Starea actuală a neuroprotecției în bolile cardiace congenitale Partea 2

Imaginile microscopice au fost apoi supuse calculului imaginii folosind software-ul ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, SUA). Semnalul lui Hsp60 a fost înmulțit cu „x”.

Hsp60 este o moleculă proteică importantă care joacă un rol biologic important în corpul uman. Cercetările din ultimii ani au arătat că prezența Hsp60 este strâns legată de memoria umană.

Hsp60 este o proteină însoțitoare moleculară care este implicată în principal în plierea, desfășurarea, stabilizarea și degradarea proteinelor. Aceste procese sunt foarte importante pentru metabolismul normal și funcția celulară a corpului uman. În același timp, Hsp60 are, de asemenea, efecte antioxidante, antiinflamatorii și imunomodulatoare și joacă un rol important în menținerea sănătății umane și a echilibrului sistemului imunitar.

Cercetările au descoperit că Hsp60 joacă un rol crucial în formarea și întreținerea memoriei. În timpul procesului de învățare și memorie, celulele creierului produc un număr mare de molecule Hsp60. Aceste molecule pot proteja celulele de interferențe și daune din mediul extern pentru a asigura progresul lin al învățării și al memoriei. În plus, Hsp60 poate afecta, de asemenea, gândirea și comportamentul uman prin modificarea transducției semnalului celulelor creierului și dezvoltarea neuronilor și are un impact pozitiv asupra cogniției și rezistenței la stres.

Deși rolul Hsp60 a arătat efecte pozitive asupra organismului uman, oamenii trebuie, de asemenea, să realizeze că atât excesul, cât și deficiența Hsp60 pot avea efecte negative asupra sănătății umane. Prin urmare, ar trebui să explorăm și să studiem în mod activ mecanismul Hsp60 în diferite condiții fiziologice și patologice ale corpului uman pentru a înțelege mai bine poziția și rolul Hsp60 în sănătatea umană. Se poate observa că trebuie să îmbunătățim memoria, iar Cistanche deserticola poate îmbunătăți semnificativ memoria, deoarece Cistanche deserticola are efecte antioxidante, antiinflamatorii și anti-îmbătrânire, care pot ajuta la reducerea oxidarii și a reacțiilor inflamatorii din creier, protejând astfel sănătatea sistemului nervos. În plus, Cistanche deserticola poate promova, de asemenea, creșterea și repararea celulelor nervoase, sporind astfel conectivitatea și funcția rețelelor neuronale. Aceste efecte pot ajuta la îmbunătățirea memoriei, a capacității de învățare și a vitezei de gândire și pot preveni, de asemenea, dezvoltarea disfuncției cognitive și a bolilor neurodegenerative.

Faceți clic pe Cunoaștere pentru a îmbunătăți memoria pe termen scurt

Valoarea „x” a fost determinată după cum urmează: scăderea semnalului Hsp60 pliat cu „x” din semnalul ADN mitocondrial în grupul de control a făcut ca valoarea ADN mitocondrial să fie mai mică sau egală cu zero. Semnalul histonei H2B a fost înmulțit cu „y”.

Valoarea „y” a fost determinată după cum urmează: scăderea semnalului histon-H2B pliat „y” din semnalul ADN-nuclear din grupul de control a făcut ca valoarea ADN-ului nuclear să fie mai mică decât sau egală cu zero. Dacă semnalul de fundal devine ridicat de la multiplicare, contrastul imaginii multiplicate poate fi ajustat pentru aceleași condiții în toate probele.

Pentru analiza ulterioară a fost utilizată imaginea colorării ADNdd, minus imaginea ajustată a Hsp60 înmulțit și a histonei H2B. Folosind funcția „Adjust-Threshold”, aceste imagini au fost binarizate. Am selectat dsDNA puncta cu dimensiunea cuprinsă între 2 și 20 µm2 (circulitate 0,1–1,0) și au fost numărate utilizând funcția „Analiză-Analizează particule”.

2.3. Microscopia electronică

Cu o zi înainte de transfecție, celulele HeLa au fost placate la o densitate de 600 celule/µL. Expresia genelor de interes a fost redusă la tăcere în celulele HeLa folosind Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) în reactiv de transfecție Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) conform instrucțiunile producătorului (cu o concentrație finală de ARN de 10 nM).

La patru zile după distrugerea siRNA, celulele au fost supuse fixării. Probele de cultură celulară au fost fixate cu 2% PFA și 2% glutaraldehidă în tampon fosfat 0.1 M, pH 7,4, la 37 ◦ C, apoi plasate într-un 4. ◦C frigider pentru 30 min. Probele au fost fixate în glutaraldehidă 2% în tampon fosfat 0.1 M peste noapte la 4 ◦C. Probele au fost spălate de trei ori cu tampon fosfat 0.1 M timp de 30 de minute și post-fixate cu 2% tetroxid de osmiu în tampon fosfat 0,1 M la 4 ◦C timp de 1 oră.

Probele au fost soluții de etanol degradat deshidratat, transferate în rășină (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokyo, Japonia) și polimerizate la 60 ◦ C timp de 48 de ore. Rășinile polimerizate au fost tăiate în secțiuni ultrasubțiri 70-nm cu un cuțit de diamant utilizând un ultramicrotom (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Germania) și apoi au fost montate pe grile de cupru.

