecanismele patogenetice care stau la bazaautosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple(ADPKD) rămân de elucidat. Deși există dovezi că Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)haploinsuficiența genei și pierderea heterozigozității pot cauza formarea de chisturi la șoareci, niveluri paradoxal ridicate de Pkd1 (boală polichistică de rinichi 1) au fost detectate în rinichii ADPKD (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple) pacienţi. Pentru a determina dacă Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)câștigul funcției poate fi un proces patogenetic, un cromozom artificial bacterian Pkd1 (Pkd1-BAC) a fost modificat prin recombinare omoloagă pentru a viza exclusiv o expresie susținută a Pkd1, în mod preferabil rinichiului adult. Au fost generate mai multe linii transgenice care au supraexprimat în mod specific Transgena Pkdl în rinichi 2- până la 15-pliază peste nivelurile endogene Pkd1. Toți șoarecii transgenici au dezvoltat reproductibil costuri tubulare și glomerulare și insuficiență renală și au murit din cauza insuficienței renale. Acest model demonstrează că supraexprimarea Pkd1 de tip sălbatic este suficientă pentru a declanșa cistogenie asemănătoare ADPKD umană (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple). Rezultatele noastre au descoperit, de asemenea, o creștere uimitoare a expresiei renale a c-myc la șoareci din toate liniile transgenice, ceea ce indică faptul că c-myc este un efector critic in vivo în aval al Pkd1.(boală polichistică de rinichi 1)molecular Dathwavs, Acest studiu nu numai că a produs o primă și neprețuită PKD(boala de rinichi cu chisturi multiple)model pentru a evalua patogeneza moleculară și terapiile, dar oferă, de asemenea, dovezi că câștigul de funcție ar putea fi un mecanism patogenetic în ADPKD (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple).

Faceți clic pe Cistanche pentru boală de rinichi

Autozomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple(ADPKD) este una dintre cele mai frecvente boli genetice la om. Se caracterizează prin dezvoltarea progresivă a multiplelor chisturi renale care afectează toate segmentele nefronului. Alte manifestări includ formarea de chisturi în ficat și pancreas, precum și anevrisme intracraniene și defecte cardiovasculare. ADPKD (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple)duce de obicei la insuficiență renală cu progresie către boală renală în stadiu terminal până la vârsta mijlocie târzie.

Aproximativ 85% din ADPKD (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple)cazurile sunt asociate cu mutații în PKD1(boală polichistică de rinichi 1)gena. Acest PKD1(boală polichistică de rinichi 1)gena este mare, se întinde pe 54 kb și constă din 46 de exoni. Acesta generează o transcriere de 14.2-kb și codifică un 4., o 302-proteină aminoacid numită policistina-1(4, 9-11). Expresia PKD1 umană și a policistinei-1 au fost analizate în condiții normale și ADPKD (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple)rinichi. În timpul dezvoltării renale, policistina-1 este ușor detectată în celulele epiteliale glomerulare și tubulare (revizuite în referința 37 și referințele din aceasta). La adulții normali, noi și alții am demonstrat că PKD1(boală polichistică de rinichi 1)ARN-ul și proteina sunt exprimate la niveluri moderate până la scăzute în tubii colectori și distali, în timp ce nivelurile au crescut (de ~2-ori) în ADPKD (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple)rinichi (22, 39). În mod interesant, expresia persistentă sau îmbunătățită a policistinei-1 este detectată în majoritatea chisturilor epiteliale renale, deși colorarea a fost absentă într-o minoritate semnificativă de chisturi(29). Pe lângă rinichi, PKD1(boală polichistică de rinichi 1)expresia este în mod normal răspândită în alte țesuturi adulte, inclusiv tipuri de celule epiteliale și nonepiteliale (6,14,18,29,30,39).

Peste 200 de PKD1 diferite(boală polichistică de rinichi 1)au fost descrise mutații, dintre care majoritatea sunt mutații cu ștergere-inserție, deplasare de cadre sau mutații nonsens. Se preconizează că acestea vor avea ca rezultat forme trunchiate ale proteinei, în concordanță cu inactivarea unei alele.

Cu toate acestea, o proporție semnificativă este un missense sau mutații în cadru care se găsesc în întreaga genă și sunt adesea unice pentru o anumită familie (33, 34). După cum sugerează și numele, ADPKD (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple)este dominantă și PKD1 mutant transmis(boală polichistică de rinichi 1)alela este suficientă pentru a produce boala. Cu toate acestea, natura focală a chisturilor renale în ADPKD (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple)sugerează că mecanismul mutațional pentru PKD1(boală polichistică de rinichi 1)ar putea fi o lovitură de două ori o pierdere a heterozigozității. Sprijinul pentru acest mecanism a fost obținut prin detectarea PKD1(boală polichistică de rinichi 1)mutații somatice clonale în celule dintr-o proporție semnificativă de chisturi (3, 21, 32). Un mecanism de pierdere a heterozigozității ar putea explica fenotipul foarte variat observat în mod obișnuit în familiile individuale.