Secțiunile au fost colorate cu acetat de uranil 2% la RT timp de 15 minute și spălate cu apă distilată, urmată de colorare secundară cu o soluție de colorare cu plumb (Sigma-Aldrich, Tokyo, Japonia) la RT timp de 3 minute.

Grilele au fost observate la microscop electronic cu transmisie (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Tokyo, Japonia) la o tensiune de accelerație de 80 kV (creier de pește zebra) sau 100 kV (celulă), iar imaginile au fost înregistrate folosind o cameră CCD (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) .

2.4. Microscopia imunoelectronică

Probele de pe discurile de aur au fost congelate în propan lichid la -175 ◦C. După ce probele au fost înghețate, acestea au fost înlocuite prin congelare cu 1% acid tanic în etanol și 2% apă distilată la -80 ◦ C timp de 24 de ore.

Probele au fost apoi păstrate la -20 °C timp de 4 ore, urmate de incubare la 4 °C timp de 1 oră. Apoi, probele au fost deshidratate în etanol anhidru de 3 ori timp de 30 de minute. de fiecare dată, urmată de infiltrare cu un amestec 50:50 de rășină etanoland (LR white: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) la 4 ◦C timp de 1 oră. Probele au fost transferate în rășină proaspătă 100% și incubate la 4 °C timp de 30 de minute, iar acest proces a fost repetat de trei ori.

Probele au fost transferate în rășină proaspătă 100% și au fost polimerizate la 50 ◦CO/N. Rășinile polimerizate au fost secționate ultra-subțiri la 90 nm cu un cuțit de diamant utilizând un ultramicrotom (Ultracut UCT; Leica), iar secțiunile au fost plasate pe grile de nichel. Grilele au fost incubate cu anticorp anti-dsDNA (35I9 ADN) (1/800, Abcam, Cat # ab27156, RRID: AB_470907) în 1% BSA/PBS la 4 ◦CO/N, urmate de trei clătiri cu 1% BSA/PBS timp de 1 minut fiecare.

Ulterior, au fost incubați cu anticorpul secundar conjugat la particule de aur de {{{0}}nm (anticorp policlonal IgG de capră anti-șoarece) timp de 2 ore la temperatura camerei. După clătire cu PBS, grilele au fost plasate în 2% glutaraldehideină 0,1 M cacodilat tampon.

După aceea, grilele au fost uscate și apoi colorate cu 2% acetat de uranil timp de 15 minute și cu o soluție de colorare de plumb (Sigma-Aldrich) la RT timp de 3 minute. Grilele au fost observate printr-un microscop electronic cu transmisie (JEM-1400 plus JEOLLtd.) la o tensiune de accelerare de 100 kV. Imaginile digitale au fost obținute cu o cameră CCD (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Rezultate

3.1. Scăderea TFAM sau GBA induce o creștere a ADN-ului mitocondrial ectopic

În primul rând, am arătat un exemplu de detectare a ADN-ului citoplasmic derivat din mitocondrii în celulele HeLa în care proteina TFAM a fost doborâtă de ARNsi (Figura 1A). TFAM este un factor cheie de transcripție mitocondrială și funcționează, de asemenea, în replicarea și repararea ADN-ului mitocondrial [20] .

Polimorfismele de secvență din această genă sunt raportate a fi asociate cu boala Parkinson [21,22]. După 3 zile de distrugere a proteinei TFAM, au fost detectate o mulțime de puncte ADN dublu catenar în citoplasma celulelor HeLa.

Histonele sunt markeri pozitivi pentru ADN-ul de origine nucleară în citoplasmă și markeri negativi pentru ADN-ul mitocondrial și ADN-ul de origine mitocondrială în citoplasmă [23]. Aceste puncte nu s-au co-localizat cu histonele, sugerând că nu au fost ADN derivat din nucleu. În plus, unele dintre aceste puncte de ADN citoplasmatice, ectopice, nu s-au co-localizat cu Hsp60, un marker pentru matricea mitocondrială, ceea ce indică faptul că se află în afara mitocondriilor (Figura 1B, C).

Microscopia electronică a arătat, de asemenea, că ADN-ul ectopic a scurs din mitocondrii (Figura 2A, B). În rezumat, creșterea punctelor ADN ectopice în citoplasmă prin distrugerea TFAM sa datorat scurgerii de ADN mitocondrial din mitocondrii. În al doilea rând, am arătat un alt exemplu de detectare a ADN-ului citoplasmatic derivat din mitocondrii în celulele HeLa în care proteina GBA a fost doborâtă de siRNA. (Figura 1A).

GBA este gena cauzală pentru boala Gaucher, dar o mutație heterozigotă a GBA este, de asemenea, un factor de risc pentru boala Parkinson [24]. O mulțime de puncte de ADN dublu catenar au fost detectate în citoplasma celulelor HeLa după 3 zile de distrugere a proteinei GBA. Unele puncte de ADN au fost co-localizate cu histone, sugerând că au fost ADN derivat din nucleare.

Alte puncte ADN nu au fost co-localizate cu histonele, ceea ce sugerează că nu erau ADN derivat din nucleare, ci ADN derivat din mitocondrii (Figura 1D). În rezumat, creșterea punctelor de ADN ectopic din citoplasmă prin distrugerea GBA s-a datorat cel puțin parțial scurgerii de ADN mitocondrial din mitocondrii.

For more information:1950477648nn@gmail.com