Studii asupra șoarecelui Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)gena poate oferi informații valoroase asupra funcției (funcțiilor) PKD1 din cauza asemănării strânse dintre gena umană și murină și produsul genetic. În dezvoltarea normală, Pkd1 murină este exprimată la niveluri ridicate din stadiul de morula și este detectată în toți derivații de celule ale crestei neurale. inclusiv creierul adult, arcul aortic, cartilajul și condensarea mezenchimală (16, 17). S-a raportat că șoarecii mutanți homozigoți vizați pentru deleția Pkd1 mor în utero și dezvoltă chisturi renale și pancreatice (2,19,24-26, 40). Aceste încercări anterioare de a genera modele de șoareci, din păcate, nu au furnizat animale viabile postnatal. Cu toate acestea, apariția chisturilor renale la acești șoareci mutanți Pkd1 homozigoți ar fi în concordanță cu ipoteza unui mecanism mutațional cu două lovituri la oameni care implică o mutație germinativă și inactivarea somatică a alelei normale. Cu toate acestea, șoarecii heterozigoți pentru ștergerea țintită Pkd1 au prezentat, de asemenea, PKD cu chisturi hepatice și pancreatice ocazionale, în ciuda debutului tardiv la adulți, susținând un mecanism de haploinsuficiență sau reducerea dozei genelor. Mai mult, este posibil ca pierderea heterozigozității sau a haploinsuficienței să nu fie singurul mecanism pentru ADPKD (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple)patogeneza. Într-adevăr, aceste mecanisme sunt în contradicție cu expresia persistentă sau îmbunătățită a PKD1(boală polichistică de rinichi 1)observat în majoritatea chisturilor renale umane, cu excepția cazului în care sunt produse proteine ​​nefuncționale. Această constatare a exprimării susținute sau crescute a PKD1 ridică întrebarea dacă un câștig de funcție sau supraexpresie poate fi operant. Pentru a investiga mecanismul patogenetic de creștere a funcției Pkd1, am izolat și caracterizat un cromozom artificial bacterian Pkd1 murin (Pkd1-BAC) care a fost modificat ulterior prin recombinare omoloagă în Escherichia coli pentru a ținti expresia Pkd1.(boală polichistică de rinichi 1)în special la rinichi. Raportăm producția a trei linii transgenice care au exprimat transgena Pkd1 la niveluri diferite. Toți șoarecii au prezentat în mod reproductibil o serie de asemănări cu ADPKD umană și au dezvoltat în mod constant debut precoce cu progresia rapidă a modificărilor morfologice și funcționale renale și au murit din cauza insuficienței renale până la vârsta mijlocie. În plus, studiul actual descrie un mecanism in vivo prin care Pkd1 poate media acest fenotip PKD. Acești șoareci reprezintă primul model de PKD produs de singura supraexpresie renală a PKD1 ortolog.(boală polichistică de rinichi 1)gena.

MATERIALE ȘI METODE

Izolarea clonelor BAC care conțin Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)locus. Clonele Pkd1-BAC din tulpina gazdă bacteriană E. coli DH10B (RecA; RecBC) au fost izolate dintr-o bibliotecă pBelo11BAC de șoarece 129Sv (Research Genetics). Screening-ul super pool-urilor de BAC a fost efectuat prin PCR cu următorii primeri: 5 regiuni, 5-CTG ATGAGTTCTGGCCATGGATG-3 (exonul 1 Pkd1 direct) și 5-CTGCCA GCCAATGCCATAGTCAC-3 (invers. Pkd1 exonul 1); și 3 regiuni, 5-TCG GCCCTAGCGCTGCAGCC-3 (exonul 39 Pkd1 direct) și 5-TCCAGTCC CACCTACAGCCAAC-3 (exonul 40 Pkd1 invers). O clonă pozitivă pentru ambele amplificare a fost identificată și analizată pe gel standard și electroforeză pe gel în câmp pulsat (PFGE) urmată de Southern blot. Pentru analiza Southern blot, au fost proiectate șapte sonde Pkd1 de șoarece: exonul genomic 1 (516 bp; nucleotide [nt] 1 până la 516; numărul de acces NCBI U70209), exonul genomic 2-3 (220 bp), exonul genomic {{ 31}} (8479 bp), exon ADNc 15-20 (1724 bp; nt 6455 până la 8179), exon ADNc 25-34 (1315 bp; nt 9415 până la 10730), exon ADNc 36-45 ( 1.655 bp; nt 10963 până la 12618) și exonul genomic 45-46 (1.640 bp) (16). Mai multe regiuni, inclusiv extremitățile de inserție BAC ale acestui Pkd1-BAC murin, au fost, de asemenea, secvențiate și s-a confirmat că sunt ortologe cu gena PKD1 umană și regiunile adiacente.

REZULTATE

Producția de SBPkdl(boală polichistică de rinichi 1) rAc-BAC prin recombinare omoloagă. Pentru a determina dacă câștigul funcției Pkd1 singur este suficient pentru a produce ADPKD (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple)fenotip, am izolat mai întâi o clonă genomică care conține întreaga genă Pkdl într-o bibliotecă de vector BAC 129/Sv. Această bibliotecă a fost analizată prin PCR cu două seturi de primeri pentru gena Pkd1 care s-a întins pe exonul 1 la capătul 5’ și exonii 39 până la 40 spre capătul 3’ (Fig.1). A fost identificată o clonă BAC pozitivă pentru gena Pkd1 care a inclus întregul corp al genei Tsc2 adiacent. Inserția Pkd1 a fost caracterizată în detaliu pentru a se asigura că structura genomică se potrivește cu cea a Pkd1 endogen.(boală polichistică de rinichi 1)gena tulpinii de șoarece 129/Sv din care a derivat insertul și din tulpina consangvină C57BL/6J. Hărțile genomice ale locusului Pkd1 din BAC și din aceste tulpini consangvinizate prin analiză Southern blot, cu patru digestii cu enzime de restricție și șapte sonde care acoperă întreaga genă Pkdl, au apărut identice fără nicio dovadă de rearanjare (Fig. 1). Acest BAC conținea o inserție de ~121-kb incluzând-37 kb de secvență în amonte și -39 kb dintr-o secvență în aval a Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)genă determinată prin electroforeză și secvențiere.

Această clonă Pkd1-BAC a fost modificată de două evenimente succesive de recombinare omoloagă în E.coli. Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)gena a fost marcată în exonul 10 prin substituirea unei nucleotide (G la A) pentru a crea un nou situs EcoRI la poziţia 2355 pe harta cADN. Această mutație punctuală tăcută a fost produsă pentru a distinge Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)gena și transcrierea BAC din cea de origine endogenă. În plus, am înlocuit elementele de reglare 5' ale genei Pkd1-BAC, profitând de elementele specifice epiteliului renal „SB” identificate anterior din SBM (legat de c-Myc) sau SBF legat de c- fos)construct-trans-gena pentru a restrânge expresia la rinichi (36,38)(Fig. 2a).

Acest nou SBPkd1TAc-BAC a fost digerat cu Notl, un sit unic situat imediat în amonte de elementele SB și ClaI în corpul genei Tsc2, trunchiând elementele de reglare Tsc2 și jumătatea 5' a corpului genei pentru a asigura lipsa expresiei exogene a Tsc2. în toate țesuturile și pentru a elimina secvențele BACvector procariote (Fig.1 și 2). Acest fragment liniarizat de 70-kb Notl-Clal a fost izolat, purificat și cuantificat pentru microinjecția de ovocite (36).

Producerea și analiza șoarecilor transgenici SBPkd1rAc. Patru fondatori transgenici care poartă mai multe copii ale transgenei SBPkd1rAc au dezvoltat constant PKD(boala de rinichi cu chisturi multiple). Din cei patru șoareci fondatori SBPkdlrAc determinați prin analiza Southern, au fost stabilite trei linii transgenice SBPkd1rAG cu două până la nouă copii ale transgenei (Fig. 2b). Caracterizarea integrității transgenei în aceste linii a fost monitorizată cu sonde 5', interne și 3' așa cum se arată prin exemplele reprezentative din Fig. 2b. Liniile transgenice au dezvăluit cu sonda 5'"SB" o bandă la 10,9 kb compatibilă cu trans-gena SBPkd1rAc care este integrată într-o orientare cap la coadă și dezvăluită cu sonda 3' o bandă de 7.1-kb (Fig. 2b). În plus, sonda internă a detectat banda Pkd1 endogenă de 9,4-kb, precum și benzile de 6,9-kb și 2,5-kb ale transgenei datorită situsului de inserție EcoRI în exonul 10 (Fig. 2b). Acești șoareci au conținut copii complete ale transgenei bazate pe analiza structurii genomice suprapuse.

Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)câștig de funcție la șoarecii transgenici SBPkdlrAc adulți. Exprimarea transgenei SBPkdlrAG și a genei Pkd1 a fost investigată în diferite organe. Cuantificarea nivelurilor de transcriere din transgenă și/sau gena endogenă a fost efectuată prin analiza Northern blot (Fig. 3a). După cum era de așteptat, transgenele și transcriptele genei endogene au avut lungime similară (14,2 kb). Pe baza expresiei GAPDH de control, rinichii din toate liniile de șoarece SBPkd1TAG au crescut constant expresia transcriptului în comparație cu nivelurile normale de Pkdl la rinichii adulți (n=3) de vârstă similară. Transgena renală și expresia endogenă pentru diferitele linii transgenice au afișat un interval de 2- până la 15-ori peste nivelurile de control Pkd1 endogen renal (Fig. 3a). În special, linia transgenică 39 (n {{11} }) a arătat Pkd1 mai mare(boală polichistică de rinichi 1)niveluri decât liniile 3(n=3) și 41 (n =4). În plus, nivelurile de expresie Pkd1 măsurate prin analiza Northern blot s-au corelat cu cele obținute prin PCR în timp real folosind primeri în exonii 1 și 2 (Fig. 3b).

Cuantificarea nivelurilor de expresie a transgenei în mod specific a fost efectuată prin PCR în timp real și RT-PCR semicantitativă în cele trei linii transgenice la vârsta adultă prin utilizarea primerilor în regiunea 5' netradusă (promotorul B, -globină) și în exonul 2 al Pkd1.(boală polichistică de rinichi 1)(Fig.3b). Expresia SBPkdlrAc la șoarecii transgenici a fost comparată cu produsul genei proteinei ribozomale S16 ca standard intern. Condițiile utilizate pentru amplificarea semicantitativă RT-PCR au fost în intervalul liniar. Expresia transgenei prin PCR în timp real și RT-PCR semicantitativă au arătat în mod constant și specific cea mai mare expresie în rinichi dintre toate liniile transgenice în raport cu alte organe (Fig. 3b și c). Nivelurile de expresie renală pentru o probă individuală au fost reproductibile cu oricare dintre tehnicile de detectare utilizate. Cele mai înalte niveluri de Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)expresia renală transgenă a fost măsurată pentru liniile 39 și 41. Pentru a monitoriza dacă Pkd1 a crescut(boală polichistică de rinichi 1)expresia rezultată din transgenă sau gena endogenă, același grup de șoareci din cele trei linii transgenice a fost comparat pentru expresia transgenei Pkd1 renală și pentru exprimarea totală a Pkd1 renală (transgenă și endogenă) prin PCR în timp real. În mod interesant, liniile 39 și 41 în raport cu linia 3 au arătat că expresia renală crescută a transgenei Pkdl a fost similară sau peste cea a expresiei renale totale Pkd1, indicând transgena ca fiind responsabilă în mod specific pentru această expresie indusă. În diferite organe (inclusiv inimă, plămâni, creier, ficat, pancreas și splină), transgena SBPkd1rAg a prezentat o expresie foarte slabă detectată ocazional în splină și plămân, cu o expresie mică până la nedetectabilă în alte organe (Fig. 3b). Cuantificarea prin PCR în timp real a demonstrat un nivel de 10- până la un nivel de 1,000-ori mai mic al expresiei transgenei în țesuturile extrarenale în raport cu expresia renală (Fig. 3c). Elementele reglatoare „SB” ale transgenei SBPkdlrA au conferit expresie renală preferenţială; această distribuție specială de organ a fost, de asemenea, determinată atunci când a fost utilizată în transgenele legate de c-myc (SBM) și c-fos (SBF) (36, 38).

C-myc, un efector în aval al Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)căi de semnalizare la șoarecii SBPkdlrAc. Pentru a obține o perspectivă asupra mecanismului patogenetic intracelular al șoarecilor transgenici SBPkdlrAg, am căutat apoi să monitorizăm nivelul expresiei renale c-myc pe baza observației noastre anterioare a dereglării c-myc în ADPKD umană. (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple)rinichi (22). Analiza rinichilor a fost efectuată din toate cele trei linii transgenice 3 (n =4), 39 (n =7) și 41 (n=4), precum și martori (n=4). După cum se arată în Fig.3d, există o expresie substanțială a c-myc endogen indusă la șoarecii SBPkd1TAG în raport cu șoarecii de control de vârstă similară. Interesant este nivelul expresiei c-myc în unii rinichi SBPkd1-c. în special linia 39, a atins niveluri comparabile cu cele observate în modelul de șoarece transgenic PKD SBM produs prin expresia renală a c-myc.

Anomalii renale la șoarecii SBPkd1raG similare cu PKD(boala de rinichi cu chisturi multiple). To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size(Fig.4a and b). SBPkdl-AG kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n =25;n>6 pentru fiecare linie) a dezvoltat mai multe chisturi tubulare (T) și glomerulare (G) (Fig. 4d, f și g). Au fost observate chisturi în tubii din regiunile corticale și medulare, precum și tubuli colectori din papilă (Fig. 4d și e). Șoarecii transgenici au prezentat hiperplazie epitelială tubulară (vârf de săgeată) care implică atât tubuli chistici, cât și nechistici și hipertrofie frecventă (Fig. 4g și h), dar severitatea a variat între șoareci individuali. Au fost observate frecvent fibroză interstițială (F), infiltrate limfoide perivasculare și gipsuri proteice (P) (Fig. 4d și e).

Pentru a defini mai precis locul de localizare al Pkd1 crescut(boală polichistică de rinichi 1)expresia în rinichi, am efectuat hibridizarea in situ folosind sonda exon 36-45 utilizată anterior(16). Semnalul de hibridizare a fost localizat în mod specific la celulele epiteliale care căptușesc chistul și tubii hiperplazici, precum și chisturile glomerulare. În plus, s-a observat un anumit semnal peste epiteliul tubilor nechistici sau ușor dilatați, probabil identificând tubuli predestinați să sufere modificări chistice viitoare (Fig. 4i și j).

Analiza histologică renală a fost efectuată și pe șoareci transgenici la naștere (n =8), ziua postnatală 10 (P10) (n =3), P20 (n =5), P35 (n {{ {7}}), și P45(n=3) în comparație cu colegii negativi din aceeași grupă de vârstă (n 2 până la 4). În mod interesant, toți șoarecii transgenici nou-născuți au prezentat dilatare tubulară și glomerulară în raport cu toți cei negativi de control (Fig. 4k și l), indicând faptul că anomaliile renale au fost inițiate in utero așa cum s-a observat la șoarecii SBM și în ADPKD. (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple)pacientii. Dilatația tubulară și glomerulară a crescut în dimensiune și număr odată cu vârsta progresivă. Până la P35, șoarecii transgenici au prezentat hiperplazie mai severă și dovezi de glomeruloscleroză. Funcții fiziologice renale alterate la șoarecii SBPkd1TAG. Funcțiile fiziologice renale ale tuturor șoarecilor transgenici au prezentat caracteristici similare cu PKD(boala de rinichi cu chisturi multiple), în timp ce tovarășii netransgenici nu au dezvoltat niciodată boala. La câteva luni de la naștere, animalele afectate au dezvoltat insuficiență renală cronică. Aceste animale au fost monitorizate pentru parametrii funcționali renali prin măsurarea nivelurilor serice și urinare, azotului ureic din sânge (BUN) și creatininei, osmolalitatea urinei, proteinele urinei și excreția de ioni (Tabelul 1). Toți șoarecii din cele trei linii, în comparație cu martorii, au prezentat defecte de concentrare, o constatare comună în ADPKD și, în consecință, au prezentat o scădere a concentrațiilor urinare de BUN, creatinină, proteine ​​și fier. Fondatorii și descendenții transgenici SBPkd1TAG (n 6) din fiecare linie au fost monitorizați calitativ pentru proteinurie pe probe de urină prin SDS-PAGE (Fig. 5). Șoarecii cu vârsta mai mare de 2 luni au prezentat proteinurie neselectivă care a progresat odată cu vârsta. În plus, nivelurile serice ale BUN și ale creatininei serice au fost crescute, dezvăluind insuficiență renală (Tabelul 2). Deoarece insuficiența renală cronică duce în mod obișnuit la modificări ale parametrilor hematologici, aceștia au fost examinați la șoareci transgenici SBPkd1TAG cu vârsta cuprinsă între 3 și 14 luni (Tabelul 2). Acești șoareci transgenici au fost anemici, așa cum demonstrează scăderea semnificativă a numărului de celule roșii din sânge, hemoglobina și hematocritul atingând jumătate din nivelurile normale. Alți parametri de celule roșii din sânge, cum ar fi procentul de reticulocite, nu au fost afectați, așa cum era de așteptat atunci când au fost induși de un defect renal. Aceste animale au murit în mod constant din cauza insuficienței renale la vârsta de 5,9  2,8 luni (n 42) pentru linia transgenică 39 și la vârste mai târziu, 14,6 3,1 luni (n 20) și 11 .7 6.5 luni (n 7), pentru rândurile 3 și, respectiv, 41.

FIG. 1. Reprezentarea schematică și analiza detaliată a hărții de restricție a unui Pkd1-BAC murin.

Modele de digestie a ADN-ului genomic ale Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)-BAC au fost comparate cu cele ale Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)locus în tulpinile de șoarece consangvinizate 129Sv și C57Bl/6J. Au fost produse șapte sonde care cuprind cea mai mare parte a genei murine Pkd1:

(a) exonul 1, (b) exonul 2-3, (c) exonul 7-15, (d) exonul 15-20, (e) exonul 25-34, (f ) exonul 36-45 și (g) exonul 45-46, etichetat de la a la g pe Pkd1 genomic(boală polichistică de rinichi 1)reprezentare și peste petele individuale.

Analiza Southern blot în urma digerărilor de restricție (BamHI, EcoRI, HindIII și KpnI) ale ADN-ului genomic din Pkd1-BAC și Pkd1 murin(boală polichistică de rinichi 1)loci au prezentat modele identice cu toate cele șapte sonde. M, marker HindIII; 129, 129/Sv; C57, C57Bl/6J.

DISCUŢIE

Aici, raportăm izolarea și caracterizarea unui Pkd1-BAC murin. Acest Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)gena a fost marcată și elementele de reglare au fost înlocuite pentru a viza expresia în mod specific la rinichi prin două evenimente succesive de recombinare omoloagă. Șoarecii transgenici produși cu această nouă genă SBPkd1TAG au prezentat o creștere de 2- până la 15-ori a expresiei Pkd1 și au dezvoltat reproductibil modificări morfologice renale timpurii tipice PKD. Insuficiența renală este evidentă la vârsta mijlocie, iar șoarecii mor prematur din cauza insuficienței renale. Rezultatele noastre indică, de asemenea, că mecanismul de supraexpresie Pkd1 responsabil pentru acest fenotip este mediat de activarea semnalizării c-myc in vivo. Acest studiu demonstrează că creșterea funcției murine a Pkd1 în rinichi este suficientă pentru a produce un fenotip renal PKD. Deoarece gena Pkd1 murină nu este duplicată așa cum este la om (27), am identificat și izolat direct o clonă BAC care conținea întreaga genă Pkd1. Caracterizarea completă a Pkd1-BAC murin 129/Sv, comparația indirectă cu alte două tulpini de șoarece consangvinizate, a confirmat integritatea locusului Pkd1. Inserarea Pkd1-BAC conținea 37 până la 39 kb de secvențe în amonte și în aval din gena Pkd1. Analiza noastră a demonstrat că gena Pkd1 din acest BAC a fost un locus de tip sălbatic murin de bună credință care ar putea servi pentru studii ulterioare. Deși există dovezi puternice că formarea chistului în ADPKD (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple)poate rezulta din pierderea heterozigozității în urma inactivării somatice a PKD1 normală(boală polichistică de rinichi 1)alela (3, 21, 32), există, de asemenea, dovezi sugestive pentru expresia susținută sau chiar crescută a policistinei-1 în epiteliul tubular chistic (22, 29). Ultima observație ridică întrebarea dacă supraexprimarea Pkd1 în sine este o cauză suficientă imediată a cistogenezei. La șoarecii transgenici care poartă PKD1 uman(boală polichistică de rinichi 1), TSC2, RAB 26, NTHL1 și SLC9A3R2, doar o minoritate de șoareci au dezvoltat chisturi și niciunul nu a avut expresie transgenică detectabilă la vârsta adultă, în ciuda a 30 de copii ale transgenei (31). La acei șoareci transgenici, a fost dificil să se stabilească un rol clar pentru supraexpresia Pkd1 în cistogenie. Modelul nostru diferă, deoarece două până la nouă copii de tip sălbatic ale Pkd1 singure, fără gene adiacente, au fost integrate la șoarecii transgenici. Deoarece gena Pkd1 are funcții esențiale în diferite organe sau țesuturi, așa cum este descris pentru numeroși șoareci cu ablația genei Pkd1, supraexprimarea sistemică a Pkd1 ar putea duce la efecte de confuzie suplimentare. În consecință, am abordat rolul câștigării funcției Pkd1 folosind o abordare care vizează Pkd1 în mod specific rinichilor. Prin recombinare omoloagă, am înlocuit mai întâi regiunea de reglare din amonte Pkd1 cu elementele de reglare restricționate renale „SB”, prevenind astfel scăderea expresiei genelor observată în mod normal pentru Pkd1 la vârsta adultă, precum și potențiala reglare secundară a buclei de feedback (36, 38). În al doilea rând, am marcat transgena Pkd1 murină (Pkd1TAG) cu o mutație punctiformă silențioasă în exonul 10, dar nu am inserat o etichetă epitop pentru a ne asigura că va fi produsă o proteină „de tip sălbatic” complet funcțională, cu structură și integritate conservată. Din acest BAC modificat, un fragment SBPkd1TAG a fost purificat departe de gena Tsc2 și vectorul BAC pentru a preveni interferența cu gena Tsc2, care poate induce și un fenotip chistic (8, 20, 28), precum și pentru a evita efectul inhibitor al secvențe procariote (5).

Patru șoareci fondatori transgenici SBPkd1TAG diferiți și trei linii independente au fost produse cu Pkd1 renal specific(boală polichistică de rinichi 1)-expresie sporită. Deosebit de izbitoare este penetranța completă a fenotipului la acești șoareci transgenici. Fondatorul SBPkd1TAG și liniile de șoarece au împărtășit mai multe caracteristici fiziopatologice în comun cu ADPKD (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple). Acestea includ dezvoltarea chisturilor în cortex, medular și glomeruli împreună cu hiperplazia epitelială, fibroza interstițială și inflamația interstițială focală.

Pentru că PKD(boala de rinichi cu chisturi multiple)fenotipul a fost observat în mod constant la toți diferiții șoareci fondatori transgenici, iar integrarea transgenei în genomul șoarecelui este un fenomen aleatoriu, fenotipul nu poate rezulta din efectul poziției cromozomiale, ci doar din creșterea expresiei Pkd1. Într-adevăr, s-a demonstrat că expresia transgenei Pkd1 în toate liniile este limitată renal, așa cum sa observat anterior pentru alte transgene reglate de elementele „SB” (36, 38). Mai mult, această expresie crescută a Pkd1 a fost cauzată de transgenă și nu de o activare indirectă endogenă a Pkd1. Prin urmare, rezultatele noastre oferă dovezi clare că câștigul funcției unui Pkd1 funcțional de tip sălbatic poate produce mai multe chisturi renale. Foarte important, acești șoareci SBPkd1TAG constituie primul model de șoarece generat de singura supraexprimare a ortologului de șoarece al genei PKD1 umane.

Șoarecii SBPkd1TAG demonstrează că Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)supraexprimarea este un mecanism patogenetic primar al cistogenezei renale. Este important că cele mai ridicate niveluri de expresie a transgenelor în rinichi au părut să se coreleze cu progresia și severitatea fenotipului. De asemenea, am constatat că supraexprimarea Pkd1 în dezvoltarea fenotipului SBPkd1TAG este probabil să semnaleze activarea c-myc in vivo. În mod imaginabil, această activare ar putea fi chiar directă prin coada C-terminală a policistinei-1 care suferă clivaj proteolitic și translocație nucleară (7). Deoarece exprimarea renală îmbunătățită a c-myc la șoarecii adulți s-a dovedit că induce PKD, ar fi foarte consistent să se susțină c-myc ca efector major în aval al căilor de semnalizare Pkd1. Acest rezultat s-a corelat, de asemenea, cu descoperirile noastre anterioare privind creșterea expresiei c-myc în rinichii tuturor ADPKD umane. (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple)analizat (22). În total, aceste rezultate indică faptul că c-myc este un mediator principal al Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)cistogenie. Rezultatele noastre din modelul de creștere a funcției Pkd1, împreună cu haploinsuficiența Pkd1 murină și pierderea funcției, indică faptul că orice dereglare a Pkd1 ar putea duce la cistogenie (2, 19, 23–26, 31, 40).

Pkd1 severă(boală polichistică de rinichi 1)dezechilibru la șoareci indus de Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)ablația sau supraexpresia transgenică au determinat debutul precoce și progresia rapidă a chisturilor renale și au afectat o proporție mare de tubuli. În schimb, un dezechilibru mai ușor de Pkd1, cum ar fi haploinsuficiența, a condus la o progresie mai lentă a PKD cu mai multe chisturi focale. Dezvoltarea paradoxală aparentă a unui fenotip similar prin dereglarea opusă a policistinei-1 ar putea fi explicată prin rezultatul comun, și anume un dezechilibru relativ al concentrației proteice care ar putea altera formarea sau funcția unui complex multiproteic de policistine activ. Luate împreună, rezultatele noastre și cele ale altor investigatori susțin că mecanismul de formare a chistului în ADPKD (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple)este probabil să apară din trei mecanisme patogenetice: creșterea funcției, pierderea funcției și efectele dozării genelor. Noii șoareci SBPkd1TAG constituie un model puternic de cistogenie renală care poate oferi perspective majore asupra patofiziologiei PKD(boala de rinichi cu chisturi multiple), Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)căile de transducție a semnalului și partenerii care interacționează. Studiul acestui model poate duce, de asemenea, la dezvoltarea de noi strategii terapeutice pentru a restabili echilibrul proteic normal în cadrul complexului multimeric Pkd1.

REFERINȚE

1. Blouin, MJ, H.Beauchemin, A.Wright, MEDe Paepe, M.Sorette, A.-M. Bleau.B. Nakamoto. C.-N, Ou, G. Stamatovannopoulos și M. Trudel 2000. Corecția genetică a bolii cu celule falciforme: perspective folosind modele de șoarece transgenic. Nat. Med. 6:177-182.

2. Boulter, C., S.Mulroy, S.Webb, S. Fleming, K. Brindle și R. Sandford. 2001. Defecte cardiovasculare, scheletice și renale la șoareci cu o întrerupere țintită a Pkd1(boală polichistică de rinichi 1)genă.Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 98:12174-12179.

3. Brasier, JL și EPHenske.1997.Loss of theboala de rinichi cu chisturi multipleRegiunea (PKD1) a cromozomului 16p13 din celulele chistului renal susține un model de pierdere a funcției pentru patogeneza chistului. J. Clin. Investig.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connors, WRDackowski, LRPetry, TJVan Raay, JM Millholland, M. Venet, G.Miller, RM Hakim, GMLandes, KW Klinger, F. Qian, LF Onuchic, T.Watnick, GG Germino și NA Doggett.1995.Analiza secvenței genomice pentruautosomal dominant boala de rinichi cu chisturi multipleGena (PKD1) prezice prezența unei repetări bogate în leucină. Zumzet. Mol. Genet.4:575-582.

5.Chada,K, J.Magram, K. Raphael,G.Radice, E.Lacy, and F.Costantini.1985. Expresia specifică a unei gene de globină străină în celulele eritroide ale șoarecilor transgenici. Natura 314:377-380.

6. Chauvet, V, F. Qian, N. Boute, Y. Cai, B.Phakdeekitacharoen, LF Onuchic, T.Attie-Bitach, L.Guicharnaud, O.Devuyst,GG Germino și M.-C. Gubler.2002. Expresia PKD1(boală polichistică de rinichi 1)și PKD2(boală polichistică de rinichi 2)transcrieri și proteine ​​în embrionul uman și în timpul dezvoltării normale a rinichilor. A.m. J. Pathol 160:973-983.

7.Chauvet, V., X. Tian, ​​H.Husson, DHGrimm,T.Wang, T.Hiesberger, P. Igarashi, AM Bennett, O. Ibraghimov-Beskrovnava, S. Somlo, and MJ Caplan.2004. Stimulii mecanici induc clivajul și translocarea nucleară a policistinei-1 C-terminal. J. Clin. Investig. 114:1433-1443.

8. Cheadle, JPMP Reeve, JR Sampson și DJ Kwiatkowski.2000. Progrese genetice moleculare în scleroza tuberoasă. Zumzet. Genet.107:97-114. 9. Consorțiu, EPKD1993.Identificarea și caracterizarea genei sclerozei tuberoase pe cromozomul 16. Celula 75:1305-1315.

10. Consorțiu, EPKD1994. Gena bolii polichistice renale 1 codifică o transcriere de 14 kb și se află într-o regiune duplicată pe cromozomul 16. Celula 77:881-894.

11. Consorțiu, IPKD1995. Boala polichistică de rinichi: structura completă a PKD1(boală polichistică de rinichi 1)gena și proteina acesteia. Celula 81:289-298.

12.Couillard, M., R. Guillaume,N. Tanji, V. DAgati, and M. Trudel.2002. Apoptoza indusă de c-myc în boala polichistică de rinichi este independentă de interacțiunea FasL Fas. Cancer Res. 62:2210-2214.

13. De Paepe, ME, and M. Trudel.1994. Șoarecele transgenic SAD: un model de glomerulopatie cu celule secera umane. Rinichi Int. 46:1337-1345.

14. Geng, L., Y. Segal, B.Peissel, N.Deng, Y. Pei,F. Carone, HGRennke, AM Glücksmann-Kuis, MC Schneider, M. Ericsson, STReeders și J.Zhou. 1996.Identificarea și localizarea policistinei, PKD1(boală polichistică de rinichi 1)produs genetic. J. Clin. Investig. 98:2674-2682.

15. Gong, S., XWYang, C. Li și N.Heintz.2002. Modificarea foarte eficientă a cromozomilor artificiali bacterieni (BAC) folosind noi vectori navetă care conțin originea R6Ky a replicării. Genom Res. 12;1992-1998.